清达颗粒下调P53信号通路抑制高血压小鼠脑微血管内皮细胞凋亡

Qingda Granules inhibit cerebral microvascular endothelial cell apoptosis in hypertensive mice by suppressing the P53 signaling pathway

摘要

目的 基于P53信号通路探讨清达颗粒 （QDG） 抑制高血压脑微血管内皮细胞凋亡的作用机制。 方法 利用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）构建高血压脑小血管病（CSVD）小鼠模型，分为Control组、AngⅡ组、AngⅡ+QDG组，6只/组，AngⅡ剂量为1000 ng/kg/min。造模后第1天开始给药，AngⅡ+QDG组给予清达颗粒（1.3 g/kg/d）灌胃，对照组和AngⅡ组给予生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃4周。每周用无创血压测量系统测量各组血压。利用HE染色观察脑微血管病理变化，免疫组化检测CD31、P53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表达；Western blotting检测Bcl-2、Bax的表达。利用氧糖剥夺再灌注（OGD/R）构建小鼠脑微血管内皮细胞 （bEnd.3） 损伤模型，将细胞分为Control组、QDG组、OGD/R组、OGD/R+QDG组。利用CCK-8确定细胞给药浓度；利用Hoechst 33342染色检测细胞凋亡，RT-qPCR检测P53、Bcl-2、Bax mRNA的表达，利用Western blotting检测P53、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表达。 结果 体内实验中，与Control组比较，AngⅡ组小鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压均升高（P<0.05），脑微血管周围间隙增大，CD31、Bcl-2的表达降低，P53、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表达升高（P<0.05）。与AngⅡ组比较，清达颗粒能降低高血压小鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压的升高（P<0.05），改善高血压小鼠脑微血管的病理损伤，升高CD31、Bcl-2的表达（P<0.05），降低P53、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表达（P<0.05）。在体外实验中，与Control组比较，OGD/R组的凋亡率升高，Bcl-2 mRNA表达降低，P53、Bax mRNA表达升高（P<0.05）；Bcl-2 蛋白表达降低，P53、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 蛋白表达升高（P<0.05）；与OGD/R组比较，清达颗粒能降低OGD/R诱导的bEnd.3细胞凋亡率，升高Bcl-2的mRNA表达，降低P53、Bax的mRNA表达（P<0.05）；升高Bcl-2的蛋白表达，降低P53、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表达（P<0.05）。 结论 清达颗粒可能通过下调P53信号通路，抑制高血压脑微血管内皮细胞凋亡。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which Qingda Granules (QDG) inhibit apoptosis of hypertensive cerebral microvascular endothelial cells. Methods Eighteen C57BL/6 mice were randomized into control group, angiotensin II (AngII) group, and Ang II+QDG group (n=6). The mice in the latter groups underwent subcutaneous implantation of a micropump for continuous infusion of Ang II (1000 ng·kg^-1·min^-1) to induce cerebral small vessel disease (CSVD) with daily gavage of saline or QDG (1.3 g/kg) for 4 weeks. Blood pressure of the mice was monitored weekly, cerebral microvascular morphology was assessed with HE staining, and the expressions of CD31, p53, cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, Bcl-2 and Bax in the brain tissues were detected with immunohistochemistry and Western blotting. In a bEnd.3 cell model of oxygen and glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R), the effects of QDG on cell viability and apoptosis were evaluated using CCK8 assay and Hoechst 33342 staining, respectively; the changes in mRNA expressions of P53, Bcl-2, and Bax and protein expressions of P53, Bcl-2, Bax, cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 were detected using RT-qPCR and Western blotting. Results Continuous infusion of Ang II resulted in significant elevation of systolic blood pressure, diastolic blood pressure, and mean arterial pressure in the mice, causing also widening of the perivascular space of the cerebral microvasculature, reduction of CD31 and Bcl-2 expressions, and increases in the expressions of p53, Bax, cleaved caspase-3, and cleaved caspase-9. All these changes were significantly mitigated by treatment with QDG. In bEnd.3 cells, QDG treatment significantly attenuated OGD/R-induced apoptosis, increased Bcl-2 expression, and decreased expressions of P53, Bax, cleaved caspase-3, and cleaved caspase-9. Conclusion QDG suppress apoptosis of cerebral microvascular endothelial cells in hypertensive rats by downregulating the P53 signaling pathway to alleviate cerebral microvascular endothelial injury caused by hypertension.

Graphical abstract

高血压作为一个全球性的重大公共卫生问题，也是我国面临的重要公共卫生问题之一，患病率高、致残率高、死亡率高，但其知晓率为51.6%，治疗率为45.8%，且控制率仅为16.8%^［1］，会导致心、脑、肾等多种靶器官损害^［2］。其中高血压引起的脑小血管病（CSVD）是高血压早期并发症，是导致脑卒中、残障和痴呆的重要因素^{［3， 4］}。及时阻滞高血压CSVD进展，能够有效降低后期发生痴呆、卒中等风险。但是目前针对高血压CSVD有效药物的研究仍十分匮乏，因此，亟需进一步寻找安全有效的新方药，为临床治疗高血压CSVD提供新的选择与思路。

高血压CSVD发病机制十分复杂，包括炎症反应、氧化应激、凋亡、自噬等过程，其中脑微血管内皮细胞凋亡在高血压CSVD的发生发展中起着重要作用^［5］。P53是一种重要的细胞应激反应的核心传感器，当细胞感受到应激信号（如DNA损伤、缺氧、氧化应激）时，P53会被激活并积聚在细胞核内，并启动凋亡程序以清除受损细胞^{［6， 7］}。高血压带来的氧化应激、缺血缺氧和DNA损伤正是激活P53的强大触发器^［8］。有研究表明缺氧等因素激活P53，P53通过调控Bcl-2家族、Caspase 家族蛋白，诱导脑微血管内皮细胞和神经元凋亡，既破坏血脑屏障引发早期脑损伤，又导致后期脑血管痉挛^［9-13］。因此，抑制P53信号通路减轻高血压所致的脑微血管内皮细胞凋亡是阻止高血压CSVD的有效手段。

针对高血压早期肝阳上亢病机，国医大师陈可冀院士创制了清达颗粒（QDG），全方由天麻、钩藤、黄芩、莲子心组成，主治高血压前期、新发1级高血压证属肝火上炎、肝阳上亢所致的头晕、头痛、烦躁、失眠等，主要功效为清肝热，泄心火，舒达肝气^［14］。本课题组前期研究证实清达颗粒具有显著的降压效果，且对高血压所致的脑损伤保护作用突出^［15］。但清达颗粒能否通过P53信号通路，减轻脑微血管内皮细胞凋亡尚未明确。因此，本研究利用AngⅡ 构建高血压CSVD小鼠模型，探讨清达颗粒是否通过下调P53信号通路，抑制高血压CSVD小鼠脑微血管内皮细胞凋亡，为其在临床上用于防治高血压CSVD提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

18只雄性SPF级C57BL/6小鼠，12周龄，购于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物饲养室［SYXK（闽）2020-0002］。所有实验动物均严格按照国际伦理准则和美国国立卫生研究院关于实验动物的护理和使用指南进行，并经福建中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批号：FJTCM IACU 2024220）。

1.1.2 实验药物与细胞

清达颗粒组成：天麻12 g，钩藤10 g，黄芩6 g，莲子心5 g，全方委托江阴天江药业有限公司制备成颗粒剂（批号：2311309），规格：5 g/袋。bEnd.3细胞株购自苏州海星生物科技有限公司（货号：CL-0598）。

1.1.3 实验仪器

CODA^TM无创血压仪（Kent Scientific）；倒置荧光显微镜（Leica）；植入式胶囊渗压泵（ALzet）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；CO₂恒温培养箱、NanoDrop2000超微量分析仪（Thermo Fisher Scientific）；LX-800酶标仪（Bio-Tek）；细胞计数仪（Countstar）；恒温金属浴（上海培清科技有限公司）；小型垂直电泳槽、小型Trans-Blot转印槽、蛋白电泳仪、全自动化学发光成像系统（Bio-Rad）。

1.1.4 实验试剂

bEnd.3细胞专用培养基（苏州海星生物科技有限公司，TCM-G715）；磷酸缓冲盐溶液（PBS，武汉赛维尔生物科技有限公司，G4202-500ML）；Hoechst 33342染色液（北京索莱宝科技有限公司，C0031）；CCK-8试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，AR1160）；cleaved caspase-3、Bcl-2抗体（Cell Signaling Technology，9661S、3498S）；cleaved caspase-9抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，A22672）；Bax 抗体（Abcam，ab3191）；P53抗体（南京赛戈巍生物科技有限公司，21085）；CD31抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司，GB10063-2-100）；GAPDH、β-actin抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，60004-1-IG、60008-1-IG）；HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，R211-01/02）；RNAiso Plus试剂、SYBR Premix Ex Taq^TM试剂盒（Takara，9108、RR390Q）；AngⅡ（MCE，HY-13948）；即用型免疫组化UltraSensitive TM SP试剂盒、DAB染色液（迈新生物技术开发有限公司，KIT-9720、DAB-0031）。

1.2 实验方法

1.2.1 高血压CSVD模型的构建

在小鼠背部后正中线偏右侧做一长约1.5 cm的纵行皮肤切口，分离皮下组织，将预装好的微量泵以泵头朝向小鼠尾部的方式埋入小鼠背部皮下，以1000 ng/（kg·min）持续灌注AngⅡ溶液，连续灌注28 d^［16］。将皮肤切口创缘两侧对合后缝合、消毒。将术后小鼠放于保温毯并观察其生命体征，待小鼠清醒后放回鼠笼。

1.2.2 分组与干预

将C57BL/6小鼠随机分为Control组、AngⅡ组及AngⅡ+QDG组， 6只/组。AngⅡ组及AngⅡ+QDG组按“1.2.1”项建立高血压CSVD模型，Control组使用等体积的生理盐水微量泵。AngⅡ+QDG组按1.3 g/（kg/d）给予清达颗粒药液灌胃，Control组和AngⅡ组予同体积生理盐水灌胃。于造模后第1天开始给药，1次/d，连续灌胃28 d。

1.2.3 测量血压

造模前测量1次基础血压后，每周测量1次，连续测量4周。血压测定简要步骤如下：将CODA^TM血压测量系统安装好，用固鼠器固定小鼠，于加热板上加热3 min。然后将尾袖套在小鼠尾巴根部，设置好软件后开始测定，每只小鼠测定15 次，记录各只小鼠合格的收缩压、舒张压及平均动脉压，最后取其平均值。

1.2.4 HE染色检测各组小鼠脑微血管的病理改变

采用异氟烷进行麻醉，快速取下大脑。利用4%多聚甲醛进行固定24 h后脱水包埋成石蜡块，再进行切片（厚度为 4 μm）。将烘干后的切片用二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱蜡至水，然后行HE染色。苏木素染色3 min，伊红染色30 s。风干后封片，在光镜下观察小鼠脑微血管病理变化。

1.2.5 免疫组化检测各组小鼠脑皮质区的CD31、P53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表达

取出各组织切片（厚度为4 μm），程序脱蜡复水，抗原修复，封闭、分别用CD31、P53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的一抗（1∶200） 孵育过夜。PBS洗涤后，二抗孵育1 h后加入链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶孵育1 h，DAB 染色，苏木素染核，封片并拍照，最后用Image J软件进行半定量分析。

1.2.6 bEnd.3细胞培养

将bEnd.3细胞培养于专用培养基，该培养基中添加了10%的胎牛血清与1%的双抗。置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中进行传代培养，待细胞处于对数生长期时用于后续实验。

1.2.7 清达颗粒的配置

取5 mg的清达颗粒，加入1 mL的PBS溶解，配制成5 mg/mL的溶液，分装后冻存在-20 ℃。使用时，从-20 ℃中取出，在4 ℃冰箱中缓慢溶解，然后用bEnd.3细胞专用培养基配制成所需的浓度。

1.2.8 体外氧糖剥夺再灌注（OGD/R）模型的构建

待细胞贴壁达70%后，去掉培养基，更换为无葡萄糖的DMEM培养基；随后将bEnd.3细胞置于37 ℃、含1% O₂、5% CO₂、94% N₂的缺氧培养箱中4 h；4 h后将细胞取出，去掉无葡萄糖的DMEM培养基，更换bEnd.3细胞专用培养基，继续在常氧培养箱中培养24 h。在造模期间，对照组细胞在常氧条件下用正常的bEnd.3细胞专用培养基进行培养。

1.2.9 细胞分组及CCK-8法检测细胞活力

将bEnd.3细胞以1.0×10⁵/mL的密度接种到96孔板中，100 μL/孔。24 h后弃清液，分别加入0、12.5、25、50、100、200、400 μg/mL 清达颗粒干预24 h。干预结束后，加入10 μL/孔的CCK-8溶液，37 ℃培养1 h。培养结束后，使用酶标仪测量吸光度A_{570 nm}值。同时，将bEnd.3细胞分为0、OGD/R、OGD/R+12.5 μg/mL QDG、OGD/R+25 μg/mL QDG、OGD/R+50 μg/mL QDG、OGD/R+100 μg/mL QDG、OGD/R+200 μg/mL QDG，造模方式同1.2.3，造模结束后加入不同浓度的清达颗粒干预24 h，24 h后进行CCK-8检测。

1.2.10 Hoechst 33342染色检测细胞凋亡

干预结束后，弃上清，PBS清洗后每孔加入1 mL多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次后，每孔加入1 μg/mL Hoechst33342染色液500 μL，室温孵育5 min。5 min后，弃掉 Hoechst33342染色液，用PBS清洗3次后，每孔加入2 mL PBS，在倒置荧光显微镜下进行观察，拍照。最后使用Image J软件进行定量分析。

1.2.11 RT-qPCR法检测 P53、Bcl-2、Bax的mRNA表达 用RNAiso Plus 试剂提取总RNA，并用NanoDrop2000超微量分析仪测定RNA浓度。利用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis kit将RNA逆转录成cDNA；用SYBR Premix Ex Taq^TM 试剂盒以及P53、Bax、Bcl-2的引物，从cDNA中扩增出P53、Bax、Bcl-2，以GAPDH为内参，根据2^-△△CT计算P53、Bax、Bcl-2的mRNA相对表达水平。

1.2.12 Western blotting检测P53、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表达

用RIPA裂解液提取脑组织及各组细胞中的总蛋白质，用BCA法进行蛋白定量。SDS-PAGE胶进行电泳分离总蛋白，用PVDF膜进行转膜，再用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别用P53、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9一抗（稀释比例为1∶1000）孵育过夜，TBST洗膜3次。室温孵育对应二抗1 h，TBST洗膜3次。然后进行化学发光成像，并用Image Lab软件进行分析。

1.2.13 统计学分析

采用SPSS25.0软件进行统计分析。所有计量资料均以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 清达颗粒对AngⅡ诱导的高血压CSVD小鼠血压的影响

与Control组比较，AngⅡ组的收缩压、舒张压及平均动脉压均升高，且持续到4周（P<0.05）；清达颗粒干预后，能降低AngⅡ组小鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压（P<0.05，图1）。

2.2 清达颗粒对高血压CSVD小鼠脑微血管病理形态的影响

Control组脑组织中微血管周围间隙未见扩大，神经细胞无皱缩；AngⅡ组脑组织中脑微血管周围间隙明显扩大（红色箭头所示）；与AngⅡ组相比，清达颗粒干预后能改善高血压CSVD小鼠脑微血管的病理改变（图2）。

2.3 清达颗粒对AngⅡ诱导的高血压CSVD小鼠脑组织中微血管密度的影响

与Control组比较，AngⅡ组的CD31表达降低（P<0.05），清达颗粒干预后，能增加AngⅡ组脑组织中CD31表达（P<0.05，图3）。

2.4 清达颗粒对AngⅡ诱导的高血压CSVD小鼠脑组织中P53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2表达的影响

与Control组比较，AngⅡ组的P53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达增加（P<0.05）；清达颗粒干预后，能减少P53、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的表达（P<0.05，图4A）。

与Control组比较，AngⅡ组的Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高（P<0.05）。与AngⅡ组比较，清达颗粒干预后增加了Bcl-2蛋白表达，减少了Bax蛋白表达（P<0.05，图4B）。

2.5 清达颗粒对OGD/R诱导的bEnd.3细胞活力的影响

与Control组比较，清达颗粒在12.5、25、50、100、200 μg/mL浓度时，对细胞活力没有影响，而400 μg/mL浓度的清达颗粒则抑制细胞活力（图5A）。与对照组比较，OGD/R组的bEnd.3细胞活力下降（P<0.05）；与OGD/R组比较，清达颗粒在12.5、25、50、100 μg/mL浓度下，增加OGD/R诱导的bEnd.3细胞活力（P<0.05），且100 μg/mL时效果较好（图5B），因此后续实验中使用该剂量。

2.6 清达颗粒对OGD/R诱导的bEnd.3细胞凋亡的影响

与Control组比较，QDG单独给药组的细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05），OGD/R组的细胞凋亡率升高（P<0.05）；与OGD/R组比较，清达颗粒干预后能降低OGD/R诱导的bEnd.3细胞的凋亡率（P<0.05，图6）。

2.7 清达颗粒对OGD/R诱导的bEnd.3细胞P53、Bcl-2、Bax mRNA表达水平的影响

与Control组比较，QDG单独给药组P53、Bcl-2、Bax的 mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）；OGD/R组P53和Bax的mRNA表达升高，Bcl-2的mRNA表达降低（P<0.05）；清达颗粒干预后，能升高Bcl-2的mRNA表达，降低P53、Bax的mRNA表达（P<0.05，图7）

2.8 清达颗粒对OGD/R诱导的bEnd.3细胞P53、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达的影响

与Control组比较，QDG单独给药组P53、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），OGD/R组Bcl-2的蛋白表达降低，P53、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表达升高（P<0.05）；清达颗粒干预后，能升高Bcl-2的蛋白表达，降低P53、Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9的蛋白表达（P<0.05，图8）

3 讨论

高血压CSVD是指由于长期高血压导致大脑内的小动脉、微动脉、毛细血管和小静脉发生一系列病理改变，进而引发脑组织损伤的一种疾病^［17］。脑微血管内皮细胞作为脑血管网络中的关键结构单元，不仅承担着调节血管壁张力的功能，还发挥着维持脑部血流灌注稳定性的重要作用^［18］。长期持续的高血压意味着脑微血管网络终日承受着高于正常水平的血流压力与切应力^［19］，为了适应这种压力，脑微血管壁发生结构重构，管壁增厚变硬，从而导致脑微血管对血流的调节能力降低^［20］，脑部供血不足，引起脑组织出现缺血缺氧。脑微血管内皮细胞紧临血液，最先感知血氧分压变化^［21］，大脑缺血、缺氧可导致脑血管内皮细胞损伤、结构破坏甚至死亡^［22］。在这个过程中，存在着多种病理机制相互作用，其中脑微血管内皮细胞凋亡是高血压CSVD发生发展的重要病理机制^［23］。

中药复方清达颗粒是由国医大师陈可冀院士高血压临床经验方清眩降压汤精简化裁而来，主治高血压前期、新发1级高血压证属肝火上炎、肝阳上亢所致的头晕、头痛、烦躁、失眠等^［24］，全方由天麻、黄芩、钩藤、莲子心四味药组成。主要功效为清肝热，泄心火，舒达肝气。有研究发现，天麻中的天麻素能够通过PI3K-Akt信号通路调控细胞凋亡，促进脑缺血缺氧后的血管新生，减轻缺氧对脑微血管内皮的损伤^［25］。黄芩苷能够维持细胞正常生理结构，减少OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞坏死及凋亡^［26］。且药理学研究发现，钩藤具有降压、抗炎、抗凋亡等作用^{［27， 28］}，并有研究发现，莲子心中主要活性成分莲心碱能够抑制NLRP3炎性小体活化从而缓解脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤及细胞凋亡^［29］。以上研究提示抑制脑微血管内皮细胞凋亡可能是清达颗粒减轻高血压CSVD的重要途径。因此，本研究利用AngII构建高血压CSVD小鼠模型结合OGD/R诱导的细胞模型，研究清达颗粒抑制脑微血管内皮细胞凋亡，减轻高血压CSVD脑损伤的作用机制。

本研究发现清达颗粒能够显著降低高血压CSVD小鼠收缩压、舒张压及平均动脉压，这与本团队前期动物实验研究结果相一致^［30］。高血压会损害内皮细胞和血脑屏障，这使得血液中的血浆成分更容易从血管内渗漏到血管周围间隙中^［31］。这种渗出直接增加了间隙内的液体和蛋白质负荷，导致间隙扩大。本研究的HE染色结果显示，AngⅡ组小鼠脑微血管周围间隙显著增大；CD31作为内皮细胞特异性标志物，其表达水平直接反映微血管内皮细胞的完整性与密度^［32］。本研究发现AngⅡ组小鼠脑组织CD31的表达显著降低，提示微血管结构破坏与密度减少，这与临床CSVD患者脑白质疏松区域微血管密度降低的病理特征一致^［33］。而清达颗粒干预后，脑微血管周围间隙扩大的现象得到明显改善，CD31表达显著升高。这一结果证实清达颗粒可通过维持微血管结构稳定，改善高血压诱导的脑微血管病理损伤。

脑微血管内皮细胞凋亡是高血压性CSVD发生发展的关键环节—高血压诱导的脑微血管内皮细胞损伤可启动凋亡程序，而凋亡的脑微血管内皮细胞无法维持血管壁完整性，进一步加剧血脑屏障破坏与微血管重构^{［23， 34， 35］}。本研究通过体内外模型验证了清达颗粒的抗凋亡作用：体内实验中，AngⅡ组小鼠脑微血管组织中促凋亡蛋白Bax表达升高、抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低；体外实验中，OGD/R诱导的bEnd.3细胞活力显著降低，Hoechst 33342染色显示凋亡细胞形态学特征（核固缩、染色质凝聚）明显增多。清达颗粒干预后，体内外模型中均出现凋亡相关指标的逆转：体内外Bcl-2表达升高、Bax表达降低，体外细胞凋亡率显著下降，提示清达颗粒对脑微血管内皮细胞具有显著的抗凋亡保护作用。

Caspase-9作为细胞凋亡线粒体通路的启动者，被激活后可进一步激活caspase 级联反应推动细胞凋亡进程^{［36， 37］}。Caspase-3是caspases级联反应下游最关键的凋亡执行蛋白酶，在细胞凋亡程序中扮演着核心枢纽的角色^{［38， 39］}。当caspase-3被激活后，它能够裂解DNA依赖性蛋白激酶等关键底物，通过改变这些底物的结构，进而推动细胞凋亡进程的顺利进行^［40］。与上述结果一致的是，在AngII诱导的高血压性CSVD小鼠脑组织及OGD/R诱导的bEnd.3细胞中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9显著升高，清达颗粒则能够显著降低caspase-3、caspase-9的活化。

P53作为细胞凋亡的关键调控因子之一，参与多种脑血管疾病中的细胞凋亡过程。有研究发现，P53表达水平与高血压CSVD脑损伤后脑微血管内皮细胞凋亡呈正相关，P53的激活能使促细胞凋亡蛋白Bax、剪切的caspase-3表达水平上调，抑制P53有利于抗凋亡蛋白Bcl-2的表达^{［39， 41］}。本研究结果与上述发现一致：在AngII诱导的高血压CSVD小鼠脑组织及OGD/R诱导的bEnd.3细胞中，P53蛋白表达显著上调，经清达颗粒处理后则逆转了P53的表达。已有研究报道清达颗粒中的单味药黄芩的主要活性成分黄芩素能够靶向caspase-3和P53等靶点，调控细胞凋亡^{［36， 37］}；天麻主要活性成分天麻素可通过抑制CaMKII/ASK-1/p38 MAPK/P53信号通路，减少神经细胞PC12的细胞凋亡，进而减轻脑损伤^［42］；钩藤中异钩藤碱能通过调节SIRT1/P53/caspase-3信号通路减轻神经细胞凋亡，缓解癫痫症状^［43］。这些结果为清达颗粒抑制P53信号通路减轻脑微血管内皮细胞凋亡的功效提供了科学依据。接下来的研究中，我们将通过敲低或过表达P53等系列实验，进一步确认清达颗粒是否通过靶向调控P53通路发挥的抗凋亡作用，并进一步探讨清达颗粒发挥抗凋亡作用的物质基础研究。

综上所述，清达颗粒能够减轻高血压CSVD脑损伤，其作用机制可能是通过调控P53信号通路抑制脑微血管内皮细胞凋亡。该研究为其在临床上减轻高血压CSVD脑损伤提供了实验依据，丰富了清达颗粒防治高血压并发症的思路与方向，为其开发成临床用药提供科学依据。

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