矮杨梅根石油醚部位通过抑制肠道平滑肌痉挛缓解小鼠腹痛

Petroleum ether fraction of Myrica nana roots relieves spasmodic abdominal pain in mice by inhibiting intestinal smooth muscle spasm

摘要

目的 研究矮杨梅根石油醚部位（PEFM）对痉挛性腹痛小鼠的镇痛作用及机制。 方法 采用GC-MS鉴定PEFM的化学成分。采用新斯的明诱导的小鼠痉挛性腹痛模型评价PEFM的体内镇痛效果。将40只雄性KM小鼠按体质量随机分为空白对照组，双环维林组（25 mg/kg），PEFM低、中、高剂量组（100、200、400 mg/kg），8只/组。各组小鼠每日灌胃给予相应的溶媒或药物，连续5 d，末次给药45 min后，所有小鼠腹腔注射新斯的明（150 μg/kg）致痛，记录小鼠疼痛潜伏期和疼痛抑制率。取实验小鼠的血清和回肠组织，测量血清中cGMP的含量及回肠中p-VASP（ser157）蛋白表达量。采用小鼠经口灌胃急性毒性试验法评估PEFM的安全性。取雌雄各半的KM小鼠32只，按体质量随机分为空白组（0.5% CMC-Na溶液），PEFM低、中、高剂量组（1、2、4 g/kg），8只/组。连续14 d观察小鼠自主活动、行为变化及急性毒性体征，记录毒性反应出现时间与程度。试验结束后解剖并观察各脏器形态有无异常，计算各脏器指数。建立乙酰胆碱（ACh，10 μmol/L）诱导的大鼠离体回肠平滑肌痉挛收缩模型，以舒张率和收缩最大效应值为指标，测试PEFM和豆甾-4-烯-3-酮（ST）的解痉作用。使用NO合酶抑制剂（L-NAME，10 μmol/L）、鸟苷酸环化酶抑制剂（MB，30 μmol/L；ODQ， 10 μmol/L）以及多种钾离子通道阻滞剂（GLIB，10 μmol/L；4-AP，2 mmol/L；CsCl，5 mmol/L；TEA，5 mmol/L）预孵育。通过高钾离子（80 mmol/L）诱导的痉挛模型评价PEFM及ST对L型电压门控钙通道的拮抗作用。采用AutoDock Vina 软件对主要成分ST与PKG、p-VASP（ser157）蛋白进行了分子对接。 结果 GC-MS分析表明PEFM富含甾类成分，其中ST的含量最高，为31.51%。PEFM的急性毒性实验中未发现小鼠毒性反应，解剖后主要脏器体积、颜色、质地均未见明显异常，小鼠的脏器指数与对照组比较无显著性差异。PEFM中、高剂量能显著减少新斯的明诱导的小鼠痉挛性腹痛次数，并显著延长疼痛潜伏期（P<0.05）。ELISA检测结果表明，与溶媒对照组相比，PEFM的中、高剂量能显著提高血清中cGMP的含量（P<0.01）。Western blotting结果表明，双环维林及PEFM均可提高回肠组织中p-VASP的表达量（P<0.05）。PEFM和ST对Ach诱导的回肠平滑肌痉挛收缩均具有显著的解痉效应，其EC₅₀分别为4.06 μg/mL和0.53 μg/mL。PEFM的活性可被L-NAME、MB、ODQ及4-AP显著抑制（P<0.05）。ST的解痉活性可被L-NAME、MB、ODQ、GLIB和TEA显著抑制（P<0.05）。PEFM和ST对高钾离子诱导的痉挛收缩均具有较好的解痉活性，其EC₅₀分别为22.62 μg/mL和18.63 μg/mL。分子对接结果显示，ST能与PKG和p-VASP（ser157）两个核心靶蛋白稳定结合。 结论 PEFM具有显著的解痉活性，对新斯的明诱导的痉挛性腹痛小鼠具有显著的镇痛效果，其作用机制可能与上调cGMP水平，增强回肠VASP磷酸化，激活NO/sGC/cGMP/PKG通路，开放电压门控钾通道及拮抗L型钙离子通道有关。ST为PEFM解痉镇痛的主要活性成分。

Abstract

Objective To investigate the effect of the petroleum ether fraction of Myrica nana roots (PEFM) for relieving spasmodic abdominal pain in mice and its underlying mechanism. Methods The chemical profile of PEFM was analyzed using GC-MS. Forty Kunming mice were randomized into 5 groups for daily gavage with solvent, dicyclomine, or low-, medium-, and high-dose PEFM for 5 consecutive days, and their effects against neostigmine-induced spasmodic abdominal pain were evaluated. Serum cGMP levels and ileal PKG and p-VASP expressions of the mice were measured. Acute toxicity of PEFM gavage at different doses was assessed in another 32 Kunming mice by monitoring behavioral changes and organ indices. An isolated ileal model of ACh-induced spasm was used to observe the antispasmodic effect of PEFM and its main constituent, stigmast-4-en-3-one (ST), and the mediating roles of the NO/sGC/cGMP/PKG pathway, potassium channels, and calcium channels were investigated using specific inhibitors and a high-potassium-induced spasm model. Molecular docking was used to predict the interactions between compounds and targets. Results PEFM contained mainly steroidal compounds, with ST as the most abundant component (31.51%). PEFM at the medium and high doses significantly reduced abdominal pain frequency, prolonged pain latency, and increased serum cGMP and ileal p-VASP expression without producing significant acute toxicity. Both PEFM and ST exhibited concentration-dependent antispasmodic effects against ACh-induced contractions (EC₅₀: 4.06 μg/mL and 0.53 μg/mL, respectively), which were inhibited by L-NAME, methylene blue, ODQ, and potassium channel blockers; they also strongly antagonized high potassium-induced contractions. Molecular docking confirmed stable binding of ST to PKG and p-VASP. Conclusion PEFM has spasmolytic and analgesic effects in mice with neostigmine-induced spastic abdominal pain, mediated primarily by its main active component ST, which upregulates cGMP, enhances ileal VASP phosphorylation, activates NO/sGC/cGMP/PKG pathway, promotes opening of voltage-gated potassium channels, and antagonizes L-type calcium channels.

Graphical abstract

关键词

矮杨梅根 / 解痉 / 腹痛 / K⁺通路 / NO/sGC/cGMP/PKG通路 / 豆甾-4-烯-3-酮

Key words

roots of Myrica nana / spasmolysis / abdominal pain / K⁺ channels / NO/sGC/cGMP/PKG pathway / stigmast-4-en-3-one

腹痛是大多数胃肠道疾病的常见症状之一，如痢疾^［1］、腹泻型肠易激综合征^［2］和克罗恩病^［3］等。伴有痉挛性腹痛的患者常常需要服用解痉药物来缓解腹痛症状^［4］。临床上常用的解痉药物有山莨菪碱、阿托品等抗胆碱类药物，其治疗窗较窄，在用药期间易引发多种不良反应和副作用^{［5， 6］}。民族药因其多组分与多靶点协同起效，表现出优异的药效和较少的不良反应，是新药研发的重要来源^［7］。

矮杨梅（Myrica nana Cheval.）是杨梅科（Myricaceae）杨梅属（Myrica）常绿乔木植物。产于云南中部和贵州西部，生长在海拔1500-3500米的山坡、林缘及灌木丛中，是我国的独有种^［8］。据《云南省中药材标准（2005）》^［9］和《中华本草（第二册）》^［10］记载，其根苦微酸，性凉，归心、肝、大肠经，具有收敛、止血、消炎等功效，主治痢疾、腹痛、消化不良、直肠出血、风湿性关节炎、跌打损伤等症^［11］。杨梅属药用植物主要含有三萜类^［12］、二芳基庚烷类^［13］、黄酮类^［14］、酚类^［15］、甾类、木脂素类和挥发油^［16］等化学成分，现代药理学研究表明，杨梅属药用植物具有抗炎^［17］、抗肿瘤^［18］、抗糖尿病、保肝^［19］、抗菌、抗氧化^［12］及痉挛性腹痛等活性。除Zhang等^［20］报道来源于矮杨梅乙酸乙酯部位的二芳基大环烷类化合物有显著的解痉镇痛活性外，尚无其他关于该属植物解痉活性的报道。为了进一步了解矮杨梅的解痉镇痛作用及其主要活性成分，我们对其石油醚活性部位（PEFM）开展了研究，初步探索了PEFM及主要活性成分豆甾-4-烯-3-酮（ST）的作用机制。该研究揭示了PEFM缓解痉挛性腹痛的作用机制及其解痉活性主成分，为矮杨梅的资源开发提供了依据。

1 材料和方法

1.1 实验药材

本实验所用药材为矮杨梅干燥的根茎，采集于云南省嵩明县法界寺森林公园，经云南民族大学民族医药学院杨青松教授鉴定为杨梅科（Myricaceae）杨梅属（Myrica）植物矮杨梅（M. nana Cheval.）的干燥根茎，其标本存放于云南民族大学民族医药学院标本室（标本号：202111JTS）。

1.2 试剂

1.2.1 主要试剂

氯化钠、氯化钾（KCl）和磷酸二氢钠均购买于成都市科隆化学品有限公司，氯化镁、无水氯化钙、葡萄糖和碳酸氢钠均购买于西陇科学股份有限公司，二甲基亚砜（DMSO）、4-氨基吡啶（4-AP）、1H-［1，2，4］噁二唑并［4，3-A］喹喔啉-1-酮（ODQ）、氯化铯（CsCl）、四乙基氯化铵（TEA）和格列本脲（GLIB）均购买于上海皓鸿生物医药科技有限公司，Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME）和溴化新斯的明（Neostigmine）均购买于上海泰坦科技股份有限公司，豆甾-4-烯-3-酮（ST）、亚甲基蓝（MB）和乙酰胆碱（Ach）、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）均购买于上海源叶生物科技有限公司，阿托品和盐酸双环维林均购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，PVDF膜、彩色快速凝胶制备试剂盒和ECL化学发光底物试剂盒（特超敏）均购买于武汉博士德生物工程有限公司，小鼠环磷酸鸟苷ELISA检测试剂盒购买于攸碧艾生物技术有限公司。

1.2.2 抗体

山羊抗兔IGg-HRP、β-Actin和Marker（10~180 kDa）抗体购买于武汉博士德生物工程有限公司，VASP和p-VASP（ser157）抗体购买于杭州臻优品生物科技有限公司。

1.3 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠（250~350 g），KM小鼠（18~22 g）均购自昆明医科大学实验动物中心。实验动物在温度为23±1 ℃，40%~70%湿度，气流速度控制在0.1~0.2 m³/s，噪音值低于60 dB的标准化动物饲养室内饲养，12 h的明暗循环。适应性饲养5 d后用于实验。本实验经云南民族大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：2023A015）。

1.4 实验仪器

N-1100D-WD型旋转蒸发仪（上海市EYELA仪器有限公司），AL104型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），SQG-4四腔器官浴槽系统、RE2640生理信号采集系统、TSZ-04-E张力转换器（成都仪器厂），DB-5MS毛细石英柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、GC-MS 2020 NX（日本岛津），MULTISKAN GO多功能全波长酶标仪、5417R4型低温冷冻离心机（赛默飞世尔科技公司），JY-CZ-BL型电泳槽（韦克斯科技有限公司），KD-2258型化学发光凝胶成像仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 受试物的制备

将干燥药材（20.0 kg）粉碎后使用95%甲醇浸泡提取，每次提取2 d，重复3次，合并提取液，减压回收溶剂后得到浸膏1.8 kg。称取杨梅根95%甲醇提取物1.6 kg，加入适量纯净水与之混悬，分别用等体积的分析纯石油醚（沸程：60~90℃）、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，萃取温度为23±1℃，每相萃取3次。合并萃取液，减压回收有机溶剂后得到PEFM（17.4 g）、乙酸乙酯萃取物（585.6 g）、正丁醇萃取物（120.8 g）和水萃取物（742.2 g），并于4 ℃冰箱中保存备用。

1.5.2 台式液的配制

精确称取氯化钠8.00 g，氯化钾0.20 g，无水氯化钙0.40 g，无水氯化镁0.20 g，磷酸二氢钠0.05 g与葡萄糖1.00 g，加纯水700 mL使其溶解，另取碳酸氢钠1.00 g，加纯水约200 mL溶解后，缓缓加入于前溶液中，最后加纯水定容至1000 mL^［20］。现用现配。

1.5.3 GC-MS分析PEFM化学成分

GC-MS分析条件：流动相为高纯氦气，流量为1.0 mL/min；柱箱温度60 ℃，进样口温度为280 ℃；程序升温法，初始温度为60 ℃，保持3 min，以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持10 min，再以3 ℃/min的速率升至215 ℃，保持1 min，最后以10℃/min的速率升至280 ℃，保持15 min；进样量为1 μL，不分流进样。质谱采用离子源为EI电源，离子源温度200 ℃，电子能量70 ev，质谱与气相色谱的接口温度为280 ℃。

使用上述条件对正构烷烃（C₇~C₃₀）对照品进行GC-MS分析，记录各正构烷烃的保留时间，并计算保留指数（RI）。RI_（x）计算公式为：100n+100（T_R（x）-T_n）/（T_R（n+1）-T_n）^［21］。式中x为待分析化合物；T_R为保留时间；n、n+1为待分析化合物前后两个正构烷烃碳原子数，且T_n<T_R（x）<T_R（n+1）。通过NIST147质谱数据库检索相似化合物，比对文献RI值，离子碎片分析等多种方式鉴定结果PEFM的化学组成，按照面积归一化法确定其各化合物的相对含量^［22］。

1.5.4 PEFM急性毒性实验

取32只KM小鼠，实验前禁食不禁水12 h。随机分为空白组和PEFM低、中、高剂量组共4组，8只/组，雌雄各半。采取小鼠灌胃给药的急性毒性试验方法进行急性毒性研究。空白组给予0.5% CMC-Na溶液，其余3组分别给予1、2、4 g/kg的PEFM，给药容积为40 mL/kg，各组小鼠每天观察1次，连续14 d，密切观察各组小鼠的自主活动和行为变化，并记录每种急性毒性体征的出现时间及其表现程度。实验结束后，对实验小鼠进行解剖，观察各脏器、器官的体积、颜色、质地等有无异常^［23］。

1.5.5 PEFM对新斯的明诱导的痉挛性腹痛的影响

取雄性KM小鼠40只，按体质量随机分为空白对照组，阳性对照组（双环维林，25 mg/kg），PEFM低、中、高剂量组（100、200、400 mg/kg）。空白对照组给予等量的溶媒（0.5% CMC-Na溶液），其余各组灌胃给予相应的受试物，连续5 d。末次灌胃45 min后，对所有小鼠腹腔注射新斯的明（150 μg/kg）致痛，注射后即刻计时，记录疼痛潜伏期，观察20 min内的疼痛反应次数，计算疼痛抑制率。疼痛反应以腹部伸展并贴壁、腹部收缩、舔腹、拱形为指标，各记为1次。测完后，采集血液制备血清，取回肠组织备用。疼痛抑制率计算公式为：（空白对照组疼痛反应次数–给药组疼痛反应次数）/空白对照组疼痛反应次数×100%^{［24， 25］}。

1.5.6 PEFM对痉挛性腹痛小鼠血清中cGMP的含量及回肠中p-VASP（ser157）蛋白表达的影响

采用小鼠环磷酸鸟苷ELISA检测试剂盒检测血清中cGMP的含量^［26］。使用RIPA裂解液提取小鼠回肠组织中的总蛋白，用聚氯基丙烯酸正丁酯（BCA）方法测定蛋白浓度。以β-actin（1∶1000）作为内参抗体，一抗包括：VASP（1∶1000）和p-VASP（1∶1000）。二抗为山羊抗兔IgG（1∶1000）。采用10%的PAGE凝胶进行蛋白电泳，经转印、抗体孵育后，使用ECL化学发光法显影，通过ImageJ软件对蛋白条带进行光密度定量分析^［27］。

1.5.7 离体回肠平滑肌片段的制备与平衡

SD大鼠于实验前禁食不禁水24 h，处死后立即剖开腹腔，取出回肠部分，放入盛有台式液的培养皿中，分离肠系膜并清洗肠内容物，随后剪成1.0~1.2 cm的片段。将平滑肌片段置入盛有5 mL新鲜台式液恒温浴槽中37±0.5 ℃并连续通入含有95% CO₂和5% O₂的混合气体，平滑肌下端固定于浴槽底部，上端与张力换能器相连，调节前负荷约1.0 g。使用RM6240E实验系统采集信号，记录收缩张力变化。每隔15 min换1次新鲜台式液，平衡至少30 min，确保平滑肌收缩稳定^［28］。

1.5.8 PEFM和ST对Ach诱导的大鼠离体回肠平滑肌痉挛收缩的影响

平衡完成后，向浴槽内加入Ach（10 μmol/L）建立回肠平滑肌痉挛收缩模型，待模型稳定至少5 min后，将阳性药双环维林（0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μg/mL）、PEFM（0.625、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/mL）和ST（0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 μg/mL）采用浓度累加法分别加入浴槽中，每次加药后观察收缩张力变化5 min。平行试验6次。受试物配置所用溶媒为DMSO，控制浴槽中DMSO终浓度不超过0.5%（v/v），该空白溶媒对回肠平滑肌的收缩无明显影响。以曲线下面积（AUC）为统计指标，计算各浓度受试物对的痉挛收缩的舒张率［（%）］。舒张率（%）的计算公式为：1-（AUC_受试物/AUC_Ach）×100%^［29］。

1.5.9 PEFM对Ach量效曲线的影响

待平滑肌收缩稳定后，向浴槽中分别加入0.5%的DMSO（空白对照）、PEFM（5、10 μg/mL）和0.30 μg/mL的阿托品（阳性对照），孵育15 min后依次累加Ach（0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 μmol/L），每个浓度间隔2 min，观察并记录乙酰胆碱量效曲线，平行试验6次。以AUC为统计指标，以空白对照组中10.00 μmol/L的Ach诱导的收缩效应的平均AUC为标准（AUC_标准），分别计算各浓度乙酰胆碱诱导的收缩率［（%）］，Constraction （%）的计算公式为：AUC_受试物/AUC_标准×100%。并比较收缩最大效应（E_max）值。

1.5.10 NO/sGC/cGMP/PKG通路阻滞剂对PEFM和ST解痉活性的影响

为确定PEFM和ST的解痉活性是否与NO/sGC/cGMP/PKG信号通路相关，待回肠平滑肌收缩稳定后，往浴槽中加入L-NAME（10 μmol/L，NO合酶抑制剂）、MB（30 μmol/L，非特异性鸟苷酸环化酶抑制剂）及ODQ（10 μmol/L，选择性水溶性鸟苷酸环化酶抑制剂剂）等NO/sGC/cGMP/PKG通路阻滞剂，孵育15 min后，使用10 μmol/L的Ach诱导回肠平滑肌痉挛模型^［20］，待痉挛收缩稳定后测定PEFM和ST解痉活性，比较有无阻滞剂孵育情况下药物的解痉活性变化，平行试验6次。

1.5.11 钾离子通道阻滞剂对PEFM和ST解痉活性的影响

为探究PEFM和ST的解痉活性是否涉及钾离子通道的开放，在平滑肌稳定收缩后往浴槽中加入GLIB（10 μmol/L，ATP敏感型K⁺通道阻滞剂）、4-AP（2 mmol/L，电压依赖性K⁺通道阻滞剂）、CsCl（5 mmol/L，内向整流型K⁺通道阻滞剂）和TEA（5 mmol/L，钙激活型K⁺通道阻滞剂）等K⁺通路阻滞剂。孵育15 min后，使用10 μmol/L的Ach诱导回肠平滑肌痉挛收缩^［29］，待痉挛收缩稳定后测定药物解痉活性，比较有无阻滞剂孵育情况下药物的解痉活性变化，平行试验6次。

1.5.12 PEFM和ST对KCl诱导大鼠离体回肠平滑肌痉挛收缩的影响

采用KCl诱导的痉挛模型探究PEFM的解痉活性是否与拮抗L型电压门控钙离子通道相关^{［30， 31］}。待收缩张力稳定后，往浴槽中加入KCl（80 mmol/L）诱导回肠平滑肌痉挛收缩，待模型稳定至少5 min后，分别采用浓度累加法将阳性药维拉帕米（0.01、0.02、0.05、0.10、0.20 μg/mL）、PEFM（2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/mL）和ST（0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 μg/mL）加入浴槽中，每次加药后观察收缩张力变化5 min，平行试验6次。以AUC为统计指标，计算各浓度受试物对痉挛收缩的舒张率（%）。

1.5.13 分子对接研究

将ST与p-VASP和PKG进行分子对接，确定化合物与蛋白的亲和结合能力。从PubChem数据库获取ST的3D结构，在PDB数据库中筛选并下载p-VASP和PKG蛋白结构文件。运用AutoDock Tools软件对配体和受体进行预处理并保存为pdbqt格式，利用AutoDock Vina 软件进行分子对接操作。利用 PyMOL 软件对分子对接结果进行可视化操作和分析^［32］。

1.5.14 统计学分析

使用软件Graphpad prism 8进行数据处理，定量数据以均数±标准差表示，采用双因素方差分析进行实验数据组间比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PEFM的化学成分分析

PEFM的总离子流色谱图如下所示（图1）。从PEFM中共鉴定出46个化合物，其中ST的含量最高，达31.51%。其余含量高于5%的主成分包括：24-methylcholest-5-en-3β-ol acetate （8.96%）， cholest-5-en-3β-ol （8.82%）， β-sitosterol （6.04%）、γ-tocopherol （5.42%）和menaquinone-7 （5.21%）（表1）。

2.2 PEFM急性毒性试验

各组均未出现小鼠死亡的情况。监测期间，空白对照组和各试验组小鼠毛发平整光泽、瞳孔、眨眼和正位反射正常，小鼠的体质量和自主活动均无异常。监测期结束后对小鼠进行解剖，观察各组织及器官的体积、颜色、质地等，均无肉眼可见异常。各组小鼠脏器指数与对照组相比无显著差异（表2）。按照小鼠与人体表面积折算，相当于成人（60 kg）单次口服PEFM不超过19.46 g时，未见急性毒性反应。

2.3 PEFM对新斯的明诱导痉挛性腹痛的镇痛作用

与空白对照组比较，25 mg/kg的双环维林能显著延长模型小鼠的疼痛潜伏期并减少疼痛反应次数（P<0.001）；100 mg/kg的PEFM对模型小鼠的疼痛潜伏期和疼痛反应次数无明显影响；200 mg/kg和400 mg/kg的PEFM能显著延长模型小鼠疼痛潜伏期（P<0.05），降低疼痛反应次数（P<0.01），表现出剂量依赖性（图2）。

2.4 PEFM对痉挛性腹痛模型小鼠血清cGMP的含量及回肠p-VASP蛋白表达的影响

ELISA检测结果显示（图3A），与溶媒对照组相比，PEFM的中、高剂量能显著提升血清中cGMP的含量（P<0.01）。Western blotting结果显示，与溶媒对照组相比，双环维林及PEFM的3个剂量均可提高回肠组织中p-VASP的表达量（P<0.05， 图3B）。

2.5 PEFM和ST对Ach诱导的大鼠离体回肠平滑肌痉挛收缩的影响

与溶媒对照组比较，双环维林对痉挛收缩的平滑肌具有明显的舒张作用，且呈浓度依赖性，其EC₅₀值为0.23 μg/mL（95% CI： 0.19~0.29 μg/mL，P<0.001）。相似地，PEFM和ST呈剂量依赖性舒张痉挛的回肠平滑肌，表现出较好的解痉活性，EC₅₀值分别为4.06 μg/mL（95% CI： 3.18~5.40 μg/mL，P<0.001）和0.53 μg/mL（95% CI： 0.44~0.64 μg/mL，P<0.001）。其中ST的解痉活性与阳性药物双环维林接近（图4）。

2.6 PEFM对Ach的量-效曲线的影响

与空白对照组比较，使用0.3 μg/mL的阿托品孵育后，乙酰胆碱的量-效曲线明显下移，E_max下降至24.86%（P<0.001）。同样地，在5.0 μg/mL和10.0 μg/mL的PEFM孵育后Ach的量效曲线也明显下移，E_max分别下降至58.99%（P<0.001）和42.09%（P<0.001）。PEFM对Ach量效曲线表现出明显的抑制作用，且呈浓度依赖性（图5）。

2.7 NO/sGC/cGMP/PKG通路阻滞剂对PEFM和ST解痉活性的影响

与PEFM解痉活性［EC₅₀=4.06 mg/mL （95% CI： 3.18~5.40 mg/mL），E_max=79%］相比，分别用L-NAME、MB及ODQ预孵育后，PEFM的解痉活性均明显下降，其EC₅₀值均≥20 μg/mL，E_max分别下降至43.75%，52.35%，44.14%（P<0.001）。同样地，ST的解痉活性也有明显下降，E_max分别下降至32.88%，67.08%，27.41%（P<0.001， 图6）。

2.8 K⁺通路阻滞剂对PEFM和ST解痉活性的影响

与PEFM解痉活性［EC₅₀=4.06 mg/mL （95% CI： 3.18~5.40 mg/mL），E_max=79%］相比，分别用CsCl、TEA及GLIB预孵育后，PEFM的解痉活性均无明显变化（P>0.05）；而使用阻滞剂4-AP孵育后，PEFM的解痉活性明显降低，其EC₅₀ ≥20 mg/mL，E_max下降至41.79%（P<0.001）。药物ST在阻滞剂CsCl和4-AP孵育后无显著变化，而在阻滞剂TEA和GLIB孵育后，药物的解痉活性明显降低，E_max分别下降至33.32%和68.34%（P<0.001，图7）。

2.9 PEFM和ST对KCl诱导大鼠离体回肠平滑肌痉挛收缩的影响

与溶媒对照组比较，维拉帕米对KCl诱导的平滑肌痉挛收缩具有明显的舒张作用，且呈浓度依赖性，其EC₅₀值为0.05 μg/mL（95% CI： 0.04~0.05 μg/mL，P<0.001）。PEFM呈剂量依赖性舒张KCl诱导的平滑肌痉挛收缩，表现出较好的解痉活性，其EC₅₀值为22.62 μg/mL （95% CI：21.35~23.98 μg/mL，P<0.001）。同样地，ST也呈剂量依赖性舒张KCl诱导的平滑肌痉挛收缩，表现出较好的解痉活性，其EC₅₀值为18.63 μg/mL（95% CI：14.29~21.19 μg/mL，P<0.001，图8）。

2.10 分子对接研究结果

2.10.1 ST与 p-VASP的分子对接结果 ST与p-VASP的结合亲和力评分为-5.538 kcal/mol。ST结合于p-VASP的疏水口袋区域，与残基ALA112、PHE47、PRO119及ILE6形成疏水接触。其中，PHE47、ALA112及ILE6参与相互作用（图9A）。

2.10.2 ST与PKG的分子对接结果

ST与PKG的结合亲和力评分为-7.903 kcal/mol。ST与GLU348、TYR425、LYS344、ALA347、PHE352、PHE351及PHE387残基形成疏水接触。GLU348和LYS344的侧链非极性部分参与相互作用（图9B）。

3 讨论

民族药矮杨梅作为彝族、苗族、布依族治疗胃肠道疾病的常用药物，主治肠炎、痢疾、腹痛等症^［33］。腹痛作为一种胃肠道疾病的常见症状，多由肠道平滑肌痉挛收缩引发，解痉药物可以缓解该症状。目前，有关矮杨梅药理学的研究较少，前期课题组研究发现从矮杨梅乙酸乙酯部位中分离得到的二芳基大环烷类化合物具有明显的解痉活性，可以缓解痉挛性腹痛症状^［20］。基于前期的研究进展，我们进一步开展了矮杨梅石油醚活性部位治疗腹痛的作用及机制研究。

我们采用24 h单次灌胃给药法探究了PEFM的急性毒性，结果显示各组小鼠在给药后的14 d内未出现明显的急性毒性。毒性试验最大给药剂量为4 g/kg，该剂量按照小鼠与人体的体表面积折算，成人（60 kg）在口服PEFM不超过19.46 g的情况下无急性毒性反应^［34］。

新斯的明作为一种强效的胆碱酯酶抑制剂，可以诱导体内乙酰胆碱蓄积^［35］。乙酰胆碱激活M₂和M₃受体后，通过调控IP₃受体促进肌浆网中内源性钙离子的释放，导致平滑肌胞内钙离子浓度升高，钙离子与肌钙蛋白结合后引发胃肠道平滑肌痉挛性收缩，从而产生腹痛^{［36，37］}。PEFM对新斯的明诱导的小鼠腹部痉挛性腹痛表现出明显的镇痛作用，且能延长疼痛潜伏期。该结果提示，PEFM的镇痛作用可能与调控胆碱能通路，抑制肠道平滑肌痉挛收缩有关。进一步采用乙酰胆碱诱导的回肠平滑肌痉挛收缩模型，探究PEFM的解痉活性及机制，以阐明其潜在的镇痛作用机制。实验结果表明，PEFM对乙酰胆碱诱导的离体回肠平滑肌痉挛收缩具有显著的解痉活性，并能浓度依赖性降低乙酰胆碱诱导的回肠平滑肌收缩强度，表明其解痉活性可能与调节胆碱能信号通路有关。在NO/sGC/cGMP/PKG信号通路研究中，一氧化氮合酶抑制剂、特异性和选择性鸟苷酸环化酶抑制剂能显著降低PEFM的解痉活性，表明其解痉活性可能与调节NO/sGC/cGMP/PKG信号通路有关^［38］。进一步研究发现，PEFM能显著升高痉挛性腹痛模型小鼠血清中cGMP的水平，并增强回肠组织中PKG下游靶蛋白VASP在Ser157位的磷酸化，从而活化NO/sGC/cGMP/PKG信号通路，发挥解痉活性。钾离子通道开放可导致细胞膜超极化，减少电压门控钙通道开放，从而抑制平滑肌的收缩。电压门控钾离子通道阻滞剂亦能显著降低PEFM的解痉活性，表明其解痉活性可能与开放电压门控钾离子通道有关^［39］。高钾离子（≥30 mmol/L）可诱导细胞膜去极化，直接激活L型电压门控钙通道，引起钙内流，促使平滑肌收缩加强。PEFM对高钾离子诱导的离体回肠平滑肌痉挛收缩具有明显的解痉活性，表明其具有显著的L型电压门控钙离子通道阻滞效应^［40］。

GC-MS分析结果表明，甾类化合物是PEFM的主要化学成分，总含量达61.68%。ST作为PEFM中的主要活性成分，相对含量为31.51%，为首次从杨梅属植物中鉴定出该已知化合物。ST对醋酸诱导的扭体反应有明显的抑制作用，并能降低NO、TNF-α、IL-1和IL-6等炎性因子水平，抑制COX催化活性，减少PGE2的生成，表现出较好的镇痛和抗炎作用^{［41， 42］}。然而未见有关ST对肠道平滑肌的解痉活性相关报道。因此，本研究对ST的解痉活性及其作用机制进行了探究，结果显示ST具有显著的解痉活性，与阳性药物双环维林接近。ST的解痉机制与PEFM相似，与调控胆碱能通路、NO/sGC/cGMP/PKG信号通路，开放钙激活钾通道（KCa）和ATP 敏感性钾通道（KATP），拮抗L型电压门控钙离子通道相关。此外，研究针对NO/sGC/cGMP/PKG信号通路中的两个重要的解痉相关蛋白PKG和p-VASP做了分子对接。结果显示ST可与PKG和p-VASP的疏水口袋稳定结合（结合能分别为-7.903 kcal/mol和-5.538 kcal/mol），提示ST可以与这两个蛋白结合，调控NO/sGC/cGMP/PKG信号通路发挥解痉活性。

综上所述，PEFM具有明显的解痉活性，可缓解小鼠痉挛性腹痛，其作用机制涉及多通路、多靶点。ST作为矮杨梅PEFM的主要解痉活性成分，其活性强，来源广泛，制备成本低，在治疗痉挛性腹痛方面显示了深入研发的潜力。后续研究将围绕ST的结构进行优化，探究构效关系，并在其他平滑肌功能异常的疾病模型中展开活性研究，进一步为矮杨梅的民间用药提供科学依据。

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