吐根酚碱通过Ras信号通路抑制结直肠癌的恶性生物学行为

Cephaeline attenuates malignant biological behaviors of colorectal cancer by regulating the Ras signaling pathway

摘要

目的 探讨吐根酚碱（Cephaeline）抗结直肠癌（CRC）的潜在作用机制。 方法 利用网络药理学获取Cephaeline治疗CRC的核心靶点与信号通路，利用分子对接技术验证CRC关键靶点与Cephaeline的结合能力；以CCK-8法检测2~32 nmol/L Cephaeline处理24、48、72 h后HCT116和DLD-1细胞活力。据此设对照组（0 nmol/L）及低、高浓度组（HCT116：2、4 nmol/L；DLD-1：4、8 nmol/L）处理细胞48 h，通过平板克隆、划痕实验、Transwell和Western blotting分别评估细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡、上皮间质转化、RAS信号通路及相关蛋白表达。 结果 经过网络药理学筛选，Cephaeline主要通过调控丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、血小板衍生生长因子受体β（PDGFRB）等靶点作用于Rap1 信号通路、Ras 信号通路、cAMP 信号通路、PI3K-Akt等信号通路来达到治疗结肠癌的目的。分子对接结果显示Cephaeline与PDGFRB、MAPK1等关键靶点结合能均小于-5 kcal/mol，表明二者可自发且稳定结合。体外实验中，与对照组相比，不同浓度Cephaeline处理后，可观察到以下结果：细胞活力、增殖能力、迁移能力及侵袭能力均随药物浓度的升高呈现降低趋势，表现出浓度依赖性抑制效应（P<0.05）；蛋白表达水平检测显示，增殖细胞核抗原、基质金属蛋白酶 9、血管内皮生长因子C、B细胞淋巴瘤-2蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白、VEGF-A、PDGFRB、MYC原癌基因蛋白、MAPK1蛋白的表达水平出现下降，而E-钙黏蛋白、BCL2相关X蛋白蛋白的表达水平则呈现上升趋势（P<0.05）。 结论 Cephaeline降低CRC的恶性生物学行为可能与RAS信号通路有关联。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of cephaeline for suppressing malignant biological behaviors of colorectal cancer (CRC). Methods Network pharmacology was employed to identify the core targets and signaling pathways of cephaeline in CRC treatment. The binding between the key targets of CRC and cephaeline was simulated using molecular docking. CCK-8 assay was used to assess the viability of HCT116 and DLD-1 cells treated with 2-32 nmol/L cephaeline for 24, 48, and 72 h to determine the optimal treatment condition. The effects of cephaeline treatments (at 2 and 4 nmol/L in HCT116 cells and at 4 and 8 nmol/L in DLD-1 cells) for 48 h on cell proliferation, migration, invasion, epithelial‑mesenchymal transition (EMT), apoptosis, and expressions of RAS signaling pathway proteins were evaluated using colony-forming assay, wound healing assay, Transwell assays, and Western blotting. Results Network pharmacology analysis suggested that cephaeline inhibited CRC mainly by regulating the targets such as MAPK, VEGFA, and PDGFRB and modulating the Rap1, Ras, cAMP, and PI3K-Akt signaling pathways. Molecular docking results showed that the binding energies of cephaeline with PDGFRB and MAPK1 were less than -5 kcal/mol, indicating spontaneous and stable binding between them. In HCT116 and DLD-1 cells, treatment with cephaeline concentration-dependently suppressed the cell viability, proliferation, migration, and invasion, downregulated the expressions of PCNA, MMP9, VEGF-C, BCL-2, N-cadherin, vimentin, VEGF-A, PDGFRB, MYC, and MAPK1, and upregulated the expression levels of E-cadherin and BAX. Conclusion Cephaeline suppresses malignant biological behaviors of CRC possibly by regulating the RAS signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

吐根酚碱 / 网络药理学 / 结直肠癌 / RAS信号通路 / 分子对接

Key words

cephaeline / network pharmacology / colorectal cancer / Ras signaling pathway / molecular docking

结直肠癌是全球第3大常见恶性肿瘤，发病率居高不下，严重威胁人类健康^［1］。目前临床针对CRC的治疗主要依赖手术、化疗、放疗、靶向及免疫治疗等综合手段。尽管早期患者可通过手术获得较好疗效，但晚期或转移性CRC患者由于易产生耐药和复发，治疗效果仍不理想，亟需开发新型有效药物^［2］。近年来，天然产物因其资源丰富、毒性较低及多靶点作用特点，成为抗肿瘤药物研发的重要来源^［3］。吐根酚碱作为源自茜草科植物的主要活性生物碱^［4］，已报道具有抗病毒^［5-7］、抗炎^［8］、抗寄生虫^［9］等多种药理活性。近年来研究还发现，其在肺动脉高压^［10］、认知功能障碍^［11］及多种恶性肿瘤（如黏液表皮样癌、膀胱癌、肺癌等）中均显示出潜在治疗价值^［12-20］。值得注意的是，RAS信号通路作为结直肠癌发生发展和侵袭转移的核心机制之一^［21］，已成为关键治疗靶点。然而，吐根酚碱是否可通过干预RAS通路抑制结直肠癌的恶性进展，目前尚缺乏系统研究。本研究基于结直肠癌治疗需求与吐根酚碱多靶点特性，提出其可能通过调控RAS通路抑制CRC进展的假说。通过“网络预测-分子对接-体外验证”的策略，明确了其核心靶点与作用通路，证实了吐根酚碱对CRC细胞恶性表型的抑制作用及其对RAS通路关键靶点的干预，为后续药物开发提供了机制依据。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

人结直肠癌细胞系HCT116与DLD-1购自武汉普诺赛生命科技有限公司。10%胎牛血清（Gibco）和1%青链霉素混合液（Solarbio）的RPMI 1640培养基（Gibco），在37 ℃、5% CO₂的培养箱培养。

1.2 主要仪器

Neofuge 1600R型台式高速离心机（Heal Force）； HF90型二氧化碳培养箱（Heal Force）；SW-CJ-2FDA型超净工作台（AIRTECH）；DMi1型倒置显微镜（Leica）； Synergy HTX型酶标仪（BioTek）。

1.3 药材和主要试剂

吐根酚碱（（>98%，成都普睿法药物研发有限公司，DMSO（MCE），CCK-8试剂（Ambeed），蛋白Marker（武汉塞维尔生物科技有限公司），SDS-PAGE电泳试剂、转膜试剂、ECL化学发光液（上海圣尔生物科技有限公司），beta-Actin（1∶30000），GAPDH（（1∶40 000），抗E-cadherin（1∶2000）、N-cadherin（1∶1500）、c-Myc （1∶2000）、PCNA（1∶7000）、BCL-2（1∶1000）、BAX （1∶1000）、VEGFA（1∶1000）、MAPK1（1∶1000）、KIT （1∶1000）、PDGFRB（1∶1000），HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶30 000）（Abways）。vimentin（（1∶20 000）、VEGF-C（1∶1000）、MMP9（1∶1000）（Proteintech）。

1.4 网络药理学研究

1.4.1 采用网络药理学预测Cephaeline抗CRC的靶点

分别从SwissTargetPrediction（基于SMILES号）和疾病数据库（GeneCards/OMIM，评分≥5）预测药物与疾病靶点，取交集后获得关键靶点并绘制韦恩图。

1.4.2 PPI网络

基于STRING数据库（置信度≥0.4）和Cytoscape软件，对共同靶点进行PPI网络构建与分析。

1.4.3 对交集靶点进行GO和KEGG通路富集分析

通过DAVID数据库（物种：Homo sapiens）揭示其生物学功能及信号转导作用，并通过微生信平台实现结果可视化。

1.4.4 整合化合物、疾病、靶点与通路间的相互作用关系

利用Cytoscape软件构建调控网络并进行可视化分析。

1.4.5 分子对接

通过网络药理学富集出的77个靶点进行 KEGG 通路富集分析，最终选择与结直肠癌增殖、转移密切相关，且富集于Ras信号通路的关键靶点。从PubChem和PDB数据库分别获取Cephaeline及靶蛋白的3D结构，使用PyMol和AutoDock Tools进行去水、加氢等预处理，最后通过AutoDock完成分子对接，并用PyMOL可视化结果。

1.5 体外实验验证

1.5.1 CCK-8实验

检测不同浓度的Cephaeline对结直肠癌细胞HCT116和DLD-1细胞活力的影响。HCT116和DLD-1细胞以5×10⁴/mL的密度（100 μL/孔）接种于96孔板，贴壁后分别暴露于（0、2、4、8、16、32 nmol/L）Cephaeline中，继续培养24、48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育1~4 h，酶标仪于检测吸光度值A_{450 nm}。实验设空白对照（等体积培养基）及3个复孔，以评估土根酚碱对HCT116和DLD-1细胞的增殖抑制作用。

1.5.2 平板克隆法

检测吐根酚碱对结直肠癌细胞HCT116和DLD-1细胞增殖的影响。消化收集经48 h药物处理的HCT116和DLD-1细胞，并将其以500/孔的密度接种于6孔板。在37 ℃、5%CO₂培养箱内常规培养2周。期间定期更换培养基，集落形成后，经4%多聚甲醛固定20 min、0.1%结晶紫染色30 min，使用ImageJ软件对含50个细胞以上的集落进行计数。

1.5.3 划痕愈合实验

划痕愈合实验 检测吐根酚碱对结直肠癌细胞HCT116和DLD-1细胞迁移的影响消化经药物处理48 h的细胞并制备成单细胞悬液，按5×10⁵/孔接种于6孔板，在37 ℃、5% CO₂条件下培养至形成致密单层。随后，用200 μL无菌移液器吸头在细胞单层上垂直划出划痕，PBS洗涤两次以去除脱落细胞，更换为含1%FBS的RPMI 1640低血清培养基。分别于划痕后0和48 h在显微镜下拍摄划痕区域，使用ImageJ软件测量并计算划痕宽度的相对闭合率。

1.5.4 Transwell实验

检测吐根酚碱对结直肠癌细胞HCT116和DLD-1细胞侵袭的影响在Transwell上室预先包被Matrigel（100 μg/mL，无血清1640稀释）并风干。药物处理48 h后的细胞经消化、计数，用无血清1640培养基调整至2×10⁴/mL。向上室加入200 μL细胞悬液，下室加入500 μL含10%胎牛血清的1640培养基，将24孔Transwell培养板置于37 ℃的培养箱中培养24 h后，细胞经甲醛溶液固定20 min、0.1%结晶紫染色20 min，PBS洗涤后于倒置显微镜下拍照并计数。

1.5.5 Western blotting

检测吐根酚碱对结直肠癌细胞HCT116和DLD-1细胞对细胞增殖、迁移、侵袭、EMT及RAS通路蛋白表达等指标的影响。将经过不同浓度药物处理48 h的HCT116和DLD-1细胞弃去培养基后，细胞经预冷PBS冲洗3次后，加入蛋白裂解液于冰上裂解15 min，最后用细胞刮收集，然后在4 ℃以14 000 r/min的速度离心10 min，使用BCA蛋白检测试剂盒测量总蛋白浓度。在室温下用5%脱脂牛奶封闭硝化纤维素膜2 h。然后在4°下与相应抗体孵育过夜。然后用1×PBS缓冲液洗涤30 min，在室温下加入二抗2 h，洗涤20 min后，加ECL化学发光液，将显色板放入化学发光成像系统中显色。

1.6 统计学分析

主要实验均独立重复3次。计量资料以均数±标准差表示，使用单因素方差分析进行多组间比较，组间两两比较则采用LSD-t检验。所有统计分析均采用SPSS24.0（SPSSInc，USA）及GraphPadPrism8（GraphPadSoftware，USA）软件完成，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 网络药理学结果

2.1.1 通过数据库预测与整合

获得107个Cephaeline靶点及9686个CRC相关靶点，取交集后得到77个核心靶点（图1A），并绘制Venn图。

2.1.2 将77个共有靶点导入STRING数据库构建PPI网络

经Cytoscape可视化（图1B）及拓扑分析（按Degree值降序），筛选出ESR1、JUN、CXCR4等关键靶点（图1C），其在治疗中可能起核心作用。

2.1.3 GO富集分析

获得486个条目（BP303、CC45、MF135）。关键靶点主要参与MAPK、EGFR等信号通路的正向调控（BP）；定位于质膜、突触等（CC）；并具有组蛋白激酶、ATP结合等分子功能（MF）（图1D）。

2.1.4 KEGG富集分析

得到89条通路，其中吐根酚碱可能通过调控Ras、PI3K-Akt、钙信号等关键通路，以及癌症代谢、EGFR耐药等相关通路来治疗CRC（图1E）。

2.1.5 构建的“化合物-疾病-靶点-通路”网络

包含69个节点和308条边。NetworkAnalyzer分析显示，NetworkAnalyze显示Cephaeline主要通过调控PIK3CD、MAPK1、PDGFRA、VEGFA、PDGFRB等靶点作用于钙信号通路、Rap1信号通路、Ras信号通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路来达到治疗CRC的目的（图1F）。

2.1.6 分子对接结果显示

吐根酚碱与PDGFRB、MAPK1等关键靶点结合能均小于-5 kcal/mol（表1），表明二者可自发且稳定结合，亲和性良好，验证了网络药理学预测的可靠性（图2）。

2.2 体外实验结果

2.2.1 吐根酚碱对结直肠癌细胞存活率影响

CCK-8检测结果（图3）显示，经不同浓度Cephaeline处理24、48和72 h后，HCT116和DLD-1细胞的活力均被显著抑制（均P<0.05）。其中，在Cephaeline干预48 h的结直肠癌细胞总体效果最好，并且经16和32 nmol/L的Cephaeline处理的结直肠癌细胞HCT116和DLD-1细胞活力较低，因此选择干预48 h，HCT116（2、4 nmol/L）、DLD-1（4、8 nmol/L）两个剂量的吐根酚碱进行后续实验。

2.2.2 吐根酚碱对结直肠癌细胞增殖能力影响

与对照组相比，吐根酚碱能浓度依赖性地显著抑制HCT116和DLD-1细胞的集落形成能力（P<0.05，图4）。

2.2.3 吐根酚碱对结直肠癌细迁移、侵袭影响

与对照组相比，吐根酚碱能浓度依赖性地抑制伤口闭合速度，表明其迁移能力明显受损（P<0.01，图5），而在transwell Matrigel侵袭实验中，与对照组相比，吐根酚碱能浓度依赖性地抑制侵袭能力，表现为侵袭的细胞数量减少（P<0.01，图6）。Western blotting实验结果显示：吐根酚碱干预完细胞后，与对照组相比，迁移侵袭相关蛋白MMP9和VEGF-C的表达量均显著下降，且呈浓度依赖性（P<0.05，图7）。

2.2.4 不同浓度吐根酚碱对结直肠癌细胞增殖影响

吐根酚碱干预完细胞后，与对照组相比，PCNA和BCL-2的蛋白表达量均显著下降，而BAX蛋白表达量上升，且呈浓度依赖性（P<0.05，图8A）。与对照组相比，上皮标志物E-cadherin的蛋白表达量显著上升，而间质标志物N-cadherin、Vimentin显著下降，且呈浓度依赖性，结果表明药物能够调控EMT相关蛋白的表达，减少上皮表型向间质表型转化（P<0.05，图8B）。与对照组相比，VEGFA、MAPK1、KIT、PDGFRB的蛋白表达量均显著下降，且呈浓度依赖性（P<0.05，图8C）。原癌基因MYC的蛋白表达量显著下降，且呈浓度依赖性（P<0.05，图8D）。

3 讨论

结直肠癌的发生发展进程，与细胞异常增殖分化、肿瘤细胞凋亡抵抗及侵袭转移等多种病理机制密切相关^［22］。增殖细胞核抗原（PCNA）作为表征细胞增殖活性的核心标志物，在CRC组织中呈高表达模式，且可通过调控细胞周期进程推动肿瘤的恶性演进^［23］；MMP9与VEGF-C的高表达，则是增强肿瘤细胞迁移与侵袭能力的关键因素，靶向抑制二者的表达或活性可有效逆转肿瘤细胞的恶性表型^{［24， 25］}。Bax属于调控细胞凋亡的核心促凋亡基因，而定位于线粒体膜上的 Bcl-2，可通过下调细胞内氧化还原电位、阻断 Bax 介导的线粒体膜孔道形成，以及将凋亡蛋白酶活化因子 1（Apaf-1）等凋亡相关蛋白前体锚定至线粒体膜表面等途径，发挥抗凋亡生物学效应^［26］。此外，上皮-间质转化（EMT）不仅是CRC 恶性进展的核心调控环节，更是介导肿瘤细胞获得迁移侵袭能力的重要分子途径^［27］。本研究利用不同浓度吐根酚碱处理HCT116和DLD-1 24、48和72 h后，结果表明HCT116和DLD-1细胞活力均被显著抑制。选择IC₅₀以下最大安全浓度HCT116（2、4 nmol/L）、DLD-1（4、8 nmol/L）两个剂量的吐根酚碱干预48 h进行后续实验。进一步研究发现，药物干预以后的HCT116和DLD-1细胞增殖、侵袭和迁移能力均显著降低，且 E-cadherin、BAX 的蛋白水平升高，PCNA、BCL-2、Myc、Vimentin、VEGF-C、MMP-9、N-cadherin 的蛋白水平降低，表明吐根酚碱能够对HCT116和DLD-1细胞的恶性生物学行为多维度抑制。

既往研究多关注吐根碱类化合物的抗肿瘤活性，而对其作用机制的解析较为浅显^［14-20］。本研究创新性地采用网络药理学与实验验证相结合的策略，首次聚焦吐根酚碱在CRC中的作用，填补了其抗CRC机制的研究空白。相较于传统单一靶点研究，这种“整体通路预测-具体靶点验证”的方法更符合天然产物多靶点协同作用的特点^［28］。通过网络药理学研究发现，吐根酚碱可能通过丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等靶点作用于Ras信号通路等信号通路来达到治疗结直肠癌的目的。 既往研究发现RAS信号通路是结肠癌发生发展的机制之一，也是促进肿瘤侵袭转移的重要途径^［21］。通过网络药理学富集出的77个靶点进行 KEGG 通路富集分析，最终选择与结直肠癌增殖、转移密切相关，且富集于Ras信号通路的四个关键靶点进行分子对接。分子对接结果显示KIT、MAPK1、VEGFA、PDGFRB的Dock score（kcal/mol）分别为-5.79、-6.97、-4、-7.46。值得注意的是，尽管分子对接预测VEGFA结合能较弱，但体外实验证实吐根酚碱可显著下调VEGFA蛋白表达，提示其可能通过下调蛋白表达而非直接强结合的方式发挥作用^［29］。研究发现^［30］，PDGFRB在CRC组织中高表达的，且与结肠癌预后不良有关，提示该靶点是结肠癌治疗靶点之一。同时研究发现拮抗MAPK1等靶点可以改善结肠癌预后^［31］。本研究结果显示药物干预以后PDGFRB、MAPK1、VEGFA、KIT的蛋白表达水平下降，表明吐根酚碱可能通过Ras信号通路降低结直肠癌的恶性生物学行为。

本研究不足的是，现有数据仅能证实吐根酚碱与上述靶点的表达相关性，尚未通过检测 p-MEK、p-ERK 等关键磷酸化分子，明确其对RAS通路激活状态的直接调控作用。尽管本研究初步阐明了吐根酚碱的多靶点作用特征，但仍存在以下局限性：所有研究结论均基于体外细胞实验，缺乏体内动物模型的验证，无法准确评估其体内药效与组织分布特征；未检测 RAS 通路核心磷酸化分子的表达与活化水平，难以明确吐根酚碱对通路激活状态的直接调控效应；尚未借助表面等离子体共振（SPR）、基因编辑等直接实验手段，确证PDGFRB与MAPK1为吐根酚碱的直接作用靶点；吐根酚碱作为天然抗肿瘤先导化合物，其临床转化面临心脏与消化道毒性。未来可通过结构修饰（引入亲水基团）或靶向递送（如叶酸修饰纳米粒）实现减毒增效^［32］。本研究系统阐明了吐根酚碱通过多靶点协同作用抑制CRC细胞恶性生物学行为的分子机制，其“网络预测-实验验证”的研究策略为天然产物机制研究提供了可借鉴的范式。未来研究可进一步开发吐根酚碱衍生物以提高靶向性，或探索其与现有靶向药物的协同治疗效果，为CRC的天然药物研发提供新思路。

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