温肾养肝方通过调节肠道生物活性物质改善帕金森病模型小鼠的肠道功能

Wenshen Yanggan Decoction improves intestinal function in mouse models of Parkinson's disease by regulating intestinal bioactive substances

摘要

目的 探讨温肾养肝方（WSYG）对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的帕金森病（PD）模型小鼠肠道功能影响及其作用机制。 方法 60只雄性C57BL/6J小鼠随机分6组（n=10）：对照组（Control）、MPTP组（MPTP）、WSYG低剂量组（MPTP+L，10 g·kg^-1·d^-1）、WSYG中剂量组（MPTP+M，20 g·kg^-1·d^-1）、WSYG高剂量组（MPTP+H，40 g·kg^-1·d^-1）和司来吉兰组（MPTP+S，10 mg·kg^-1·d^-1），对照组及MPTP组予以等量纯水灌胃。除对照组外，其余组采用连续6 d腹腔注射MPTP（30 mg·kg^-1·d^-1）构建亚急性PD模型。采用爬杆和旷场实验检测运动功能；免疫组化检测纹状体酪氨酸羟化酶（TH）水平，H E/尼氏染色观察神经元损伤；HE染色评估肠组织病理，ELISA检测二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-LA）、脂多糖（LPS）及血管活性肠肽（VIP） 、胆囊收缩素（CCK）水平，免疫荧光分析闭锁小带蛋白-1 （ZO-1）、闭合蛋白（Occludin），FITC-右旋糖酐（4000 MW）测定肠屏障通透性。 结果 WSYG各组均显著缩短爬杆实验转身和总时间（P<0.0001）；中、高剂量提升旷场实验总距离及速度（P<0.05）。WSYG各组减轻黑质及纹状体区神经损伤及尼氏小体丢失；中、高剂量显著增加纹状体区TH阳性神经元（P<0.05）。WSYG各组显著降低血清FITC-右旋糖酐浓度（P<0.05）；中、高剂量缓解了结肠炎症浸润，提高绒隐比（P<0.05），减少ZO-1/Occludin缺失（P<0.05）；WSYG各组显著上调VIP、CCK水平，下调DAO、D-LA及LPS水平（P<0.05）。 结论 温肾养肝方不仅能有效缓解PD小鼠的运动障碍，还能缓解肠道功能紊乱，其作用可能与调节肠道生物活性物质（上调VIP/CCK，下调DAO/D-LA/LPS）、降低肠屏障通透性，进而减轻多巴胺能神经元损伤有关，且高剂量的疗效最为显著。

Abstract

Objective To explore mechanism of Wenshen Yangan Decoction (WSYG) for improving intestinal function in a mouse model of Parkinson's disease (PD) induced by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP). Methods Sixty male C57BL/6 mice were randomized equally into control group, MPTP group, low-, medium-, and high-dose WSYG groups (daily dose 10, 20 and 40 g/kg by gavage, respectively), and selegiline group. In all but the control group, the mice received intraperitoneal injections of MPTP (30 mg/kg) for 6 consecutive days to induce subacute PD. Motor function of the mice was assessed by the pole and open field tests, and striatal tyrosine hydroxylase (TH) expression, neuronal damage and intestinal histopathology were evaluated using immunohistochemistry, Nissl staining, and HE staining. Serum levels of diamine oxidase(DAO), D-lactic acid (D-LA), lipopolysaccharide (LPS), vasoactive intestinal peptide (VIP), and cholecystokinin (CCK) were measured by ELISA, intestinal expressions of tight junction proteins zonula occludens-1 (ZO-1) and occludin were an alyzed by immuno fluorescence staining, and intestinal barrier permeability was assessed using FITC-dextran. Results WSYG, especially at the medium and high doses, significantly improved the performance of the mice in the behavioral tests. WSYG at all the 3 doses reduced neuronal damage and Nissl body loss in the striatum and substantia nigra, its medium and high doses significantly increased TH-positive neurons in the striatum. WSYG at the 3 doses significantly decreased serum FITC-Dextran (MW 4000) level, and medium- and high-dose WSYG markedly alleviated colonic inflammatory infiltration and edema, increased the chorionic crypt ratio, and reduced loss of ZO-1 and occludin. WSYG at all the 3 doses significantly increased serum VIP and CCK levels and decreased DAO, D-LA and LPS levels in the mice. Conclusion WSYG effectively improve motor deficits and intestinal dysfunction in PD mice possibly by up-regulating intestinal VIP/CCK and down-regulating DAO/D-LA/LPS expressions to reduce intestinal barrier permeability, thereby alleviating dopaminergic neuronal damage.

Graphical abstract

关键词

温肾养肝方 / 帕金森病 / 肠道功能 / 神经保护

Key words

Wenshen Yangan Decoction / Parkinson's disease / intestinal function / neuroprotection

帕金森病（PD），又常称之为震颤麻痹，是临床发病率仅次于阿尔茨海默病的第2大中枢神经系统退行性疾病^［1］。PD的患病率随着年龄的增长而增加，在中国60岁以上人群的患病率为1.37%^［2］，并且在全球的发病率也呈持续上升态势^［3］，其带来的影响远超人口老龄化^［4］。PD临床表现包括运动症状（如静止性震颤）和非运动症状（如便秘、嗅觉减退）^［5］。值得注意的是，胃肠道功能障碍常早于运动症状发生，提示肠道可能是PD的起源部位^［6］。这些症状严重损害患者日常生活能力，更显著降低其生活质量^［7］。目前PD发病机制尚未完全阐明，临床治疗以对症为主，仍缺乏有效手段延缓进程^［8，9］。从中医理论来看，PD多归属于“颤证”“内风”等范畴，其核心病机与肝肾亏虚密切相关。“肾司二便，开窍于二阴”，肾精亏虚则髓海不足、肠腑失润；“诸风掉眩，皆属于肝”，肝失疏泄则气机郁滞、肠气壅塞，二者共同导致肠道传导失常及神机失用，这为从“肠-脑轴”角度探讨PD病理机制提供了理论基础。基于“温补肝肾”这一治则，本课题组既往采用温肾养肝方（WSYG）干预PD，在改善运动及非运动症状方面显示出良好疗效^{［10，11］}。为此，本研究拟从肠-脑轴途径入手，探讨WSYG对PD肠道屏障功能及神经保护的调控机制，旨在从现代医学角度阐释其作用环节，为临床应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体（SPF）级健康雄性C57BL/6J小鼠60只，8周龄，体质量22~26 g，采购于江苏华创信诺医药科技有限公司，实验动物许可证号：SYXK（苏）2023-0077。每笼饲养5只鼠，小鼠自由进食进水，室温20~25 ℃，湿度40%~50%，12 h/12 h昼夜节律。本实验已通过南京中医药大学动物伦理委员会审批（伦理批号：ACU230904）

1.1.2 实验药品

WSYG（肉苁蓉30 g、炒白芍20 g、乌药20 g、益智仁30 g、淮山药20 g、钩藤20 g）草药购买自南京市中医院中药房并由其代煎，WSYG的给药剂量参考本课题组前期研究确定的有效剂量，高剂量溶液浓缩至含生药4 g/mL，中剂量溶液浓缩至含生药2 g/mL，低剂量浓缩至含生药1 g/mL^［10］。盐酸司来吉兰片（5 mg/片，Orion Corporation），溶解后配成0.01 g/kg溶液，现配现用。

1.1.3 实验试剂

1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP，上海源叶生物科技有限公司）；小鼠血管活性肠肽（VIP）、小鼠二胺氧化酶（DAO）、小鼠胆囊收缩素（CCK）、小鼠脂多糖（LPS）酶联免疫吸附检测试剂盒（ELK Biotechnology）、D-乳酸（D-LA）比色法测试盒（Elabscience Biotechnology）；酪氨酸羟化酶（TH）多克隆抗体、ZO-1多克隆抗体、Occludin多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）、异硫氰酸荧光素-葡聚糖（MW 4000，Sigma-Aldrich）

1.2 动物分组及造模

将小鼠随机分为6组：对照组（Control）、MPTP模型组（MPTP）、WSYG低剂量组（MPTP+L）、WSYG中剂量组（MPTP+M）、WSYG高剂量组（MPTP+H）和司来吉兰阳性对照组（MPTP+S），每组10只，适应性喂养7 d。中药组分别予WSYG低、中、高溶液（10、20、40 g·kg^-1·d^-1）灌胃，对照组和司来吉兰组分别予纯水和司来吉兰（10 mg·kg^-1·d^-1）灌胃。7 d后对照组予生理盐水腹腔注射，其余组小鼠腹腔注射MPTP（30 mg·kg^-1·d^-1），1次/d，连续造模6 d，小鼠出现肢体震颤、弓背向上、毛发悚立等症状即为造模成功^［12］。造模成功后继续给药5 d，第6天杀鼠取材。每组随机选取4只小鼠进行行为学实验，其余用于其他实验。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 行为学实验

1.3.1.1 旷场实验

测试前将小鼠放在测试房间适应2 h，测试时间为5 min，每只鼠只测试1次，测试时，将小鼠置于旷场中央区域，每只鼠测试后，用75%酒精擦拭旷场装置内壁，去除测试小鼠残留气味。记录小鼠运动总路程及时间。

1.3.1.2 爬杆实验

将长度50 cm，直径1 cm的木杆置于实验台上，顶端固定直径2 cm的软球，将小鼠放置于顶部，头部向上，记录小鼠转头朝下所需时间及爬杆总时间，重复3次，两次实验间隔至少10 min。测试中小鼠如有停顿，或总时长超过30 s或反向攀爬均重新测试。

1.3.2 尼氏染色和HE染色

将小鼠脑组织及结肠取出后多聚甲醛浸泡固定，石蜡包埋切片，选取脑黑质、纹状体以及结肠的切片进行脱蜡、染色、封片等步骤。脑片采用HE及尼氏染色，结肠HE染色，封片后镜检，图像采集分析，测量小鼠结肠平均绒毛长度：从绒毛顶端到隐窝开口处的垂直距离。使用CaseViewer软件测量一圈完整长绒毛的长度，计算绒毛长度的平均值，作为该样本的平均绒毛长度。平均隐窝深度：肠隐窝是小肠上皮在绒毛根部下陷至固有层而形成的管状腺，开口于相邻绒毛之间，测量结肠隐窝深度取平均值。

1.3.3 免疫组织化学染色（IHC）

将小鼠脑组织放入多聚甲醛固定，石蜡包埋，选取纹状体脑片进行切片，经过脱蜡、抗原修复、一抗TH抗体（1∶4000）孵育等步骤后封片，完成后显微镜下观察、拍照。

1.3.4 免疫荧光染色（IF）

取出小鼠结肠后多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，经过脱蜡、抗原修复、一抗ZO-1（1∶500）、Occludin（1∶200）孵育等步骤后封片，完成的切片放入显微镜下观察拍照。

1.3.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）

小鼠麻醉后取心尖血，离心机分离出血清，根据ELISA试剂盒说明书步骤进行检测，其中，生物素抗体及HRP抗体均按1∶100稀释，酶标仪测量血清细菌内毒素LPS、DAO、D-LA、CCK及VIP光密度A_{450 nm}。

1.3.6 采用FITC-dextran法测肠通透性

小鼠禁食4h，配置FITC-dextran溶液（50 mg/mL），FITC-dextran灌胃剂量为500 mg/kg，灌胃4 h后取心尖血，离心分离出血清后使用酶标仪测定，读取荧光值（Ex：490 nm，Em：520 nm），根据荧光强度计算FITC-Dextran浓度。

1.3.7 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.5软件统计并作图。统计数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。当P<0.05时，表示数据差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠行为学评估

旷场实验结果显示MPTP组小鼠总运动距离及平均速度较Control组显著下降（P<0.0001）；WSYG中、高剂量组上述指标显著升高（P<0.05）。爬杆实验结果显示MPTP组爬杆总时间及转身时间较Control组显著延长（P<0.0001）；WSYG各剂量组均能显著缩短上述时间参数（P<0.0001，图1）。

2.2 各组小鼠黑质/纹状体区神经元检测

组织病理学分析显示（图2），Control组黑质及纹状体区结构清晰，神经元形态规整、分布均匀；MPTP组神经元数量显著减少，排列紊乱，伴胞质深染、核固缩等变性特征，尼氏小体大量丢失；WSYG各剂量组神经元病理损伤减轻，尼氏小体数量部分恢复；剂量依赖效应：随浓度升高，神经元存活率呈上升趋势（高剂量组>中剂量组>低剂量组）。

2.3 各组小鼠纹状体TH水平检测

与Control组相比，MPTP组小鼠纹状体区TH阳性纤维、阳性神经元数量明显下降（P<0.001）。另外，WSYG中、高剂量组纹状体区的TH阳性纤维、阳性神经元增多（P<0.05），而WSYG低剂量组与MPTP组比较无统计学意义（图3）。

2.4 各组小鼠结肠形态学观察

小鼠结肠HE染色结果显示（图4），Control组肠粘膜和平滑肌结构完整，界限清晰，肠绒毛呈柱状向肠腔整齐排列，未见脱落组织，未见炎症浸润，未见水肿；MPTP组肠粘膜结构受损，黏膜肌层与固有层界限不清晰，有炎性浸润和粘连；肠绒毛皱缩变短、柱状细胞排列紊乱，绒毛水肿，肠腔扩张。中药给药后，MPTP+L组可见肠粘膜上皮细胞脱落，炎症浸润，肠粘膜边界不清晰，柱状细胞排列紊乱；肠腔扩张并未见改善，但肠绒毛水肿减轻；MPTP+M组偶见肠绒毛脱落，柱状细胞排列紊乱，肠腔扩张和绒毛水肿及炎症情况得到改善；MPTP+H组绒毛未见脱落，偶见绒毛皱缩，柱状细胞向肠腔整齐排列，未见水肿和炎症浸润。此外，温肾养肝方中、高剂量绒隐比均高于MPTP组（P<0.05）。

2.5 各组小鼠肠通透性检测

ZO-1/Occludin的免疫荧光结果显示（图5）MPTP组表达量较Control组显著下调（P<0.01）；WSYG中、高剂量组表达量明显回升（P<0.05），而低剂量组则无统计学差异。FITC-dextran检测结果显示，MPTP组较Control组浓度显著升高（P<0.0001）；WSYG各剂量组血清中FITC-dextran浓度均降低（P<0.05），其中WSYG中、高剂量组降低为显著（P<0.0001）。

2.6 各组小鼠肠功能评估

与Control组相比，MPTP模型组小鼠的LPS、DAO及D-LA浓度显著升高（P<0.0001），WSYG各剂量组均能显著降低上述肠屏障损伤标志物的浓度（P<0.05），且高剂量组的降低幅度最为显著（P<0.0001）。与Control组相比，MPTP模型组小鼠的CCK和VIP浓度显著下降（P<0.0001）。WSYG各剂量组均能显著提升CCK和VIP的水平（P<0.05），其中高剂量组的提升效果最为显著（P<0.0001，图6）。

3 讨论

WSYG立足于中医对PD“肾阳虚、肝阴虚”的核心病机认识，由赵杨教授谨守此病机，结合其多年临证经验，悉心立法组方而成。WSYG以肉苁蓉（大芸）为君，功擅补肾益精、润肠通便；方用炒白芍养血柔肝、平抑肝阳；乌药散寒行气；益智仁温脾暖肾；淮山药健脾益肺，补肾固精；钩藤清热平肝，息风止颤^［13］。全方配伍兼顾肝肾同治与肠脑并调，既滋肾填精以荣脑髓，又疏肝息风以缓颤振，尚能润肠通滞以祛浊邪，在中医理论层面，为从“肠-脑轴”角度切入探讨PD治疗机制，提供了重要的理法依据。同时，现代药理学研究也为WSYG的多成分、多靶点调节作用提供了支持。肉苁蓉中的松果菊苷类成分具有减轻神经炎症、缓解肠道氧化应激和炎症反应的作用^{［14， 15］}。炒白芍所含芍药苷能够调节肠道菌群及促进肠粘膜再生^{［16， 17］}；钩藤生物碱则已被证实不仅具有保护神经作用并且能优化肠道菌群组成^{［18， 19］}。上述药效学证据提示，WSYG可能通过神经保护、胃肠调节、抗炎及屏障修复等多途径发挥协同作用，从而在改善PD运动症状的同时恢复肠道功能，为本研究从肠-脑轴角度探讨其改善PD肠道功能及发挥中枢神经保护作用的机制提供了理论依据。

MPTP是一种选择性破坏DA能神经元的神经毒素，广泛用于PD动物模型构建^{［20， 21］}。本研究中，PD模型小鼠在出现显著运动障碍的同时，伴随有明显的肠道功能障碍，表现为爬杆转头和总时间延长、旷场总距离和速度减少；结肠HE出现明显炎症水肿，肠黏膜屏障受损；此外，FITC-dextran及ZO-1/Occludin荧光检测提示肠通透性增高。上述结果提示成功构建伴有肠功能障碍的PD模型。

WSYG通过保护DA能神经元改善PD小鼠运动障碍。PD显著的病理学特征是黑质和纹状体中多巴胺能神经元的缺失以及α-突触核蛋白的异常聚集^［22-24］。本研究显示WSYG显著缩短爬杆时间，并且中、高剂量改善旷场运动指标。这提示WSYG能够有效改善PD小鼠运动功能障碍，且呈剂量依赖性效应。TH是脑内DA能神经元的标记物，是合成DA的限速酶^{［25， 26］}。PD小鼠纹状体TH表达量明显下降；而中、高剂量提高了TH水平，并且HE及尼氏染色发现WSYG抑制了脑神经元的损伤和尼氏体缺失。这提示WSYG之所以改善PD小鼠运动障碍，与其保护DA能神经元有关。

WSYG通过维持肠道屏障功能、减轻肠道炎症反应延缓PD进程。近年来，随着“肠-脑轴”的提出，越来越多证据表明，肠道屏障功能受损以及肠道炎症可能对PD的发生发展起着至关重要的作用^［27］，并且便秘等肠道症状可能先于PD诊断10年以上^［28］。研究提出肠屏障损伤后病原体入侵是PD的病因之一，肠通透性增加导致微生物产物及炎症因子进入循环系统，破坏血脑屏障、引发全身炎症，从而推进PD进展^{［29， 30］}。紧密连接蛋白是血脑屏障、肠黏膜屏障的重要结构，能够有效防止有害物质渗透，包括ZO-1、Occludin等。研究发现肠道细菌、炎症因子等均可引起ZO-1/Occludin异常表达^［31］。此外，DAO、D-LA、LPS是肠屏障功能的敏感指标，其在血清中水平反映了肠黏膜和通透性变化^［32］。本研究结果显示，PD小鼠结肠出现炎性浸润、绒毛水肿及细胞排列紊乱等病理损伤，WSYG中、高剂量治疗后上述病理损伤显著减轻，并且ZO-1/Occludin表达增高。此外，各剂量组血清中DAO、D-LA、LPS及FITC-dextran水平下降，表明其能够有效恢复肠道通透性。WSYG可通过双重途径改善PD小鼠肠道屏障功能。一方面上调肠紧密连接蛋白ZO-1/Occludin表达增强机械屏障完整性；另一方面降低LPS负荷及血清DAO/D-LA水平以改善化学屏障功能，从而减轻肠道通透性，在PD治疗中发挥保护作用。

WSYG通过调节脑肠肽，对PD小鼠的中枢神经和肠道功能发挥双重保护作用。肠道和大脑之间存在双向调控作用，中枢神经系统通过神经、免疫等途径调控肠道，同时肠内产生的神经肽、神经递质等反过来又会影响大脑。脑肠肽是一类在脑和胃肠道中双重分布的小分子多肽，并在脑和肠中均发挥重要的调节作用，其中包括VIP和CCK。CCK是大脑中最丰富的神经肽，黑质-纹状体在释放DA时，也同时释放CCK，研究证实当脑内CCK升高时，DA释放也会提高，CCK通过影响DA传出通路干预PD进展^［33］。神经炎症是PD发生的关键机制，其中小胶质细胞和星形胶质细胞在调节神经炎症反应中起着至关重要的作用^［34-36］，研究发现VIP可以通过调节小胶质细胞和星形胶质细胞，发挥神经保护作用^［37］。此外，VIP和CCK还可以通过调节肠道微环境，修复肠屏障损伤并维持其结构完整性^［38］，从而干预PD进展。本研究中，MPTP诱导的PD模型小鼠血清中VIP、CCK水平显著降低，提示肠脑信号传递障碍可能参与PD病理进程。经WSYG干预后，VIP与CCK表达均明显回升，表明WSYG具有调节肠源性神经肽的能力。VIP与CCK作为关键的肠脑信号调节因子，不仅参与维持肠道动力功能与屏障稳态，还能够通过循环或神经途径向中枢系统传递保护性信号。上述结果表明，WSYG可能通过促进具有神经保护及抗炎特性的肠源活性分子VIP与CCK的释放，增强肠道屏障功能，减少肠源性毒素入血，进而发挥对PD的系统治疗效应。

本研究结果表明，WSYG干预PD模型小鼠肠道功能改善及运动障碍缓解具有显著相关性。然而，受限于预防性给药方案，该结果主要确立了WSYG治疗与上述改善效应之间的关联性，但尚不足以推断明确的因果关系。经本实验推测，PD病程中中枢神经损伤与肠道功能障碍之间构成了相互影响的恶性循环，而WSYG可能通过多靶点干预打破该循环。值得注意的是，本研究观察到WSYG处理后肠道紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin）的表达呈现调控趋势，其机制可能涉及修复肠道屏障功能，调节肠道生物活性物质（下调DAO/D-LA/LPS），从而减少肠源性毒素进入中枢系统，最终发挥保护神经及改善运动作用。但当前研究对WSYG调控下游信号通路探索仍不充分，机制阐释深度尚且不足。为进一步明确肠-脑调控通路的时序性与因果逻辑，未来研究需结合造模后延迟给药以动态追踪肠脑病理演变时序，并利用肠道屏障关键蛋白特异性调控策略及基因敲除动物等动物实验，系统阐明WSYG调控肠-脑轴通路的分子机制，从而为肠-脑轴的中医理论提供现代生物学依据。

综上所述，温肾养肝方（WSYG）对MPTP诱导的PD模型小鼠具有多靶点协同保护作用。具体表现为：在运动功能层面，可显著提升PD小鼠运动能力，缩短爬杆时间并增加旷场的运动距离与速度；在神经保护层面，能有效减少DA能神经元的丢失，缓解神经元损伤；在肠屏障修复层面，可降低肠道通透性（表现为血清FITC-dextran水平下降），上调紧密连接蛋白ZO-1与Occludin的表达，并通过双向调节血清生物标志物（升高VIP/CCK，降低DAO/D-LA/LPS）激活肠-脑轴。并且其治疗效应呈现剂量依赖性，其中高剂量组的作用最为显著。结果提示，WSYG可能通过调控“肠-脑轴”，协同改善肠屏障功能与中枢神经损伤，为PD的临床治疗提供了新思路。

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基金资助

国家中医药管理局国家卫生健康委员会中央军委后勤保障部重大疑难疾病中心临床协作项目(ZDYN-2024-A-130┫南京市医学科技发展项目┣YKK22173)

2024南京市中医药青年人才培养项目(NJSZYYQNRC-2024)

蔡定芳南京市中医院岐黄学者工作站(QHXZGZZ-2023-CDF)

第六批南京市老中医药专家学术经验继承项目(2024NJLPSC)

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