菌群移植通过调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制小鼠结肠肿瘤生长

Fecal microbiota transplantation inhibits colonic tumor growth in mice by suppressing the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway

摘要

目的 通过菌群移植（FMT）调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探索其对免疫功能和肿瘤抑制作用的影响。 方法 将C57BL/6N小鼠分成空白对照组、荷瘤模型组和FMT干预组，6只/组。荷瘤模型组接种MC38结肠癌细胞构建荷瘤模型，FMT干预组在构建CRC荷瘤模型同时给予0.1 mL菌液1次/d灌胃至实验结束，荷瘤模型组和空白对照组等剂量无菌生理盐水灌胃作对照。记录小鼠肿瘤质量及体积，流式细胞术检测小鼠外周血NK细胞水平及NKG2A、NKG2D受体表达情况，酶联免疫吸附法检测小鼠血清中脂多糖（LPS）水平；通过JASPAR分析NF-κB与TGF-β1基因启动子的结合能力。Rt-qPCR检测TLR4、MyD88、NF-κB mRNA、穿孔素、颗粒酶表达情况。Western blotting检测TLR4、MyD88、NF-κB、TGF-β1蛋白表达情况。16S高通量测序对小鼠肠道菌群进行检测和分析。 结果 肿瘤质量、体积结果显示FMT干预组均显著低于荷瘤模型组（P<0.05）；流式结果显示，荷瘤模型组和FMT干预组外周血中CD3^-NK1.1⁺均显著下降（P<0.05）；荷瘤模型组外周血中CD3^-NKG2A⁺表达显著升高而CD3^-NKG2D⁺表达显著下降（P<0.05）；经FMT干预后外周血中CD3^-NKG2A⁺表达下调而CD3^-NKG2D⁺表达上调（P<0.05）；荷瘤模型组小鼠血清LPS水平显著高于FMT干预组小鼠血清LPS水平为和空白对照组（P<0.05）；分子对接结果表明，蛋白LPS和蛋白TLR存在结合位点，结合能为-13.1 kcal/mol；JASPAR分析结果显示NF-κB与TGF-β1基因启动子区多个位点结合并调控其转录；RT-qPCR结果显示FMT干预后肿瘤组织中穿孔素、颗粒酶mRNA表达增高（P<0.05），结肠组织和肿瘤组织中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达降低（P<0.05）；Western blotting结果显示经FMT干预后结肠、肿瘤组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达显著降低（P<0.05），肿瘤组织中TGF-β1蛋白表达下调（P<0.05）。菌群检测结果分析，荷瘤成功后小鼠肠道菌群多样性明显下降，Chao1指数、Ace指数及Shannon指数中位数差异显著（P<0.05）。荷瘤模型组Proteobacteria（变形菌门）相对丰度显著增高（P<0.05），Lactobacillus murinus（鼠乳杆菌）相对丰度显著降低（P<0.05），经FMT干预后可恢复至正常水平，与空白对照组相比，相对丰度无明显差异（P>0.05）。 结论 FMT可调节荷瘤小鼠肠道Proteobacteria（变形菌门）、Lactobacillus murinus（鼠乳杆菌）相对丰度，通过影响TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，降低TGF-β1表达，促进NK细胞活化发挥抑瘤作用。

Abstract

Objective To explore the effects of fecal microbiota transplantation (FMT) on immune function and tumor inhibition in mice. Methods C57BL/6N mice were divided into blank control group, tumor bearing model group, and FMT intervention group (n=6). In the latter two groups, the mice bearing subcutaneous MC38 colon cancer cell xenografts were treated with daily gavage of normal saline or 0.1 mL of bacterial suspension. The changes in tumor mass and volume were recorded, and peripheral blood natural killer (NK) cell counts and NKG2A and NKG2D receptor expressions were analyzed using flow cytometry; serum lipopolysaccharide (LPS) levels were measured with ELISA. The binding ability of NF‑κB to the TGF‑β1 gene promoter was analyzed with JASPAR. The mRNA and protein expressions of TLR4, MyD88, NF‑κB, TGF‑β1, perforin and granzyme in the tumor tissues were detected using RT qPCR and Western blotting, and the changes in gut microbiota were analyzed using 16S high throughput sequencing. Results FMT significantly reduced tumor mass and volume in the tumor-bearing mice. Peripheral CD3⁻NK1.1⁺ cell counts were significantly decreased in the tumor-bearing mice regardless of FMT treatment, which, however, reversed the increase of CD3^-NKG2A⁺ cells and reduction of CD3^-NKG2D⁺ cells and reduced serum LPS levels in the mouse models. Molecular docking and JASPAR analysis confirmed LPS-TLR4 binding (binding energy: -13.1 kcal/mol) and identified NF-κB binding sites on TGF‑β1 promoter. FMT downregulated mRNA and protein expressions of TLR4, MyD88, NF‑κB and TGF‑β1 and upregulated perforin and granzyme mRNA expressions in the xenografts. FMT also restored gut microbiota diversity and composition, and reversed the increase of Proteobacteria and decrease of Lactobacillus murinus in the tumor-bearing mice. Conclusion FMT modulates the relative abundances of intestinal Proteobacteria and Lactobacillus murinus in tumor-bearing mice, and inhibits tumor growth by suppressing the TLR4/MyD88/NF‑κB signaling axis, down-regulating TGF-β1 expression, and promoting NK cell activation.

Graphical abstract

结直肠癌（CRC）作为全球发病率第3位，中国发病率第2位的恶性肿瘤^［1］，其肿瘤微环境的免疫抑制状态是制约免疫治疗效果的核心瓶颈^［2］。近年研究表明，肠道菌群紊乱可导致肠道屏障功能受损，增加肠道通透性，使细菌及其代谢产物（如脂多糖）进入血液循环系统，激活全身炎症反应和影响免疫细胞功能来促进肿瘤发生发展^{［3， 4］}。革兰氏阴性菌外膜的主要成分脂多糖（LPS）是关键的病原体相关分子模式，能被Toll样受体4（TLR4）识别^［5］，进而招募髓样分化因子88（MyD88）激活核因子κB（NF-κB）信号通路^［6］。而LPS/TLR4/NF-κB信号轴可诱导TGF-β系统性的升高^［7］，导致自然杀伤细胞（NK细胞）发生表型转换：表现为NKG2D等活化性受体表达下调、穿孔素/颗粒酶分泌减少，同时伴随PD-1等免疫检查点分子上调，形成独特的代谢性免疫耗竭状态^{［8， 9］}。这种TGF-β1-NK细胞轴的异常调控不仅削弱固有免疫监视，更通过表观遗传重塑诱导肿瘤干细胞，构成CRC复发转移的重要生物学基础^［10］。

粪菌移植（FMT）作为新兴的微生态干预手段，已被证实可通过重建其肠道微生态平衡，在艰难梭菌感染、炎症性肠病等肠道相关疾病中展现出显著疗效^［11］。最新研究提示，FMT能够增强PD-1抑制剂疗效以及降低化疗药物引起的毒性作用^［12］。另外在帕金森病小鼠模型中，FMT已被证明能够通过恢复肠道微生物群平衡，进而减轻TLR4介导的炎症反应，对小鼠产生保护作用^［13］。其现在调控TLR4/MyD88/NF-κB-TGF-β1-NK细胞轴中的具体机制尚未明确。

本研究拟通过建立CRC移植瘤模型，观察FMT调节肠道菌群对TLR4/MyD88/NF-κB-TGF-β1通路的影响、NK细胞功能的重塑及体内抗肿瘤效应的调控作用，为建立基于微生态-免疫协同调控的CRC精准治疗新策略提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂及仪器

胎牛血清（Gibco）；青霉素-链霉素100×、0.25%胰蛋白酶（新赛美）；蛋白抗体TLR4、MYD88、NF-κB p65、TGF-β1、β-actin、RIPA裂解液（货号：G2002）、5X上样缓冲液（货号：G2075）（武汉赛维尔生物）；FITC-CD3、APC-NK1.1（Elabscience）；APC-NKG2D、PE-NKG2A（BioLegend）；BCA蛋白定量检测试剂盒、小鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒（索莱宝）；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、qPCR SuperMix试剂盒（Promaga）；飞敏™型ECL发光液（上海圣尔生物科技有限公司）；MC38小鼠结肠癌细胞（苏州海星生物科技有限公司）；CFS96实时荧光定量PCR仪（Bio-Rad）；流式细胞机（BD）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

雄性SPF级C57BL/6N小鼠，6~8周龄，体质量为18~22 g，购自北京斯贝福生物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2024-0001］。根据小鼠体质量，按照随机数分配、余数归组法分为空白对照组（Control）、荷瘤模型组（Model）、FMT干预组（FMT），6只/组。实验动物适应性饲养1周，自由摄取水和饲料，动物房温度控制在（20±5）℃，湿度控制在（55±5）%，12 h光暗循环。所有实验均在河北工程大学附属医院中心实验室SPF级环境中完成［SYXK（冀）2023-001］。动物实验伦理经河北工程大学医学院生物伦理委员会审核通过（伦理批号：BER-YXY-2024025）。

1.2.2 动物造模

采用RPMI 1640培养基、10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的培养基体系培养MC38小鼠结肠癌细胞。收集对数生长期细胞，取0.1 mL细胞浓度为1×10⁷/mL细胞悬液接种于FMT干预组、荷瘤模型组小鼠右前肢背部皮下（第1天），每日观察接种部位，可触及皮下肿物则视为造模成功。造模成功后灌胃操作两周，取出肿瘤组织称量并测量体积，计算脾脏指数，脾脏指数=脾脏质量（mg）/体质量（g）×100%。

1.2.3 菌液干预

在适应性饲养期间，每天收集小鼠新鲜粪便备用，按照粪便质量（200 mg）：生理盐水体积（1 mL），组织研磨器混匀进行溶解，4 ℃下3000 r/min，离心30 s，以去除滤出的不溶解的大颗粒物质，小心吸取上清液，制作干预菌液备用^［14］。FMT干预组皮下接种肿瘤细胞后（第1天）使用小鼠灌胃针按照0.1 mL菌液灌胃，1次/d，连续灌胃至实验结束。空白对照组、荷瘤模型组按照相同剂量和方法给予生理盐水灌胃至实验结束。

1.2.4 流式细胞检测

小鼠麻醉后采集适量心脏血液于EDTA抗凝管中，按照淋巴细胞分离液方法提取淋巴细胞，经离心洗涤后调整为1×10⁷/mL。取100 μL细胞悬液分别加入流式检测管中，并加入相应FITC-CD3+APC-NK1.1、FITC-CD3+APC-NKG2D、FITC-CD3+PE-NKG2A，4℃避光孵育后洗涤重悬，行细胞流式上机检测。

1.2.5 外周血中LPS检测

小鼠麻醉后采集适量心脏血液于1 mL离心管中，静置、离心后收集血清，以ELISA法检测小鼠外周血中LPS含量。

1.2.6 LPS与TLR4分子对接预测

使用HDOCKlite1来预测蛋白LPS和蛋白TLR4的结合方式。使用PDB数据库获取结构文件，使用PyMol2.5.32进行去除非蛋白结构处理。对接时以HDOCK的默认配置进行全局刚性对接研究。完成对接后采用基于最佳结合能的结合模式采用PyMOL 2.5.3进行可视化分析。

1.2.7 小鼠结肠及肿瘤组织相关基因表达检测

二氧化碳深度麻醉处死小鼠后收集小鼠结肠及瘤体组织于-80 ℃冰箱保存备用。使用Eastep Super总RNA提取试剂盒提取RNA，利用GoScript逆转录试剂盒进行逆转录以获得cDNA，利用Primer软件对GAPDH、TLR4、MYD88、NF-κB p65、穿孔素、颗粒酶引物进行设计并由武汉赛维尔生物合成（引物序列见表1）。使用GoTaq PCR Master Mix试剂盒以GAPDH为内参，进行RT-qPCR扩增并检测其转录水平。采用2^-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量并进行差异比较分析。

1.2.8 NF-κB结合TGF-β1启动子位点预测

通过Genebank检索TGF-β1基因上游2500bp位点，使用JASPAR（https：//jaspar.elixir.no/）分析NF-κB与TGF-β1基因上游2500bp处启动子的结合位点。

1.2.9 小鼠结肠及肿瘤组织相关蛋白表达检测

取适量小鼠肠道组织及肿瘤组织提取蛋白，BCA法测量蛋白浓度，蛋白变性后上样，电泳转印，5%脱脂奶粉封闭；4 ℃下分别孵育TLR4（1∶1000）、MYD88（1∶1000）、NF-κB p65（1∶1000）、TGF-β1（1∶1000）一抗过夜，PBS漂洗3次，二抗孵育2h，ECL显色成像。使用Image J分析条带灰度值，以每组目的蛋白与内参（β-actin）蛋白灰度值的比值反映目的蛋白的相对表达水平差异。

1.2.10 小鼠肠道菌群分析

分别采集实验第0天和实验结束当天小鼠粪便样本，置于无菌采样管。由赛维尔生物科技有限公司进行肠道菌群16S扩增检测。采用Illumina Miseq PE250平台测序，使用QIIME2 2022.2平台将序列归为多个操作分类单元（OTUs），并以OTUs为基础进行各样本菌群统计分析。

1.2.11 统计学分析

采用GraphPad 8.0进行统计分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，采用非配对t检验进行两组间检验，单因素方差分析进行多样本组别检验，P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠一般情况差异比较

皮下接种小鼠结肠癌MC38细胞和菌液灌胃操作（第1天）并且开始记录体质量变化（图1A），3组小鼠总体体质量增长呈逐步上升趋势，但荷瘤模型组和FMT干预组在荷瘤成功后（第7天）体质量，体质量增长曲线斜率低于空白对照组。荷瘤模型组、FMT干预组荷瘤小鼠在接种6 d后均可在接种部位触及肿块，实验结束后测量荷瘤小鼠肿瘤质量和体积（图1B），FMT干预组肿瘤质量小于荷瘤模型组，差异有统计学意义（P<0.05，图1C）；FMT干预组肿瘤体积小于荷瘤模型组，差异有统计学意义（P<0.05，图1D）；荷瘤模型组小鼠脾脏指数显著高于空白对照组和FMT干预组（P<0.05，图1E）

2.2 小鼠外周血NK细胞流式检测结果

流式结果显示，与空白对照组外周血CD3^-NK1.1⁺（3.36±0.76）%表达相比，荷瘤模型组和FMT干预组外周血中CD3^-NK1.1⁺（1.36±0.85、0.93±0.60）%表达均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05，图2A）；荷瘤模型组和FMT干预组外周血中CD3^-NK1.1⁺未见明显差异。与空白对照组外周血CD3^-NKG2A⁺表达（2.62±0.48）%相比，荷瘤模型组CD3^-NKG2A⁺（4.33±0.87）%表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；经过FMT干预后，FMT干预组外周血中CD3^-NKG2A⁺（2.37±0.64）%表达显著低于荷瘤模型组，差异有统计学意义（P<0.05，图2B）；与空白对照组小鼠外周血CD3^-NKG2D⁺（0.64±0.17）%表达相比，荷瘤模型组小鼠外周血CD3^-NKG2D⁺（0.29±0.17）%表达显著下降，差异有统计学意义（P<0.05，图3C）；经过FMT干预后，FMT干预组外周血中CD3^-NKG2D⁺（0.65±0.14）%表达显著高于荷瘤模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。

Fig.2　peripheral blood NK cell counts in and the expression of NKG2A and NKG2D on the surface of NK cells in the 3 groups (n=5). A: Proportion of CD3^-NK1.1⁺ cells. B: Proportion of CD3^-NKG2A⁺ cells. C: Proportion of CD3^-NKG2D⁺ cells. *P<0.05, ^▲P<0.05 vs Control, ^▲▲P<0.01 vs Model.

2.3 肠道菌群丰富度与多样性及分析

2.3.1 采用韦恩图各组间菌群分类单元数

实验前，空白对照组、荷瘤模型组及FMT干预组的操作分类单元（OTUs）数量分别为945、1168和1141，特异性OTUs数量分别为168、335和289（图3A）；实验后，上述3组OTUs数量分别为930、846和948，特异性OTUs数量相应为281、242和260（图3B）。组间比较分析显示（图3C），实验后空白对照组OTUs数量与实验前相比减少15个，实验后荷瘤模型组OTUs数量减少304个，而FMT干预组OTUs数量减少193个。

2.3.2 Alpha多样性分析反映肠道微生物群落的丰度和多样性

采用Chao1指数和Ace指数用于估算群落物种数量，其值越高提示群落物种数目越多。Shannon指数评估微生物群落的丰富度与均匀度，其值越高表明群落丰富度与均匀度越好；与实验前相比，荷瘤模型组和FMT干预组的Chao1指数（图3D）、Ace指数（图3E）及Shannon指数（图3F）中位数均显著降低（P<0.05）。其中，荷瘤模型组的Chao1、Ace指数和Shannon指数下降更为显著，而FMT干预组上述指数的下降幅度较小，提示FMT干预可有效缓解荷瘤导致的群落丰富度与多样性降低，并改善肠道菌群结构。

2.3.3 肠道菌群Beta多样性分析

基于Bray-Curtis距离矩阵的非度量多维尺度分析（NMDS）结果显示，实验前空白对照组、荷瘤模型组与FMT干预组的肠道菌群结构无显著差异（图4A，NMDS1 Stress=0.098）；实验后NMDS分析显示，空白对照组与荷瘤模型组样本无重叠（NMDS1 Stress=0.039），提示两组小鼠肠道菌群结构存在显著差异，表明荷瘤可导致小鼠肠道菌群结构改变；而FMT干预组与空白对照组样本存在部分重叠（图4B）。

2.3.4 肠道菌群种水平物种差异分析

在门水平上，3组小鼠肠道菌群的主要组成包括Firmicutes、Bacteroidota、Proteobacteria（图5A）。进一步分析显示，荷瘤模型组Proteobacteria（变形菌门）的相对丰度显著高于空白对照组和FMT干预组，而FMT干预可显著降低其相对丰度（图5C）。在种水平上，3组小鼠肠道菌群主要由未分类菌Unclassified、Lactobacillus murinus、Bacteroides acidifaciens、Parabacteroides goldsteinii及Bacteroides caecimuris组成（图5B）。进一步分析显示，与空白对照组相比，荷瘤模型组Lactobacillus murinus（鼠乳杆菌）相对丰度显著降低；经过FMT干预后，相较于荷瘤模型Lactobacillus murinus（鼠乳杆菌）相对丰度，FMT干预组显著升高（图5D）。

2.4 LPS与TLR4分子对接结果

蛋白LPS和蛋白TLR4复合物的结合模式（图6A），图中蓝色为蛋白LPS，红绿色为蛋白TLR4，黄色虚线表示氢键作用，在蛋白LPS和蛋白TLR4形成的复合物中，两个蛋白之间形成了氢键作用。相互作用分析：氢键网络体系形成8个氢键，氢键作为具有方向性和饱和性的非共价键，可极大提升复合物的结合特异性与稳定性。

2.5 3组小鼠血清中LPS含量比较

与空白对照组LPS（0.628±0.0377）ng/mL相比，荷瘤模型组LPS（1.610±0.531）ng/mL水平显著升高（P<0.05）；经过FMT干预后，FMT干预组（1.032±0.126）ng/mL相较于荷瘤模型组LPS（1.610±0.531）ng/mL水平显著下降差异具有统计学意义（P<0.05，图6B）。

2.6 小鼠肠道组织、肿瘤组织相关mRNA检测结果

FMT干预组瘤体组织中TLR4、MYD88、NF‑κB p65mRNA表达水平均显著低于荷瘤模型组表达水平，差异均有统计学意义（P<0.05，图7A）。FMT干预组瘤体组织中穿孔素、颗粒酶B mRNA表达水平均显著高于荷瘤模型组表达水平，差异均有统计学意义（P<0.05，图7A）。在结肠组织中，与空白对照组相比，荷瘤模型组、FMT干预组小鼠结肠组织中TLR4、MYD88、NF-κB p65 mRNA均显著升高（P<0.05）。经FMT干预后，相较于荷瘤模型组，TLR4、MYD88、NF-κB p65 mRNA均显著降低（P<0.05，图7B）。

2.7 NF-κB与TGF-β1启动子结合预测

通过在线数据库JASPAR分析结果显示NF-κB可与TGF-β1基因启动子区多个位点结合选取得分前三进行作图（图7C），说明NF-κB可能调控TGF-β1基因表达。

2.8 小鼠肠道组织、肿瘤组织相关蛋白检测结果

采用Western blotting法检测肠道组织及肿瘤组织中TLR4、MYD88、NF-κB p65、TGF-β1蛋白表达水平，结果显示FMT干预组肿瘤组织中TLR4、MYD88、NF-κB p65、TGF-β1蛋白表达水平均显著低于荷瘤模型组，（P<0.05，图8A）。在结肠组织检测结果显示，与空白对照组相比，荷瘤模型组小鼠结肠组织中TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。FMT干预后，与荷瘤模型组相比，TLR4、MYD88、NF-κB p65蛋白表达水平均显著降低（P<0.05，图8B）。

3 讨论

本研究旨在探讨粪菌移植（FMT）在CRC治疗中的应用潜力及其相关免疫调节机制。近年来，FMT作为一种重塑肠道微生态的重要手段，已在复发性艰难梭菌感染等领域取得显著疗效，并逐步拓展至肿瘤免疫治疗研究^{［11， 15］}。在CRC方面，临床前研究表明FMT能够调节肠道菌群组成、改善肠屏障功能，并影响局部及系统性免疫应答，但其通过菌群-免疫轴发挥抗肿瘤作用的具体机制尚未充分阐明^{［16， 17］}。

本研究通过建立结肠癌细胞小鼠荷瘤模型，预防性FMT干预处理能够延缓荷瘤小鼠的肿瘤生长；在机制上，FMT有效维持了肠道稳态，减少了血清脂多糖（LPS）水平的升高，进而抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路激活，减少转化生长因子-β1（TGF-β1）的表达，进而使得NK细胞表面抑制性受体表达下调与活化性受体表达上调，来增加NK细胞杀伤功能，改善肿瘤免疫微环境，逆转免疫抑制状态。在荷瘤模型组小鼠中，MC38细胞接种后小鼠出现肠道菌群失调和血清LPS水平显著上升，表现为肠道菌群α多样性Chao1、Ace及Shannon指数下降显著降低，变形菌门等机会致病菌丰度明显上调，鼠乳杆菌等有益菌丰度显著下降。这一现象与其他研究的发现相符，即肿瘤负荷本身，即使是远端肿瘤，也能够系统性地影响肠道微环境，导致菌群结构和功能紊乱^［18］，进而机会致病菌的增多和共生有益菌的减少，从而破坏了肠道黏膜屏障的完整性^［19］。本研究通过提前FMT干预使得FMT干预组小鼠的肠道菌群α多样性Chao1、Ace及Shannon指数显著回升，β多样性分析显示其菌群结构与健康供体小鼠更为接近，而与紊乱的肿瘤模型组显著分离，成功缓解了MC38诱导的肠道菌群紊乱。这与既往研究结论一致，通过FMT补充健康菌群、竞争性抑制有害菌定植等方式，重塑CRC模型小鼠的肠道微生态平衡^［20］。FMT对肠道菌群的成功重塑，使得血清LPS水平的显著下降，从而有效抑制由LPS介导的全身性炎症反应^［21］，并且通过分子对接发现LPS与TLR4结合效果良好，而LPS-TLR4/MYD88/NF-κB信号通路的异常激活是肠道菌群紊乱介导CRC肿瘤进展的关键分子桥梁^［22］。在荷瘤状态下，革兰氏阴性菌中变形菌门丰度升高可能导致肠屏障功能受损，促使脂多糖（LPS）等病原相关分子模式（PAMPs）进入血液循环，进而通过激活TLR4/MyD88/NF-κB通路诱发并抑制免疫功能，帮助肿瘤逃避免疫监视^{［23， 24］}。

在本研究中发现NF-κB能够与TGF-β1基因启动子区多个位点结合，这说明NF-κB可能调控TGF-β1基因表达，并且在既往研究中TLR4/MyD88/NF-κB通路能上调TGF-β1的表达和分泌^［25］。在肿瘤微环境中，TGF-β1是NK细胞的负性调节因子^［26］，能够通过多种机制抑制NK细胞功能：一方面，下调NK细胞表面关键活化性受体（如NKG2D）的表达，减少对肿瘤细胞表面NKG2D配体的识别，进而减少IFN-γ、TNF-α和颗粒酶的释放^［27］。另一方面，上调抑制性受体（如NKG2A）的表达，通过识别正常细胞及部分肿瘤细胞表达的Qa-1b分子，传递抑制信号^［28］。进一步发现蛋白免疫印迹及实时荧光定量PCR实验显示，FMT能显著降低结肠组织及肿瘤组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65的mRNA和蛋白表达水平以及肿瘤组织中TGF-β1的蛋白表达，说明FMT可能通过纠正菌群紊乱、减少LPS等PAMPs的生成与易位，从而减弱对TLR4/MyD88/NF-κB通路的持续刺激，减少TGF-β1等免疫抑制因子的分泌。而FMT干预后的荷瘤小鼠的瘤体体积和脾脏显著减小，提示FMT可能对机体肿瘤生长具有抑制作用。此外流式细胞术分析表明，荷瘤小鼠体内NK细胞数量及其活化受体表达均明显下降，反映出荷瘤状态下的免疫抑制微环境；而FMT干预虽未显著增加NK细胞的绝对数量，但能明显提升其活化受体表达并降低抑制受体水平，提示FMT可能主要通过调节NK细胞的功能状态而非单纯扩增细胞数量来增强抗肿瘤免疫应答。此外，由于荷瘤后小鼠机体免疫处于免疫动态耗竭状态，荷瘤模型组肿瘤微环境会诱导NK细胞进入“耗竭状态”这类耗竭NK细胞数量占比高，但无杀伤活性，在FMT干预组中外周血NK细胞比例下降，但NK细胞功能（受体表型+活性）显著提升的现象，本质是NK细胞的空间分布重塑与功能状态优化共同作用的结果——并非NK细胞的绝对数量减少，而是循环NK细胞向肿瘤组织募集，这进一步导致了外周NK细胞数量的下调。同时存活的NK细胞由于抑制性受体下调、活化性受体上调，解除了肿瘤对NK细胞的抑制并增强其识别杀伤能力。并且在CRC临床样本中，肿瘤微环境中TGF-β水平升高影响NK细胞活化，导致NK细胞数目减少、NKG2A阳性NK细胞数目升高、NKG2D阳性NK细胞数目降低，这种变化与不良预后密切有关^{［29， 30］}。本实验进一步研究结果发现荷瘤模型组小鼠瘤体组织中颗粒酶B和穿孔素低表达，说明NK细胞杀伤功能在瘤体组织中作用下降，经过FMT干预后发现FMT干预组瘤体组织中颗粒酶B和穿孔素表达增高，说明两者协同诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长^［31］。

综上，本研究在现有FMT应用于CRC探索的基础上，首次系统揭示了FMT通过重塑肠道菌群结构，抑制TLR4/MyD88/NF-κB炎症通路活化，并改善NK细胞功能抑制状态，从而显著抑制结肠癌进展的作用机制。该结果为基于微生物组的肿瘤免疫治疗提供了重要的实验依据与理论支持，也为后续推动FMT在结肠癌临床综合治疗中的应用提供了借鉴。

参考文献

[1] Bray F, Laversanne M, Sung H, et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2024, 74(3): 229-63. doi：10.3322/caac.21834

[2] Singh M, Morris VK, Bandey IN, et al. Advancements in combining targeted therapy and immunotherapy for colorectal cancer[J]. Trends Cancer, 2024, 10(7): 598-609. doi：10.1016/j.trecan.2024.05.001

[3] Ghosh SS, Wang J, Yannie PJ, et al. Intestinal barrier dysfunction, LPS translocation, and disease development[J]. J Endocr Soc, 2020, 4(2): bvz039. doi：10.1210/jendso/bvz039

[4] Li R, Zhou R, Wang H, et al. Gut microbiota-stimulated cathepsin K secretion mediates TLR4-dependent M2 macrophage polarization and promotes tumor metastasis in colorectal cancer[J]. Cell Death Differ, 2019, 26(11): 2447-63. doi：10.1038/s41418-019-0312-y

[5] Mansouri A, Akthar I, Miyamoto A. TLR2 and TLR4 bridge physiological and pathological inflammation in the reproductive system[J]. Commun Biol, 2025, 8(1): 1008. doi：10.1038/s42003-025-08424-x

[6] Wu ZB, Guo JX, Zhang ZH, et al. Bacteroidetes promotes esophageal squamous carcinoma invasion and metastasis through LPS-mediated TLR4/Myd88/NF-κB pathway and inflammatory changes[J]. Sci Rep, 2024, 14: 12827. doi：10.1038/s41598-024-63774-6

[7] Li C, Li HX, Jiang K, et al. TLR4 signaling pathway in mouse Lewis lung cancer cells promotes the expression of TGF-β1 and IL-10 and tumor cells migration[J]. Bio Med Mater Eng, 2014, 24(1): 869-75. doi：10.3233/bme-130879

[8] Švubová V, Janstová L, Jedlička M, et al. TGF-β decreases NK cell mobility and cytotoxic efficacy in complex in vitro models of the leukemia microenvironment[J]. ImmunoTargets Ther, 2025, 14: 589-604. doi：10.2147/itt.s512700

[9] Ma MZ, Shi FX, Zhai RN, et al. TGF-β promote epithelial-mesenchymal transition via NF‑κB/NOX4/ROS signal pathway in lung cancer cells[J]. Mol Biol Rep, 2021, 48(3): 2365-75. doi：10.1007/s11033-021-06268-2

[10] Kuznetsova AV, Glukhova XA, Beletsky IP, et al. NK cell activity in the tumor microenvironment[J]. Front Cell Dev Biol, 2025, 13: 1609479. doi：10.3389/fcell.2025.1609479

[11] Baunwall SMD, Andreasen SE, Hansen MM, et al. Faecal microbiota transplantation for first or second Clostridioides difficile infection (EarlyFMT): a randomised, double-blind, placebo-controlled trial[J]. Lancet Gastroenterol Hepatol, 2022, 7(12): 1083-91. doi：10.1016/s2468-1253(22)00276-x

[12] Zhang J, Wu KH, Shi CC, et al. Cancer immunotherapy: fecal microbiota transplantation brings light[J]. Curr Treat Options Oncol, 2022, 23(12): 1777-92. doi：10.1007/s11864-022-01027-2

[13] Zhao Z, Ning JW, Bao XQ, et al. Fecal microbiota transplantation protects rotenone-induced Parkinson's disease mice via suppressing inflammation mediated by the lipopolysaccharide-TLR4 signaling pathway through the microbiota-gut-brain axis[J]. Microbiome, 2021, 9(1): 226. doi：10.1186/s40168-021-01107-9

[14] Bokoliya SC, Dorsett Y, Panier H, et al. Procedures for fecal microbiota transplantation in murine microbiome studies[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2021, 11: 711055. doi：10.3389/fcimb.2021.711055

[15] Lu YT, Yuan XL, Wang M, et al. Gut microbiota influence immunotherapy responses: mechanisms and therapeutic strategies[J]. J Hematol Oncol, 2022, 15(1): 47. doi：10.1186/s13045-022-01273-9

[16] Van Dingenen L, Segers C, Wouters S, et al. Dissecting the role of the gut microbiome and fecal microbiota transplantation in radio- and immunotherapy treatment of colorectal cancer[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2023, 13: 1298264. doi：10.3389/fcimb.2023.1298264

[17] Hooper LV, Littman DR, MacPherson AJ. Interactions between the microbiota and the immune system[J]. Science, 2012, 336(6086): 1268-73. doi：10.1126/science.1223490

[18] Zhang SY, Wen HM, Chen Y, et al. Crosstalk between gut microbiota and tumor: tumors could cause gut dysbiosis and metabolic imbalance[J]. Mol Oncol, 2025, 19(6): 1707-24. doi：10.1002/1878-0261.13763

[19] Hays KE, Pfaffinger JM, Ryznar R. The interplay between gut microbiota, short-chain fatty acids, and implications for host health and disease[J]. Gut Microbes, 2024, 16(1): 2393270. doi：10.1080/19490976.2024.2393270

[20] Han X, Zhang BW, Zeng W, et al. Suppressed oncogenic molecules involved in the treatment of colorectal cancer by fecal microbiota transplantation[J]. Front Microbiol, 2024, 15: 1451303. doi：10.3389/fmicb.2024.1451303

[21] Dheer R, Santaolalla R, Davies JM, et al. Intestinal epithelial toll-like receptor 4 signaling affects epithelial function and colonic microbiota and promotes a risk for transmissible colitis[J]. Infect Immun, 2016, 84(3): 798-810. doi：10.1128/iai.01374-15

[22] Li Q, von Ehrlich-Treuenstätt V, Schardey J, et al. Gut barrier dysfunction and bacterial lipopolysaccharides in colorectal cancer[J]. J Gastrointest Surg, 2023, 27(7): 1466-72. doi：10.1007/s11605-023-05654-4

[23] He JK, Li HJ, Jia JQ, et al. Mechanisms by which the intestinal microbiota affects gastrointestinal tumours and therapeutic effects[J]. Mol Biomed, 2023, 4(1): 45. doi：10.1186/s43556-023-00157-9

[24] Peng C, Ouyang YB, Lu NH, et al. The NF-κB signaling pathway, the microbiota, and gastrointestinal tumorigenesis: recent advances[J]. Front Immunol, 2020, 11: 1387. doi：10.3389/fimmu.2020.01387

[25] Zhao S, Zhang YF, Zhang QY, et al. Toll-like receptors and prostate cancer[J]. Front Immunol, 2014, 5: 352. doi：10.3389/fimmu.2014.00352

[26] Batlle E, Massagué J. Transforming growth factor‑β signaling in immunity and cancer[J]. Immunity, 2019, 50(4): 924-40. doi：10.1016/j.immuni.2019.03.024

[27] Lazarova M, Steinle A. Impairment of NKG2D-mediated tumor immunity by TGF-β[J]. Front Immunol, 2019, 10: 2689. doi：10.3389/fimmu.2019.02689

[28] André P, Denis C, Soulas C, et al. Anti-NKG2A MAb is a checkpoint inhibitor that promotes anti-tumor immunity by unleashing both T and NK cells[J]. Cell, 2018, 175(7): 1731-43.e13. doi：10.1016/j.cell.2018.10.014

[29] Valeri A, García-Ortiz A, Castellano E, et al. Overcoming tumor resistance mechanisms in CAR-NK cell therapy[J]. Front Immunol, 2022, 13: 953849. doi：10.3389/fimmu.2022.953849

[30] Krijgsman D, de Vries NL, Skovbo A, et al. Characterization of circulating T-, NK-, and NKT cell subsets in patients with colorectal cancer: the peripheral blood immune cell profile[J]. Cancer Immunol Immunother, 2019, 68(6): 1011-24. doi：10.1007/s00262-019-02343-7

[31] Prager I, Liesche C, van Ooijen H, et al. NK cells switch from granzyme B to death receptor-mediated cytotoxicity during serial killing[J]. J Exp Med, 2019, 216(9): 2113-27. doi：10.1084/jem.20181454

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021