黄褐斑属于后天出现的色素性病症，一般会对脸部造成影响；该状况在女性群体中较为多见，主要诱因包括紫外线照射、性激素变化以及皮肤炎症
［1］。尽管黄褐斑没有明显症状，但它是一种影响容貌的病症，会对患者的生活品质和自尊心造成不利影响；其患病率从普通人群的约1%到高危人群的9%~50%
［2］。尽管存在多种治疗手段，如外用漂白剂、化学剥脱术以及激光疗法等，不过鉴于该病具有慢性特征且复发率高，在治疗方面依旧颇具挑战
［3］。目前，传统的激光治疗黄褐斑主要依据选择性光热分解的理论，会造成含色素细胞的损坏与凋亡；然而，为应对细胞凋亡，炎症会随之产生，并引发色素沉着以及病情复发
［4］。低通量 Q开关Nd：YAG 激光由于使用的通量非常低且没有细胞死亡，因此炎症保持在最低限度，这可能导致复发频率降低，是处理真皮和混合表皮-真皮色素沉着病变的首选激光器
［5］。目前，Q 开关Nd：YAG激光器有两种波长——较长的波长为1064 nm，较短的波长为532 nm；1064 nm 的较长波长是真皮病变的理想选择，因为它的渗透更深且对表皮黑色素的吸收较差
［6］。尽管低通量Q开关 Nd：YAG 激光在治疗深色肤质类型的黄褐斑时展现出一定的治疗效果，但仅采用这一种治疗方案依旧面临着难题
［7］。研究发现，Q开关Nd：YAG 1064nm激光可能致使患者黑色素细胞活化及皮肤屏障受损，从而提升激光治疗后黄褐斑的高复发率
［8］。二甲双胍是一种口服降血糖药物，早已被用于治疗2型糖尿病；除此之外，二甲双胍在过敏性接触性皮炎、化脓性汗腺炎以及黑棘皮病等皮肤病症的治疗中发挥着关键作用
［9， 10］。近期，体外和体内研究证实外用二甲双胍具有抗黑色素生成的活性
［11］。已有研究证明，它能够借助环磷酸腺苷依赖途径，降低黑色素瘤细胞以及正常人类黑色素细胞中的黑色素含量，这与黑色素生成主基因表达水平的下降存在关联
［12］。近年来，临床上单一治疗手段难以全面高效应对此类病症，联合治疗成为研究新趋势。
本研究是首次采用Q开关的Nd：YAG 1064 nm激光联合局部外用30%二甲双胍洗剂疗法，与单独使用激光及二甲双胍比较，对黄褐斑小鼠模型进行相关研究实验。旨在为局部使用二甲双胍治疗黄褐斑的可能机制提供相关依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物
选取SPF级雌性健康昆明小鼠40只，体质量18~22 g（6~8周龄），动物生产许可证号：SCXK（川）2018-18（伦理批号：NSMC 伦理动物审［2021］102号），小鼠由川北医学院医学实验动物中心提供。SPF级环境饲养，温度控制在20~22 ℃，相对湿度40%~70%，饲养于川北医学院动物实验中心。
1.2 实验试剂和仪器
所用试剂及仪器分别为：10%中性福尔马林固定液（Solarbio），黄体酮注射液（天津金耀制药有限公司），丙二醇（天津致远公司），PBS磷酸缓冲液（国药集团化学试剂有限公司），显影定影试剂盒（天津市汉中摄影材料厂），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒及丙二醛（MDA）试剂盒均由南京建成公司提供；抗黑色素瘤（HMB-45）抗体和酪氨酸酶（Tyrosinase）抗体均由北京博奥森公司提供，IHC实验所用稀释比例分别为1∶50、1∶200，WB实验所用稀释比均为1∶500，兔多抗GAPDH抗体（杭州贤至生物公司，稀释比为1∶1000）；中波紫外线（UVB）灯管由荷兰飞利浦提供，Q开关钕钇铝石榴石（Nd：YAG）激光由以色列飞顿公司提供，台式超高速离心机（北京大龙兴创实验仪器股份公司），石蜡切片机（德国徕卡仪器有限公司）。
1.3 实验药品
称取30.0 g高纯度二甲双胍原料粉（河北聚源生物技术有限公司）。溶剂系统为70% （
v/v） 乙醇水溶液与丙二醇，两者体积比为7∶3（即70%乙醇占溶剂总体积的70%，丙二醇占30%）
［13］。首先，准确量取一定体积的丙二醇于洁净的烧杯中。将称量好的30.0 g二甲双胍粉末缓慢加入丙二醇中，使用磁力搅拌器（转速500 r/min）于室温（25±2 ℃）下持续搅拌，直至粉末完全分散，得到均匀的混悬液。然后，缓慢向上述混悬液中加入计算好体积的70%乙醇水溶液。继续搅拌（500 r/min）至少60 min，直至二甲双胍完全溶解，获得澄清、无可见颗粒的均质溶液。最后，用70%乙醇定容至总体积为100 mL，确保最终浓度为30% （w/v）。将配制好的二甲双胍洗剂避光、分装于50 mL琥珀色玻璃瓶中，每瓶装量45 mL，并密封保存。所有制剂置于4 ℃冰箱中避光冷藏保存，有效期≤2周。每次使用前，从冰箱中取出，恢复至室温并充分振摇均匀。
1.4 动物模型的建立
参照文献造模方法
［14，15］，并通过黄褐斑造模预实验后，选择UVB照射及黄体酮肌注建立黄褐斑小鼠模型。首先将40只雌性实验小鼠随机分为两组，正常组16只（作为基线对照），模型组24只。用剃毛器除去其背部毛发，面积约3×2 cm
2，然后将脱毛膏涂于该处，1~2 min以湿布擦净。正常组小鼠后肢肌肉注射灭菌用水（5 mL/kg），模型组小鼠予以黄体酮肌注（5 mL/kg，20 mg/kg），两后肢轮流肌肉注射，每天1次，连续注射45 d，同时予以UVB照射背部皮肤，小鼠皮肤与光源的距离为25 cm，1次/d，照射约60 min，共45 d，诱导黄褐斑小鼠模型的建立。
1.5 动物模型的验证
建模45 d后，分别选取正常组和模型组小鼠的背部皮肤，分别检测其皮肤组织中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的含量。模型组小鼠MDA含量显著升高，SOD含量显著降低，表皮黑素细胞增多，表明豚鼠黄褐斑动物模型已成功构建
［16］（图
3、4）。
1.6 分组及治疗
造模成功后第3天开始干预，将24只模型组小鼠随机分成4组，6只/组。小鼠组别如下，对照组（Control）：即自然恢复，无治疗处理。为确保实验条件一致，该组小鼠需进行与激光组相同的抓取固定，但不对其背部皮肤进行激光照射或药物涂抹。激光组（Laser）：通过之前对黄褐斑小鼠模型进行治疗的预实验，并结合相关文献［
17］，确定治疗方案。设备与参数：使用Q开关Nd：YAG激光治疗仪。治疗参数固定为：波长1064 nm，光斑直径7 mm，能量密度2.5 J/cm²，频率为1次/周。每次治疗前，使用动物剃毛器将小鼠背部治疗区域的毛发剔除干净； 将小鼠妥善固定于操作台上，暴露其背部皮肤。激光治疗头垂直对准并轻贴皮肤，以不重叠的连续光斑对目标区域进行均匀扫描。每次治疗以小鼠皮肤出现轻微发红作为标准治疗终点。达到此终点后即停止扫描，单次治疗时间约为1 min。共计治疗4次，1次/周，持续4周。二甲双胍组（Met）
［13］：使用统一配制的30%二甲双胍洗剂。每次涂抹前，将盛有洗剂的玻璃瓶充分摇匀，以确保药物浓度均匀。每日1次，使用移液器精确吸取50 μL洗剂，薄涂并均匀覆盖于小鼠背部目标皮肤区域（2 cm×2 cm）。轻柔涂抹以确保药物吸收，并防止小鼠舔舐。激光联合二甲双胍组（Laser+Met）：该组小鼠同时接受上述激光治疗与二甲双胍药物治疗。激光治疗参数、周期及操作方法同激光组。每日二甲双胍的涂抹方法同二甲双胍组。为减少相互干扰，激光治疗当日，药物涂抹应在激光照射完成后至少间隔4 h进行。治疗后对所选全部小鼠进行为期两个月的观察并记录其疾病复发情况。
1.7 检测指标
治疗4周后，处死小鼠并取各组小鼠背部皮肤组织行相关检测。组织病理学观察：采用苏木精-伊红（HE）染色法观察皮肤组织形态结构、炎性细胞浸润等基本病理变化；氧化应激指标检测：使用超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）检测试剂盒，严格按照说明书操作，分别测定皮肤组织匀浆上清液中的SOD活性和MDA含量；黑色素含量测定：精确称取约50 mg皮肤组织，加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液（含10% DMSO），于80 ℃水浴中裂解至组织完全溶解。冷却后，12 000 r/min离心10 min，取上清液。用酶标仪测定吸光度A450 nm。以合成黑色素为标准品，绘制标准曲线，并计算每毫克组织湿重中的黑色素含量；酪氨酸酶活性检测：制备皮肤组织匀浆上清液，与0.1% L-DOPA溶液在37 ℃下共同孵育30 min。用酶标仪检测反应产物的吸光度值A475 nm；免疫组织化学法（IHC）：检测皮肤组织中与色素代谢、氧化应激等相关的关键蛋白的表达量；蛋白质印迹法（Western blotting）：进一步定量分析上述相关蛋白的表达量。
1.8 CREB/MITF信号通路相关蛋白表达检测
通过前期生物信息学分析结果，最终选取2个与CREB/MITF信号通路相关蛋白，分别为cAMP反应元件结合蛋白1（CREB1）、微小眼相关转录因子（MITF）。检测方法：Trizol法提取小鼠背部皮肤组织总RNA，采用超微量分光光度计测定其纯度，随后，用反转录试剂盒（上海生工生物有限公司）对所取RNA进行反转录，得到cDNA。采用SYBR Green法在实时荧光定量PCR仪检测样本中CREB1、MITF的表达水平。其中反应条件：在95 ℃下进行5 min的预变性，随后60 ℃条件下退火1 min，58 ℃延伸34 s，共45次循环，做3次重复实验，完成后按2
-∆∆CT方法计算其相对表达量，引物由上海生工生物有限公司合成，序列见
表1。
1.9 统计学分析
基于预实验或前期文献数据
［18］，本研究设定主要观测指标（皮肤组织中黑色素含量）的预期效应值（f）为1，显著性水平（α）为0.05，检验效能（1-β）为0.8。使用G*Power 3.1软件计算，得出每组至少需要5只小鼠。为确保结果稳健并应对可能的意外损耗，本研究最终设定每组样本量为6只。数据均采用均数±标准差表示，用IBM SPSS 26.0 统计软件进行统计分析，
P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 肉眼观察皮肤情况
模型组小鼠24只，建模45 d后存活24只。模型组小鼠予以UVB照射辅以黄体酮注射液肌注进行造模。造模3 d后，小鼠背部实验区域皮肤均无红斑、水肿、水疱，未见明显脱屑；造模1周后，小鼠皮肤轻度红斑形成，部分小鼠造模皮肤伴轻微脱屑；造模2周后，皮肤开始出现点、片状色素沉着斑，皮肤较前粗糙、干燥，均出现细碎脱屑；造模1月后，皮肤色素沉着逐渐加深，部分融合成片状，颜色趋于均匀；造模45 d后，色素沉着较正常皮肤明显加深，呈褐色，色沉趋于稳定，伴皮肤增厚、粗糙、脱屑、皱缩，皮肤光泽度及弹性减退，毛发生长缓慢（
图1）。
2.2 4组小鼠治疗后复发情况比较
治疗后，Laser+Met组小鼠复发率显著低于Met组、Laser组、Control组（χ²=8.914，
df=3，
P=0.030，
表2）。
2.3 皮肤组织HE染色
黑素细胞及黑素颗粒在HE染色标本上不易辨认（
图2）。正常组（建模前）：表皮比较薄，约2~3层。胞质见紫蓝色嗜碱性的透明角质颗粒，真皮为染成浅红色的胶原纤维束交织成网，可见正常毛囊、皮脂腺和汗腺。真皮及真皮下可见少量血管，未见特殊。模型组（建模后）：可见表皮増生，表皮层厚度不一，表皮细胞明显增多，约5~8层。真皮层可见炎性细胞，呈局灶性浸润。表皮局部出现乳头状、疣状增生，毛囊和皮脂腺等附属器增多。真皮、皮下组织可以见到增多的微小血管。该病理表现与小鼠黄褐斑模型皮肤组织形态学相合。
2.4 皮肤组织SOD、MDA生化检测
造模45 d后，与Normal组相比较，Model组小鼠皮肤SOD含量明显下降，皮肤MDA含量明显升高（
P<0.001，
图3A、B）。与Normal组相比较，Model组小鼠皮肤中免疫组化HMB-45的平均光密度值明显升高，即黑色素表达量增加（
P<0.001）；治疗4周后，与Control组相比较，Laser组、Met组、Laser+Met组小鼠皮肤中HMB-45的平均光密度值明显降低，即黑色素表达量减少，差异有统计学意义（
P<0.001）。Laser组与Met组之间差异无统计学意义（
P>0.05），Laser+Met组与Laser组、Met组之间差异有统计学意义（
P<0.001），即Laser+Met组相对Laser组和Met组，黑色素表达量更少（图4A）。Model组小鼠皮肤中黑色素细胞的数量明显增加（
P<0.001）；治疗4周后，与Control组相比较，Laser组、Met组、Laser+Met组小鼠皮肤中黑色素细胞的数量明显降低（
P<0.001）。Laser组与Met组之间差异无统计学意义（
P>0.05），Laser+Met组与Laser组、Met组之间差异有统计学意义（
P<0.001），即Laser+Met组相对Laser组和Met组，黑色素细胞数量更少（图4B）。Model组小鼠皮肤中免疫组化TYR的平均光密度值明显升高，即酪氨酸酶表达量增加（
P<0.001）；治疗4周后，与Control组相比较，Laser组、Met组、Laser+Met组小鼠皮肤中TYR的平均光密度值明显降低，即酪氨酸酶表达量减少（
P<0.001）。Laser组与Met组之间差异无统计学意义（
P>0.05），Laser+Met组与Laser组、Met组之间差异有统计学意义（
P<0.001），即Laser+Met组相对Laser组和Met组，酪氨酸酶表达量更少（图4C）。
2.5 皮肤组织Western blotting结果
Model组小鼠皮肤中黑色素蛋白含量显著增加（P<0.001）；治疗4周后，Laser组、Met组、Laser+Met组小鼠皮肤中黑色素蛋白含量降低，差异有统计学意义（P<0.001）。Laser组与Met组之间差异无统计学意义（P>0.05），Laser+Met组与Laser组、Met组之间差异有统计学意义，即Laser+Met组相对Laser组和Met组，黑色素蛋白含量更少（P<0.001，图5A、B）。
Model组小鼠皮肤中酪氨酸酶TYR蛋白含量显著增加（P<0.001）；治疗4周后Laser组、Met组、Laser+Met组小鼠皮肤中酪氨酸酶TYR蛋白含量降低（P<0.001）。Laser组与Met组之间差异无统计学意义（P>0.05），Laser+Met组相对Laser组和Met组，酪氨酸酶TYR蛋白含量更少（P<0.001，图5A、C）。
2.6 各组小鼠皮肤组织CREB1、MITF表达水平比较
治疗4周后，与Control组相比较，Laser组、Met组、Laser+Met组小鼠皮肤中CREB1、MITF表达水平降低，差异有统计学意义（
P<0.001）；Laser组与Met组之间差异无统计学意义（
P>0.05），Laser+Met组与Laser组、Met组之间差异有统计学意义（
P<0.01，
表3）。
3 讨论
黄褐斑是一种难以治愈的褐色色素沉着斑，常出现在面部，其形成原因之一是面部频繁暴露于紫外线（UV）和较短波长的可见光（VL）。根据皮肤的 Fitzpatrick 分型，Ⅳ至Ⅵ类患者最为常见，其中超过90%为女性
［19］。黑素细胞中黑色素的合成增加在黄褐斑发病机制中起着重要作用。黑色素的代谢是一种精确调节的生物行为，受到外部环境（紫外线等）和内部环境（细胞间相互作用等）的共同影响
［20］。UVB可直接损害细胞DNA，为了保护身体免受损伤，表皮黑素细胞合成黑色素以吸收UVB辐射能量，并防止DNA、膜脂质和其他细胞成分受到损害。它具有光保护作用，同时导致皮肤变黑。因此，紫外线诱导的黑色素合成是身体的一种防御机制，但过度的色素生成可能会导致诸如黄褐斑之类的色素沉着过度的皮肤疾病
［21， 22］。长期暴露在紫外线下可能会引发或加重黄褐斑，并通过一系列反应上调环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）的表达。CREB会与核心因子MITF发生反应，进而使以下蛋白质因子表达增加，包括酪氨酸酶相关蛋白1（TRP-1）、酪氨酸酶（TYR）和酪氨酸酶相关蛋白2（TRP-2），这些都是黑色素合成过程中的重要物质
［23］。同时，氧化与抗氧化之间的失衡也是黄褐斑产生的一个重要因素，通常，超氧化物歧化酶（SOD）能够自动清除人体内的过量丙二醛（MDA），当内部和外部因素破坏这种平衡时，SOD 会减少，氧化反应增强使MDA增多，导致色素沉着的形成
［24］。此外，黄褐斑还受到人体内分泌的影响，各种原因均可导致雌激素水平升高，雌激素会与黑素细胞上的雌激素受体结合，诱导合成与黑色素生成相关的酶，如酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白，从而刺激黑素细胞中黑色素生成的增加
［25， 26］。
调Q激光基于选择性光热理论，通过对靶目标进行选择性光爆破，激光所集聚的高能量瞬间发射，使得固定波长的激光在极短时间内瞬间穿透表皮到达病变组织，从而使黑素含量下降、黑素细胞减少，病变组织的色素逐渐变淡、消失，可有效的改善色素沉着，且该技术对周围组织结构几乎无任何损伤，具有一定安全性
［27-29］。但是，研究发现部分患者通过Q开关激光治疗后，其病情加重，表现为斑片颜色加深，或遗留炎症后色素沉着等不良反应，这与调Q激光参数设置有关，波长短或能量过高都可能加大对皮肤的伤害，使黑素激惹并进一步活跃
［30， 31］。且相关研究报道，长期随访观察发现，单一使用Q开关Nd：YAG1064nm激光治疗后，患者复发率仍然较高，治疗后面部皮损改善并不理想
［32， 33］。
该实验的结果表明，与单独使用激光或使用二甲双胍洗剂治疗相比，Q开关Nd：YAG 1064 nm激光联合30%二甲双胍洗剂对黄褐斑小鼠模型的治疗效果在4周后有了显著改善。这种联合疗法缩短了治疗周期，且联合应用的效果优于其单独治疗。两者的结合利用了调Q激光对黑素细胞内的黑色素颗粒的选择性光爆破作用，以及外用二甲双胍对表皮黑素细胞及黑色素合成相关因子的抑制作用，明显降低了黑素细胞数量、黑色素及酪氨酸酶含量，对表皮全层起到淡化黑素作用，显著提高黄褐斑模型小鼠的疗效。值得注意的是，这种联合治疗的协同机制并非简单将激光与药物的效果相加，而是通过互补的分子和细胞过程实现协同增效。具体而言，Q开关Nd：YAG 1064nm激光通过选择性光热作用，直接靶向并破碎已形成的黑色素颗粒，促进其代谢清除；而外用二甲双胍洗剂则通过抑制cAMP/MITF信号通路，下调酪氨酸酶及相关蛋白的表达，从而从源头上阻断新黑色素的合成。这种“物理破坏+化学抑制”的双重策略，形成了多层次的干预：激光处理快速消除现有色素，二甲双胍预防色素再生，两者协同减少了黑色素细胞的活化周期和炎症反馈，从而显著降低复发风险。实验结果显示，联合组在CREB1/MITF表达抑制和色素清除方面均优于单一治疗组，进一步证实了协同机制的存在，而非简单叠加效应。并且，单独外用二甲双胍组小鼠皮肤经治疗后的黑素细胞数量减少，黑色素以及酪氨酸酶含量较对照组明显下降，说明外用二甲双胍治疗黄褐斑小鼠模型的机制可能与减少皮肤中黑色素及酪氨酸酶合成有关，这与Lehraiki
［34］报道的研究结果一致。本研究结果显示，联合组小鼠治疗后CREB1、MITF表达水平显著降低。结合上述各组小鼠TRP表达水平变化，分析其原因可能是，Q开关Nd：YAG 1064 nm激光联合30%二甲双胍洗剂治疗黄褐斑小鼠，通过抑制cAMP/MITF信号通路传导进而降低通路相关蛋白CREB1、MITF的表达，抑制cAMP激活剂诱导的黑色素含量、酪氨酸酶活性以及TYR表达的增加，进一步减少黑色素的产生及黑色素体的转移
［35］。在治疗后对这些小鼠进行了为期2个月的观察，结果发现，在激光组和二甲双胍组中，个别小鼠背部皮肤上再次出现了斑点和片状色素沉着现象，而联合治疗组中未发现明显的复发性褐色斑点，这3组均未出现其他不良反应。
综上所述，本研究通过中波紫外线照射辅以黄体酮肌注建立黄褐斑小鼠模型，并且通过表观指标、病理指标及生化指标验证了黄褐斑模型的成功建立。Q开关Nd：YAG 1064 nm激光联合30%二甲双胍洗剂治疗黄褐斑小鼠，能够有效缩短治疗疗程，降低其复发率，安全性较高；其治疗机制可能与调控cAMP/MITF信号通路进而减少皮肤中的黑色素和酪氨酸酶合成有关。未来的工作中，将对联合治疗黄褐斑或相关色素性疾病进行更多的机制探索和实验。
四川省科学技术项目(2020YJ0185)
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