褪黑素通过抑制STING信号通路减轻糖尿病小鼠心肌细胞坏死性凋亡

Melatonin alleviates cardiomyocyte necroptosis in diabetic mice by inhibiting the STING signaling pathway

摘要

目的 探讨褪黑素（Mel）对糖尿病心肌病（DCM）的保护作用，并阐明其是否通过干扰素基因刺激因子（STING）信号通路调控心肌细胞坏死性凋亡和炎症反应。 方法 采用链脲佐菌素（STZ）诱导的2型糖尿病小鼠模型建立体内DCM模型；同时，采用高糖（HG，33mmol/L）处理的HL-1细胞建立体外DCM模型。实验动物分为对照组（Sham），糖尿病模型组（DM）和褪黑素治疗组（DM+Mel），6只/组。通过HE染色观察心肌组织的病理学变化。采用免疫荧光染色与Western blotting检测P-RIPK1，P-RIPK3，P-MLKL等坏死性凋亡的关键蛋白，Western blotting和ELISA检测白细胞介素-1β（IL-1β），白细胞介素-6（IL-6），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎因子评估细胞死亡和炎症水平。通过免疫组化和Western blotting检测STING信号通路激活相关蛋白（如P-IRF3和P-P65）水平。 结果 与Sham组相比，DM组STING信号通路激活，STING，P-IRF3蛋白表达水平显著升高（P<0.05），心肌组织炎症浸润增加，血清及心肌炎症因子，IL-1β，IL-6及TNF-α表达上调（P<0.05），坏死性凋亡相关蛋白P-MLKL，P-RIPK1，P-RIPK3水平升高（P<0.05）。DM+Mel组STING信号通路被抑制，STING，P-IRF3蛋白表达水平下降（P<0.05），炎症因子及坏死性凋亡相关蛋白IL-1β，IL-6，TNF-α及P-MLKL，P-RIPK1，P-RIPK3表达下降（P<0.05）。而使用STING激动剂DMXAA可以部分逆转褪黑素的保护作用（P<0.05）。 结论 褪黑素通过抑制STING信号通路，有效减轻糖尿病心肌病中的心肌细胞坏死性凋亡和炎症反应，从而发挥心脏保护作用。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of melatonin against diabetic cardiomyopathy (DCM) and whether melatonin regulates cardiomyocyte necroptosis and inflammatory response through the stimulator of interferon genes (STING) signaling pathway. Methods C57 mouse models of DCM induced by streptozotocin (STZ) injection were given an intraperitoneal injection of saline or melatonin (n=6), and 24 h later blood and myocardial samples were collected from the mice for analysis. A cell model of DCM was established in HL-1 cells by high glucose treatment (33 mmol/L). Pathological changes in myocardial tissue of the mice were observed using HE staining. Immunofluorescence staining and Western blotting were used to detect the key necroptosis proteins, and the pro-inflammatory factors including IL-1β, IL-6, and TNF-α were detected with Western blotting and ELISA to evaluate cell death and inflammation. The expression levels of the proteins associated with STING pathway activation (P-IRF3 and P-P65) were detected using immunohistochemistry and Western blotting. Results In the diabetic mice and cell models of DCM, the STING signaling pathway was activated with significantly increased protein expressions of STING and P-IRF3. The myocardial tissues of DCM mice showed increased inflammatory infiltration with upregulated serum and myocardial levels of IL-1β, IL-6, and TNF-α and increased levels of necroptosis-related proteins P-MLKL, P-RIPK1, and P-RIPK3. Treatment with melatonin significantly inhibited the activation of the STING signaling pathway and reduced the expression levels of inflammatory factors and necroptosis-related proteins, and the use of the STING agonist DMXAA significantly attenuated the protective effect of melatonin. Conclusion Melatonin effectively alleviates cardiomyocyte necroptosis and inflammatory response in DCM by inhibiting the STING signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

褪黑素 / 糖尿病心肌病 / STING信号通路 / 坏死性凋亡 / 炎症反应

Key words

melatonin / diabetic cardiomyopathy / STING signaling pathway / necroptosis / inflammatory response

糖尿病心肌病（DCM）是糖尿病患者常见的心血管并发症之一，其特征在于心肌结构和功能的异常，这种异常发生在缺乏冠状动脉疾病和高血压的情况下，最终可能导致心力衰竭^{［1， 2］}。该病的发病机制非常复杂，其中慢性高血糖引起的持续性炎症反应及心肌细胞凋亡被认为是主要因素^{［3， 4］}。但糖尿病引发炎症的机制尚不明确，寻找干预手段至关重要。

近年来的研究表明，作为一种受调控的细胞死亡方式，坏死性凋亡在DCM的进展中扮演了关键角色^［5-9］。此过程主要通过受体相互作用蛋白激酶1和3（RIPK1和RIPK3）介导，最终通过混合谱系激酶样结构域（MLKL）的磷酸化导致细胞膜破裂，从而释放细胞内损伤相关分子模式（DAMPs），显著增强炎症反应^【10】。近期研究表明，坏死性凋亡在糖尿病心肌病中起着关键作用，因为坏死性凋亡会导致DAMPs，膜破裂以及过度炎症，最终促进细胞死亡，组织损伤和器官衰竭^【11-13】。已有研究表明抑制坏死性凋亡可减轻糖尿病心肌病导致的炎症^{［14， 15］}，这表明靶向坏死性凋亡可能是一种有前景的治疗糖尿病心肌病的策略。

干扰素基因刺激因子（STING）是固有免疫反应中的重要接头蛋白^［16-18］。最近的研究显示，在代谢应激（例如高糖）环境中，细胞内DNA（如线粒体DNA）的泄漏能够激活cGAS-STING信号通路^［19-22］。激活的STING进一步磷酸化TBK1和IRF3，并激活NF-κB通路，促进I型干扰素及多种促炎因子的产生，同时也会加剧细胞死亡^［23-26］。因此，STING通路被认为是代谢紊乱，炎症与细胞死亡之间的重要联系。越来越多的研究表明，STING的异常激活与糖尿病心肌病损伤密切相关^{［27， 28］}。然而，糖尿病诱导的心肌损伤与线粒体DNA释放和STING激活之间的具体机制，仍有待探究。

褪黑素是一种主要由松果体分泌的激素，具有显著的抗氧化，抗炎及抗细胞凋亡特性^［29-31］。已有研究表明，褪黑素可能对糖尿病引起的心脏损伤具有保护作用，但其是否通过调节STING通路影响坏死性凋亡尚不明确。本研究旨探究褪黑素是否通过抑制STING信号通路，减轻糖尿病心肌病中心肌细胞的坏死性凋亡及炎症反应。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与伦理

所有实验程序均符合美国国立卫生研究院《实验动物使用指南》，并获重庆医科大学动物研究委员会批准（伦理批号：IACUC-CQMU-2026-01066）。实验选用重庆医科大学动物中心购买的健康雄性C57BL/6小鼠（8周龄，20~25 g），小鼠在12 h光/暗循环下，无病原体（SPF）屏障系统中饲养。所有小鼠均自由获得食物和水。

1.1.2 试剂与材料

RIPK1（1∶1000）、P-RIPK1（1∶1000/1∶100）、RIPK3（1∶1000）、P-RIPK3（1：1000）、P-IRF3 （1∶1000）、IL-1β（1∶1000）（Affinity），STING（1∶1000）、MLKL（1∶1000）、P-P65（1∶200）、iNOS（1∶200）、β-Actin（1∶10 000）（Proteintech），P-MLKL（Ser345）（1∶1000/1∶500，Cell Signaling Technology），TNF-α（1∶1000，Zenbio），Mouse IL-1β ELISA KIT、Mouse IL-6 ELISA KIT、Mouse TNF‑α ELISA KIT（Solarbio），DMXAA（MedChemExpress）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型

将 C57 小鼠随机分为 3组：对照（Sham）组，糖尿病（DM）组和糖尿病+褪黑素（DM+Mel）组，6只/组。通过高脂饮食喂养 4 周，连续 5 d 腹腔注射链脲佐菌素（STZ，30 mg/kg）的方法构建糖尿病模型。根据先前的研究^［32］，对 DM+Mel 组腹腔注射褪黑素（Mel，2.5 mg/kg），对照组和糖尿病组注射等量0.9%的生理盐水，治疗后24 h对小鼠实施安乐死，收集血液及心脏组织进行分析。

1.2.2 细胞模型

HL-1细胞常规复苏后，加入含有10%FBS，1%双抗（100 U/mL青霉素+100 mg/L链霉素）的DMEM完全培养基重悬细胞，随后接种至培养瓶中，于37 ℃，5% CO₂培养箱培养，每隔2~3 d传代1次，取生长状态良好且处于对数期的细胞开展后续实验。分为3组，并根据先前的研究给予褪黑素^【33】（100 μmol/L）及STING激动剂DMXAA^［34］（10 μg/mL）处理：对照组（5.5 mmol/L，CON），高糖组（33.3 mmol/L，HG），高糖+褪黑素组（HG+Mel），高糖+褪黑素组+STING激动剂组（HG+Mel+DMXAA）。

1.3 组织学分析

将心脏组织固定于4%的多聚甲醛中，使用分级乙醇进行脱水处理后，将组织包埋在石蜡中，切片厚度为5 μm。随后采用苏木精-伊红（HE）染色进行组织病理学评估。

1.4 炎症标志物ELISA检测

取眶后静脉血样，3000 r/min离心10 min，提取血清，使用ELISA试剂盒（按照说明书操作）测量血清中IL-1β，IL-6和TNF-α的水平。

1.5 免疫组化（IHC）分析

石蜡包埋的心脏组织脱蜡复水后，使用10 mmol/L柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）进行抗原修复。使用0.3% Triton X-100进行透化处理。用5%山羊血清封闭切片，并与抗P-RIPK1（1∶100）和抗P-P65抗体于4 ℃下孵育过夜。PBS洗涤后，加入IgG山羊抗兔二抗（1∶200），于室温孵育1 h。使用DAB底物试剂盒显色，随后进行PBS洗涤，苏木素染核，脱水和封片。最后在光学显微镜下分析染色切片，并运用ImageJ软件定量分析各实验免疫组化阳性率。

1.6 免疫荧光（IF）分析

将石蜡包埋的心脏组织切片脱蜡复水，并在柠檬酸盐缓冲液中进行抗原修复。然后用0.3% Triton X-100透化切片，并用5%山羊血清封闭。应用iNOS（1∶200）和P-MLKL（1∶500）一抗，并于4 ℃下孵育过夜。PBS洗涤后，将切片与Polymer-HRP 抗鼠/兔通用型二抗在室温下孵育1 h。用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染细胞核，并使用荧光显微镜捕获荧光图像，并采用Image J软件进行图像分析。

1.7 Western blotting

心脏组织在液氮中快速冷冻，并使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解，裂解后以13 000×g离心15 min，收集上清液。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，取等量蛋白质（具体用量根据实验需求确定）在8%~12% SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到PVDF膜上。在室温下用含有0.1% Tween-20的TBS中5%脱脂牛奶封闭膜1 h，然后在4 ℃条件下与以下抗体孵育过夜：RIPK1，P-RIPK1（1∶1000），RIPK3，P-RIPK3，P-IRF3，Il-1β，STING，MLKL，iNOS（1∶1000），P-MLKL（1∶1000），TNF-α，GAPDH。洗涤后，将膜与HRP偶联的二抗在室温下孵育1 h。使用增强型化学发光（ECL）检测系统可视化蛋白质条带，并使用Quantity One软件（Bio-Rad）进行密度分析。

1.8 PicoGreen染色

为了检测核DNA的泄漏，将细胞接种于爬片，进行如前所述的造模处理后将细胞与PicoGreen在37 ℃孵育30 min，随后进行Hoechst染色，并使用荧光显微镜捕捉荧光图像。

1.9 统计学分析

除非另有说明，所有定量数据均以均数±标准差表示。首先采用Shapiro-Wilk检验评估数据的正态性，若数据符合正态分布（P>0.05），则进一步采用Levene检验进行方差齐性检验。对于满足正态性和方差齐性的数据，两组间比较采用Student's t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）进行事后多重比较。若数据不满足正态分布，则采用Mann-Whitney U检验（两组）或Kruskal-Wallis检验（多组）；若方差不齐，则采用Welch's ANOVA或Brown-Forsythe检验进行校正，所有统计检验均为双尾，P<0.05被认为差异具有统计学意义。所有统计分析均使用GraphPad Prism 9.0软件完成。

2 结果

2.1 褪黑素减轻糖尿病小鼠心肌损伤并抑制炎症因子表达

与Sham组相比，DM组小鼠心肌细胞排列紊乱，免疫细胞浸润增加。与DM组相比，褪黑素治疗组小鼠的心肌细胞排列更整齐，免疫细胞浸润减轻（图1A）。ELISA分析结果显示，与Sham组比较，DM组小鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-6水平显著升高（P<0.05），褪黑素治疗有效降低了这些促炎因子的水平（图1B）。Western blotting实验显示，与Sham组比较，DM组小鼠心肌组织中炎症因子（IL-1β，TNF-α，iNOS）表达升高，褪黑素治疗显著降低了其水平（P<0.05），同时，细胞模型中，高糖刺激诱导炎症因子（IL-1β，TNF-α）表达增加，褪黑素治疗可减轻该效应（P<0.05，图1C）。免疫荧光染色结果表明，与Sham组相比，DM组小鼠心肌组织中iNOS表达明显上调（图1D）。

2.2 褪黑素抑制糖尿病心肌细胞的坏死性凋亡

Western blotting结果显示，DM组心肌组织中RIPK1，RIPK3和MLKL蛋白的磷酸化水平显著上调，而褪黑素治疗逆转了这一现象（P<0.05，图2A）。免疫组化与免疫荧光染色结果提示，糖尿病组心肌组织P-RIPK1与P-MLKL表达量显著高于对照组，而褪黑素治疗可降低表达（P<0.05，图2B）。在细胞模型中，高糖刺激增加RIPK1，RIPK3和MLKL的磷酸化水平，褪黑素治疗同样逆转了这一现象（P<0.05，图2C）。

2.3 褪黑素抑制DM诱导的STING信号通路激活

Western blotting结果显示，与Sham组相比，DM组心肌组织中的STING和P-IRF3蛋白水平显著升高（P<0.05，图3A）。IHC结果显示，DM组小鼠心肌组织中P-P65表达上调（P<0.05，图3B）。在细胞模型中，高糖刺激激活STING通路，STING和P-IRF3蛋白水平升高（P<0.05，图3C）。

2.4 激活STING部分逆转褪黑素的保护作用

在体外实验中，联合使用STING激动剂DMXAA后，与HG+Mel组相比，iNOS，IL-1β，TNF-α表达显著上调。同时，DMXAA部分逆转了褪黑素治疗对于坏死性凋亡的减轻作用。坏死性凋亡相关蛋白RIPK1，RIPK3及MLKL磷酸化水平明显上调。与HG+Mel组相比，P-IRF3，STING表达上调（P<0.05，图4A）。PicoGreen与Hoechst染色结果表明，与高糖组相比，褪黑素处理降低了DNA泄漏水平，然而，在褪黑素联合STING激动剂组中，DNA泄漏水平相较于褪黑素单独处理组回升（P<0.05，图4B）。

3 讨论

糖尿病心肌病是一种复杂且常见的并发症，严重影响糖尿病患者的心脏功能和生活质量。其病理特征包括心肌细胞的损伤，心肌炎症及细胞凋亡等，均与高血糖状态密切相关^［35-38］。尽管已有研究揭示了炎症反应在糖尿病心肌病中的重要性，但其具体机制仍未完全阐明。这一研究领域的挑战在于如何有效干预这些病理过程，以减轻糖尿病患者的心血管风险。

本研究的核心发现揭示了褪黑素通过调控STING信号通路，同时抑制心肌炎症与坏死性凋亡的双重保护机制，为理解糖尿病心肌病的发病机制提供了新的视角，也为临床干预策略的开发奠定了理论基础。

已有研究指出，巨噬细胞在糖尿病心肌病中的浸润与炎症反应密切相关，且其活性受到多种因素的调控，包括细胞因子和信号通路的交互作用^{［39， 40］}。本研究证实，褪黑素治疗可显著减轻糖尿病心肌炎症反应。其机制不仅在于褪黑素直接抑制炎症因子的表达，更在于其对免疫细胞浸润的调控作用。褪黑素处理后，糖尿病小鼠血管组织免疫细胞浸润显著减少，血清及心肌组织中炎症因子（IL-1β，TNF-α）表达降低，这一结果表明，褪黑素可能通过干预免疫细胞的趋化和激活，从上游阻断炎症级联反应^{［41， 42］}。在这一背景下，未来的研究应进一步探讨褪黑素对其他免疫细胞类型的调控及其在糖尿病心肌病中的作用机制。

褪黑素治疗可以显著降低心肌细胞的坏死性凋亡，这一保护作用的机制涉及对RIPK1/RIPK3/MLKL信号轴的抑制。已有文献表明，坏死性凋亡是心肌细胞在病理状态下的重要死亡方式，这一过程的机制涉及细胞内钙离子浓度的异常升高和信号转导途径的激活^［43］。这一结果通过坏死性凋亡相关蛋白（如P-MLKL，P-RIPK3，P-RIPK1）的表达降低得到证实。本研究的发现与现有研究一致，进一步强调了褪黑素在调控心肌细胞死亡机制中的重要性^［44-47］。坏死性凋亡与炎症反应之间存在相互促进的关系——坏死细胞释放的损伤相关分子模式（DAMPs）可进一步激活炎症通路，形成恶性循环。因此，褪黑素同时抑制坏死性凋亡和炎症，可能打破了这一正反馈环路，从而实现更全面的心肌保护。此外，本研究首次将褪黑素与坏死性凋亡信号通路的直接关联进行探讨，揭示了其潜在的保护作用，进而提示褪黑素可能成为治疗心脏疾病的新靶点。

褪黑素通过抑制STING信号通路，降低下游干扰素的产生进一步减轻心肌炎症反应。STING作为胞质DNA感受器，在高血糖状态下可被线粒体DNA泄漏或氧化应激产物激活，进而磷酸化TBK1和IRF3，启动I型干扰素和促炎因子的转录。已有研究表明，STING通路的过度激活与多种心血管疾病的进展密切相关，包括糖尿病心肌病^［48-50］。STING信号通路在心肌炎症中扮演着重要角色。其激活导致下游干扰素和促炎细胞因子的表达上升，从而加剧心肌损伤^［51］。通过抑制STING信号通路降低下游干扰素产生的机制，为褪黑素在心脏疾病中的应用提供了理论基础。研究发现，STING通路的异常激活与多种心脏疾病的发展相关，包括糖尿病心肌病^{［52， 53］}。本研究的创新之处在于，首次证实褪黑素能够直接干预STING通路的激活过程，而非仅仅作用于下游效应分子。通过抑制STING磷酸化及其向高尔基体的转运，褪黑素从源头上阻断了干扰素的产生，从而减轻心肌损伤。这一结果与文献［54，55］中对STING通路的描述相契合，进一步揭示了褪黑素对STING通路的直接抑制作用，填补了这一领域的知识空白。基于这一机制，靶向STING通路或可成为治疗糖尿病心肌病及其他炎症性心脏疾病的新方向。

在药理学方面，褪黑素的给药方案在糖尿病心肌病小鼠模型中显示出良好的药理效果，且无明显副作用。相较于传统抗炎药物多靶向单一炎症介质，褪黑素的独特优势在于其多靶点调控特性——既能直接清除自由基，又能通过膜受体和核受体介导的信号转导，调控STING等多个关键通路。已有研究表明，褪黑素在心血管疾病中的应用潜力逐渐受到重视，尤其在其抗氧化和抗炎方面的作用^{［56， 57］}。本研究结果与先前的药理学研究一致，进一步支持了褪黑素作为潜在治疗药物的安全性和有效性^［58］。然而，与其他抗炎药物相比，褪黑素的独特机制尚未被深入探讨，这为未来的研究提供了新的方向。

本研究的局限性主要体现在以下方面。尽管我们在小鼠模型中及细胞模型中观察到褪黑素对心肌炎症和坏死性凋亡的显著影响，但样本量相对较小，可能影响结果的统计学效能。此外，本研究主要关注STING通路，未能完全排除其他潜在机制（如自噬调控，线粒体动力学改变）的参与。由于未能进行临床验证，本研究结果的外部可推广性仍有限。未来研究应在更大样本量的动物模型中验证本发现，并结合STING基因敲除或过表达模型，进一步明确褪黑素作用的特异性。同时，探索褪黑素在糖尿病患者中的疗效及其与现有降糖药物的相互作用，将是推动临床转化的重要步骤。

总体而言，本研究首次揭示了褪黑素通过抑制STING信号通路减轻糖尿病心肌病小鼠模型中心肌炎症及坏死性凋亡的机制，这一发现不仅阐明了褪黑素发挥心脏保护作用的关键分子靶点，也为糖尿病心肌病的治疗提供了新策略——褪黑素作为一种安全性良好的内源性激素，具有快速进入临床转化的潜力。这一发现为糖尿病心肌病的治疗提供了新的思路，未来研究应进一步探讨褪黑素的临床应用潜力，特别是在不同人群中的疗效，以及其对其他心血管疾病的潜在保护作用。通过深入理解褪黑素的免疫调控机制，或可为心血管疾病的精准治疗开辟新途径。

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基金资助

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2022D01C223)

重庆医科大学博士创新项目(CYYY-BSYJSKYCXXM202410)

重庆市医学人才-青年拔尖人才项目(YXQN2025067)

重庆市教育委员会科学技术研究项目(KJQN202300412)

重庆市自然科学基金面上项目(CSTB2024NSCQ-MSX1212)

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