双波长光声显微镜揭示肝纤维化微循环功能障碍及空间异质性

Dual-wavelength photoacoustic microscopy for evaluation of microcirculatory dysfunction and spatial heterogeneity in mice with liver fibrosis

摘要

目的 应用双波长高分辨率光声显微镜，系统比较正常与纤维化肝脏在微血管结构、血氧饱和度（sO₂）、血流动力学、微血管通透性及局部氧代谢率（MRO₂）等方面的差异，并揭示其区域异质性特征。 方法 建立正常对照组和四氯化碳（CCl₄）诱导的肝纤维化模型组，在活体条件下采用双波长光声显微镜进行肝内微循环多参数成像。首先获取肝内微血管结构图像，随后基于双波长光声信号并结合光谱分离算法重建sO₂分布图。以肝小叶内汇管区和中央静脉区为主要分析区域，结合伊文思蓝（EB）动态外渗分析评估血管通透性及纤维化进展的空间异质性。采用多普勒带宽展宽法测量肝内微血管血流速度，并结合sO₂参数计算局部氧代谢率。 结果 与正常组相比，肝纤维化组肝内微血管网络结构紊乱、局部稀疏及分支受损。肝纤维化组肝内微血管sO₂显著下降［（93.62±2.44）% vs （85.53±3.37）%，P<0.05，n=3］；EB动态示踪显示肝纤维化组外渗增强，肝小叶内汇管区与中央静脉区示踪剂扩散动力学存在明显差异（P<0.05），呈现显著空间异质性；正常组微血管血流速度为4.16±0.25 mm/s，肝纤维化组为3.43±0.32 mm/s，两组间血流速度差异具有统计学意义（P<0.05）；肝纤维化组局部氧代谢率相较于正常组呈下降趋势（0.40±0.026 mL·100 g^-1·min^-1vs 0.35±0.048 mL·100 g^-1·min^-1）。 结论 基于光声显微镜的多参数成像能够实现肝纤维化进程中微循环结构与功能的系统性多维评估，肝纤维化组肝内微血管sO₂和血流速度均显著低于正常组，结合其空间异质性分析，该方法有望为肝纤维化的分期评估、机制研究及疗效评估提供重要的影像学依据。

Abstract

Objective To investigate microcirculatory dysfunction and spatial heterogeneity in mice with liver fibrosis using dual-wavelength high-resolution photoacoustic microscopy (PAM). Methods In a male C57BL/6 mouse model of CCl₄-induced liver fibrosis, multiparametric imaging of intrahepatic microcirculation was performed using dual-wavelength PAM. The acquired images were used for reconstruction of blood oxygen saturation (sO₂) distribution maps based on PAM signals and using a spectral unmixing algorithm. The portal area and central vein region within the hepatic lobule were defined as the main regions of interest, and Evans Blue dynamic extravasation analysis was used to assess vascular permeability and spatial heterogeneity of fibrosis progression. Intrahepatic microvascular blood flow velocity was measured using the Doppler bandwidth broadening method, and the local metabolic rate of oxygen (MRO₂) was calculated based on sO₂ parameters. Results Compared with normal mice, the mice with liver fibrosis exhibited disorganized intrahepatic microvascular network architecture, focal rarefaction, and impaired branching structures with significantly decreased intrahepatic microvascular sO₂ [(93.62±2.44)% vs (85.53±3.37)%, P<0.05). Evans Blue dynamic tracing showed increased extravasation in the liver fibrosis group, and tracer diffusion kinetics differed significantly between the portal area and central vein region within the hepatic lobule, indicating marked spatial heterogeneity. Microvascular blood flow velocity was significantly lower in liver fibrosis group than in the normal control group (3.43±0.32 vs 4.16±0.25 mm/s; P<0.05). The local MRO₂ showed a decreasing trend in the liver fibrosis group compared with the normal control group (0.40±0.026 mL·100 g^-1·min^-1vs 0.35±0.048 mL·100 g^-1·min^-1). Conclusion Multiparametric imaging based on PAM enables systematic and multidimensional assessment of microcirculatory structural and functional alterations in mice during liver fibrosis progression, highlighting significant reductions of intrahepatic microvascular sO₂ and blood flow velocity. This approach combined with spatial heterogeneity analysis provides important imaging evidence for staging assessment, mechanistic study, and therapeutic efficacy evaluation for liver fibrosis.

Graphical abstract

关键词

光声显微成像 / 肝纤维化 / 微血管通透性 / 空间异质性

Key words

photoacoustic microscopy / liver fibrosis / microvascular permeability / spatial heterogeneity

肝纤维化是多种慢性肝病在持续性损伤与修复反应失衡条件下发展的病理过程，其核心特征表现为细胞外基质的过度沉积与异常分布^［1］。在此过程中，肝内微循环的异常改变往往同步发生并贯穿疾病始终。肝脏密集的微血管网络不仅承担着氧气与营养物质的输送，还负责代谢废物的交换，其结构与功能的完整性对维持肝细胞稳态至关重要。当肝脏进入纤维化状态后，微血管的形态结构、局部血流灌注及组织氧合水平均可能发生一系列复杂且动态的变化^{［2， 3］}。此外，纤维化病变在肝组织内的空间分布具有显著异质性，病灶区域与相对正常区域交错存在，这使得基于单一指标或局部采样的评估方法难以全面、准确地刻画微循环紊乱的整体图景与演进规律^［4-6］。因此，从微血管结构、血流动力学、血管通透性及组织局部氧代谢率（MRO₂）等多个维度，对正常与纤维化肝脏进行系统性的比较研究，对于深入理解肝纤维化的病理生理机制及开发新的评估策略具有重要意义。

目前，临床诊断肝纤维化的金标准仍是肝穿刺活检及其后续的组织学评估，该方法能提供直观的结构学证据^［7］。然而，活检属于有创操作，且依赖离体组织样本，无法反映活体状态下肝脏的血流灌注、氧合水平及物质交换等动态功能信息。诸如磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）及计算机断层扫描（CT）等非侵入性影像技术，虽能提供一定的血流与血管功能参数，但其空间分辨率或时间分辨率往往不足以清晰显示肝窦水平的微循环细节^［8-12］。此外，这些方法通常需要注射外源性造影剂或放射性示踪剂，可能存在成本较高、操作复杂或电离辐射等局限性。光声成像作为一种新兴的成像技术，巧妙地结合了光学成像的高光学对比度与超声成像的深层组织穿透能力^［13］。它利用内源性发色团（如血红蛋白）的光吸收特性，可在无需外源标记的情况下，实现对血管网络的高对比度结构成像。光声显微镜（PAM）进一步将空间分辨率提升至微米级^［14］，能够清晰解析肝小叶水平的微血管形态细节。更重要的是，通过双波长激发及光谱分离技术，PAM可定量绘制组织的血氧饱和度（sO₂）分布图，实现功能成像^［15］。此外，该技术通过对光声信号的深度分析，还能实现血红蛋白浓度的相对定量^［16］及微血管血流速度的测量（例如基于光声多普勒、带宽展宽、相关光谱法等原理），为评估组织代谢率提供了可能^［17-20］。这些技术特点使得PAM特别适合于在活体、无创的条件下，对肝脏微循环进行多参数、全方位的定量研究。

基于此，本研究旨在利用双波长高分辨率PAM，对正常与纤维化模型小鼠的肝脏微循环进行系统的对照研究。我们通过采集532 nm与559 nm双波长下的光声信号，重构微血管结构并定量分析其sO₂分布；采用基于带宽展宽原理的方法测量微血管血流速度，进而计算MRO₂；同时，通过动态监测外源性示踪剂伊文思蓝（EB）的血管外渗过程，评估并比较两组肝脏的微血管通透性及其在肝小叶内的空间分布异质性。我们期望通过这一多维度的成像分析，为肝纤维化微循环功能障碍的空间异质性特征提供新的见解，并探索一种潜在的、全面的无创影像学评估框架。

1 材料和方法

1.1 光声成像系统

本文所使用的双波长PAM如图1所示。系统使用两台脉冲激光器作为激发源，其中波长为532 nm的激光器脉冲宽度为5 ns，重复频率为5 kHz；波长为559 nm的激光器脉冲宽度为5 ns，重复频率为3 kHz。激光输出经扩束镜扩束，以匹配物镜孔径。使用中性密度滤光片调节激光能量。两束激光通过二向色镜合束，随后利用偏振分光棱镜立方体将光束分为两路。其中一路被引导至光电二极管，用于监测激光强度波动；另一路经物镜聚焦于样本。超声换能器中心频率为50 MHz。

1.2 实验动物

本实验选用C57BL/6雄性小鼠作为研究对象，体质量18~28 g，周龄6~9周。所有小鼠均由广东省医学实验动物中心提供，饲养于独立通风笼具中，环境温度维持在24 ℃，采用12 h光照/12 h黑暗循环，小鼠自由获取标准饲料及饮用水。实验小鼠随机分为两组：肝纤维化模型组（n=3）与正常对照组（n=3）。将四氯化碳用橄榄油稀释至20%浓度，按3 mL/kg的剂量对模型组小鼠进行腹腔注射以诱导肝纤维化。本实验方案经广东省人民医院伦理委员会批准，并严格遵守实验动物使用与福利伦理准则（伦理批号：KY2024-1140-03）。

1.3 小鼠肝脏微血管成像及sO₂测定

实验前，使用2%异氟醚麻醉小鼠，剃除腹部毛发并作小切口暴露肝脏，随后对肝脏进行逐点扫描。扫描参数为：扫描范围2 mm×2 mm，步长5 μm，脉冲激光能量250 nJ，能量密度约为17 mJ/cm²，低于ANSI 最大允许照射量（MPE）参考限值20 mJ/cm²。基于氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的光学吸收光谱差异，通过双波长PAM（本研究中为532 nm和559 nm）采集的光声信号来计算s{O}_{\mathrm{2}}。

P_{\mathrm{532}}=k\eta T\left({\epsilon }_{{\mathrm{532}}_{Hb}}Hb+{\epsilon }_{{\mathrm{532}}_{Hb{O}_{\mathrm{2}}}}Hb{O}_{\mathrm{2}}\right)(1)

P_{\mathrm{559}}=k\eta T\left({\epsilon }_{{\mathrm{559}}_{Hb}}Hb+{\epsilon }_{{\mathrm{559}}_{Hb{O}_{\mathrm{2}}}}Hb{O}_{\mathrm{2}}\right)(2)

s{O}_{\mathrm{2}}=\frac{P_{\mathrm{532}}{\epsilon }_{{\mathrm{559}}_{Hb}}-P_{\mathrm{559}}{\epsilon }_{{\mathrm{532}}_{Hb}}}{P_{\mathrm{532}}\left({\epsilon }_{{\mathrm{559}}_{Hb}}-{\epsilon }_{{\mathrm{559}}_{Hb{O}_{\mathrm{2}}}}\right)+P_{\mathrm{559}}\left({\epsilon }_{{\mathrm{532}}_{Hb{O}_{\mathrm{2}}}}-{\epsilon }_{{\mathrm{532}}_{Hb}}\right)}(3)

用EB染料评估肝脏血管通透性。在基线成像后，使用注射泵将8 mg/mL的EB染料经小鼠尾静脉注入，注射后每分钟对肝脏进行1次成像。

1.4 横向血流速度及MRO₂测量实验

为实现对微血管网络中横向血流的定量成像，本研究采用基于光声多普勒带宽展宽的流速测量方法^［17］。该方法通过分析流动颗粒穿过声学聚焦区域时所引起的接收信号频谱展宽，实现对垂直于探测方向的血流速度的测量。吸收粒子以速度v穿过超声换能器的聚焦区域时，粒子运动引起的多普勒效应主要表现为接收信号的带宽展宽，而非中心频率的位移。展宽带宽B_d与流速成正比，其关系由以下公式描述：

B_d=f_{\mathrm{0}}\frac{v}{c}\frac{W}{F}sin\theta(4)

其中，f_{\mathrm{0}}为换能器中心频率，c为声速，W与F分别为换能器孔径直径与焦距，\theta为多普勒角（横向流动时\theta为90°，此时展宽最大）。为从时间序列A线信号中提取带宽展宽信息，首先对原始信号进行数字带通滤波，以提高信号的信噪比；随后，对滤波后的信号进行希尔伯特变换，以获取其解析信号\tilde{p}(t)；最后，通过计算连续16条A-line信号的标准差来估计多普勒带宽展宽B_d的数值。

B_d=\frac{k}{T}{(\mathrm{1}-\frac{\left|{\sum }_{j=\mathrm{1}}^n{\tilde{p}}_j{\tilde{p}}_{j+\mathrm{1}}^{\mathrm{*}}\right|}{{\sum }_{j=\mathrm{1}}^n{\tilde{p}}_j{\tilde{p}}_j^{\mathrm{*}}})}^{\frac{\mathrm{1}}{\mathrm{2}}}(5)

其中T为相邻A线时间间隔，k为恒定因子。n是同一个点连续扫描A线的数量。

在获取横向血流速度和sO₂的基础上，进一步计算了MRO₂。与仅反应组织内静态氧浓度水平的sO₂不同，MRO₂直接反映了氧消耗速率。该参数基于Fick原理，具体计算如下：

MR{O}_{\mathrm{2}}=\epsilon \times C_{Hb}\times \left(s{O}_{\mathrm{2}in}-s{O}_{\mathrm{2}out}\right)\times \frac{\pi D^{\mathrm{2}}v}{\mathrm{4}w}(6)

其中，\epsilon是血红蛋白的氧结合能力（每克血红蛋白可结合1.36 mL氧气）。C_{Hb}为总的血红蛋白浓度。在本系统测量中，由于受组织深度处局部光照度难以绝对定量的限制，C_{Hb}难以直接获得绝对值。本研究通过双波长光声信号的振幅总和计算相对总血红蛋白浓度，并结合健康成年C57BL/6小鼠的生理血红蛋白浓度参考值进行基线校准，从而估算C_{Hb}。下标in和out分别表示供血血管和输出血管。基于肝小叶的血流解剖特征，本研究在视野范围内选取汇管区（area）的微小动脉/静脉分支定义为输入血管，选取中央静脉（vein）定义为输出血管。在数据处理时，通过手动勾画多个汇管区及中央静脉作为感兴趣区（ROI），分别提取参数并取平均值代入计算。D为血管直径，V是血管内的平均流速。w表示扫描范围内小鼠肝脏的重量。

1.5 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计处理，使用Shapiro-Wilk检验验证数据分布，对于EB外渗信号数据，满足正态分布的数据进行配对t检验，否则进行配对Wilcoxon检验；对于sO₂、血流速度、MRO₂数据，以均数±标准差表示，满足正态分布的数据进行独立t检验，不符合正态分布进行Mann-Whitney U检验。P<0.05认为差异有统计学意义。采用Shapiro-Wilk检验对各组定量指标进行正态性检验。结果显示，各主要定量指标均未显著偏离正态分布（Shapiro-Wilk检验，P值范围为0.29~0.97，均P>0.05）。

2 结果

2.1 肝纤维化微血管结构改变

双波长PAM成像显示，正常肝脏与肝纤维化肝脏的微血管结构存在显著差异。正常肝脏组织（图2A）表现为密集、均匀分布的血管网络，肝小叶形态结构完整，门静脉与肝动脉分支有序汇入中央静脉。光声信号在整个小叶内分布均匀，信号强度较高，反映正常肝组织血供丰富且微循环通畅。在肝纤维化状态下，肝小叶结构紊乱、形态扭曲、边界模糊，微血管稀疏、排列不规则且网络连续性中断。正常肝组织sO₂（图2B）均匀较高，无明显低氧区；在肝纤维化中sO₂（图2C）整体下降，出现低氧区。正常组肝内微血管sO₂为（93.62±2.44）% （n=3），肝纤维化组为（85.53±3.37）%，差异具有统计学意义（P<0.05，图2D）。

2.2 肝纤维化微血管通透性变化

在正常肝组织中，注射EB后汇管区和中央静脉区均呈现点状扩散信号（图3），随时间逐渐增多，血管外扩散信号较少。在肝纤维化模型中EB扩散表现出明显的差异（图4A），在同一个肝小叶中，汇管区具有点状扩散信号，而中央静脉区则呈现弥散性信号。定量分析显示，正常组汇管区与中央静脉区EB信号（图4B）的动力学参数差异没有统计学意义（P>0.05）；纤维化组汇管区与中央静脉区EB信号（图4C）的动力学参数差异存在统计学意义（P<0.05）：汇管区信号的初始上升斜率较高，而中央静脉区信号的最终累积量显著更大。

2.3 肝纤维化血流和MRO₂变化

系统测量的血流速度在0-7 mm/s范围内与设定值具有良好的线性关系（R²=0.98）。正常组微血管血流速度为4.16±0.25 mm/s，肝纤维化组为3.43±0.32 mm/s。两组间血流速度差异具有统计学意义（P<0.05）。正常组MRO₂为0.40±0.026 mL·100 g^-1·min^-1，肝纤维化组为0.35±0.048 mL·100 g^-1·min^-1，呈下降趋势，差异无统计学意义（图5）。

3 讨论

本研究利用PAM技术，从微血管结构、通透性及血流动力学3个维度，系统揭示了肝纤维化进程中肝脏微循环的显著异常。首先，在结构层面，研究结果证实纤维化肝脏呈现出微血管网络稀疏、排列紊乱及结构完整性丧失等病理特征^{［22， 23］}。与正常肝脏中致密、有序的微血管网络相比，纤维化肝脏内血管段间连接减少、走形迂曲不规则，连续性明显下降。这些结构性改变直接破坏了原本均匀的sO₂分布，导致组织中出现广泛低氧区域，提示局部灌注不足与氧供受损。这为“缺氧微环境驱动肝星状细胞活化及纤维化进展”的学说提供了直接的活体影像学证据^{［2， 24］}。

在血管通透性方面，本研究结合EB动态示踪与数字减影技术进行定量评估，发现肝纤维化状态下血管通透性的改变并非均一，而是在肝小叶尺度呈现显著的空间异质性。汇管区与中央静脉区在示踪剂扩散动力学上表现迥异—汇管区初始扩散速率快，而中央静脉区最终累积量高。此外，从早期点状扩散到晚期片状扩散的模式演变，进一步揭示了肝纤维化病理改变的动态进程与区域特异性。这种异质性可能与不同区域炎症细胞浸润程度、内皮细胞功能紊乱以及细胞外基质沉积差异密切相关^{［25， 26］}。因此，仅凭单一时间点或单一区域的评估，难以全面反映纤维化微环境的复杂性；而对动态过程与空间分布进行联合刻画，则能更准确地捕捉病理演进的进行性特征。

在血流动力学与MRO₂方面，基于仿体实验验证的流速测量方法，本研究证实肝纤维化肝血窦的血流速度与MRO₂均显著降低。血流灌注的减少与氧合水平的下降相互关联，形成恶性循环，可能进一步加剧肝细胞损伤与纤维化进程^{［27， 28］}。本研究在微血管尺度观察到的血流减缓与MRO₂下降，与纤维化背景下微循环整体灌注能力衰退的宏观病理生理趋势相一致^［29］。需要指出的是，本研究亦存在一定的局限性。首先，与微血管结构成像相比，血流成像的数据采集与处理流程更为复杂，成像时间较长，这可能对长时间连续观测构成一定限制。其次，所有实验均在麻醉状态下进行，麻醉药物可能通过影响心率、血压及外周血管张力等，改变机体基础血流动力学状态，因此本研究测得的血流参数与清醒动物生理状态下的真实值可能存在差异。此外，本研究样本量相对较小，每组仅纳入3只动物，可能导致统计效力不足，并增加个体差异对研究结果的影响。虽然本研究中部分指标显示出统计学差异，但由于实验设计阶段未进行正式的事前样本量计算或统计效力分析，因此研究结果的稳定性和外推性仍受到一定限制。根据本研究主要观察指标的初步数据进行样本量估算，在双侧α=0.05、检验效能power=0.80、两组样本量比例为1∶1的条件下，每组约需4只动物，而本研究实际每组为3只动物，低于估算所需样本量。因此，本研究结果更适合作为初步探索性研究，后续仍需扩大样本量并开展进一步验证。最后，在局部MRO₂的计算中，由于光声成像在深层组织中光强衰减的复杂性，直接通过光声信号获取血红蛋白绝对浓度C_{Hb}仍具挑战，本研究所采用的生理基线校准及相对定量方法可能在绝对数值上存在一定偏差，未来需引入等吸收点波长或结合多模态影像以实现更精确的绝对定量。

综上所述，本研究通过PAM的多参数成像能力，不仅直观显示了肝纤维化中微血管结构的破坏，更重要的是实现了对微循环功能（通透性、血流、MRO₂）动态变化与空间异质性的定量刻画。这些发现表明，整合微血管结构、sO₂、通透性及血流等多维参数，并结合其空间异质性分析，能够为肝纤维化提供更丰富、更系统的影像学表征。该方法有望为肝纤维化的分期评估、机制研究及疗效评估提供重要的影像学依据。

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