头顶一颗珠通过调节内质网自噬保护卒中后认知障碍大鼠的神经功能

Trillium tschonoskii Maxim saponin protects neurological function in rats with post-stroke cognitive impairment by promoting ER-phagy

摘要

目的 探讨头顶一颗珠（TTM）通过调节内质网自噬对卒中后认知障碍（PSCI）大鼠的神经保护作用。 方法 通过改良线栓法建立卒中后认知障碍大鼠模型，分为Sham组、Model组、TTM组、自噬诱导剂雷帕霉素组（Rap）、自噬抑制剂3-甲基-3H-嘌呤-6-胺组（3-MA）及TTM+3-MA组，10只/组，对应处理各组大鼠。采用HE染色、Nissl染色观察各组大鼠脑组织病理学变化，TUNEL染色观察各组大鼠神经元凋亡情况，Western blotting法检查各组大鼠内质网自噬相关蛋白及凋亡蛋白的表达。采用Morris水迷宫观察各组大鼠学习记忆功能，采用免疫组织化学法观察自噬相关5（ATG5）与葡萄糖调节蛋白78 （GRP78）的阳性表达；采用高尔基染色观察神经元树突棘数量；采用免疫荧光观察各组大鼠脑组织中NeuN的表达及网状吞噬调节剂 1（FAM134B）、钙连蛋白Calnexin与微管相关蛋白轻链 3（LC3）的共定位表达；采用Western blotting检测各组大鼠海马组织中FAM134B、ATG5、鳌合体1（P62）、LC3、GRP78、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2基因（BCL-2）、白介素-10 （IL-10）、白细胞介素-1β （IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）蛋白的表达。 结果 与Sham组对比，Model组大鼠逃避潜伏的过程中时间明显增加，在目标区域停留时间则有所缩短，穿越该平台次数有所减少（P<0.05）；组织病理学示大鼠海马组织细胞数量减少，排列稀疏、紊乱，核固缩，空泡化严重；尼氏小体数量减少；脑组织中ATG5与GRP78阳性表达增加；神经元凋亡增加（P<0.05），FAM134B与LC3、Calnexin与LC3共定位稍增加。Western blotting结果显示海马组织中IL-1β、TNF-α、Bax蛋白表达升高（P<0.05），IL-10、BCL-2蛋白表达下降（P<0.05），GRP78、FAM134B、P62蛋白表达上调（P<0.05），LC3表达下调。与Model组对比，TTM组大鼠逃避潜伏时间有所缩短，在目标象限停留时间增加，穿越平台次数增多（P<0.05）；组织病理学示ATG5表达进一步增加，而GRP78表达减少；神经元树突棘增加，FAM134B与LC3、Calnexin与LC3共定位增加。Western blotting结果显示IL-1β、TNF-α、Bax、GRP78及P62蛋白表达下降（P<0.05），FAM134B、ATG5、LC3、IL-10和BCL-2蛋白表达升高（P<0.05）；3-MA组与TTM组趋势相反。 结论 卒中早期细胞内质网应激被过度激活，适应性信号转变为促凋亡信号，内质网自噬虽被激活但通量不足，无法减轻细胞组织损伤、神经元凋亡，导致神经功能下降伤。TTM可通过调节内质网自噬，缓解过度激活的内质网应激，减轻大鼠脑组织病理损伤，减轻炎症反应与凋亡，减少神经元树突棘丢失，从而对卒中后认知障碍大鼠认知功能起保护作用。

Abstract

Objective To investigate the mechanism that mediates the neuroprotective effects of Trillium tschonoskii Maxim (TTM) against post-stroke cognitive impairment (PSCI) in rats. Methods Adult SD rats were randomized into Sham operation, PSCI model, TTM, rapamycin (an autophagy inducer), 3-methyladenine (an autophagy inhibitor), and TTM+3-MA groups, and rat models of cognitive impairment were established using a modified thread occlusion method. Cognitive function of the rats was assessed using Morris water maze test. Histopathological changes, neuronal apoptosis, dendritic spines, and protein expressions of FAM134B, LC3, ATG5, P62, GRP78, Bax, Bcl-2, IL-10, IL-1β, and TNF-α were evaluated using HE, Nissl, TUNEL, Golgi staining, immunohistochemistry, immunofluorescence staining, and Western blotting. Results Compared with the sham-operated rats, the rat models of PSCI showed significantly prolonged escape latency, reduced target quadrant time and platform crossings, severe hippocampal damage, increased ATG5 and GRP78 expression, elevated apoptosis, increased IL-1β, TNF-α, Bax, GRP78, and P62 expressions, and decreased IL-10, Bcl-2, and LC3 expressions, with slightly increased FAM134B-LC3 and calnexin-LC3 co-localization. Compared with those in the model group, the rats receiving TTM treatment showed significantly shortened escape latency, increased target quadrant time and platform crossings, increased ATG5 and dendritic spines, decreased GRP78 expression, enhanced FAM134B-LC3 and calnexin-LC3 co-localization, reduced IL-1β, TNF-α, Bax, GRP78, and P62 expressions, and increased FAM134B, ATG5, LC3, IL-10, and Bcl-2 expressions; the rats treated with 3-MA showed the opposite changes. Conclusion Excessive ER stress is activated early after stroke, shifting from adaptive to pro-apoptotic signaling, with insufficient ER-phagy flux. TTM modulates ER-phagy, alleviates ERS, reduces neuroinflammation and apoptosis, protects dendritic spines, and improves cognitive function in rats with PSCI.

Graphical abstract

关键词

头顶一颗珠 / 内质网自噬 / 卒中后认知障碍 / 神经保护

Key words

Trillium tschonoskii Maxim saponin / ER-phagy / post-stroke cognitive impairment / neuroprotection

人口老年化加剧是卒中发生率不断升高的一个主要原因。卒中后最常见的后遗症包括以认知功能受损为主要特征的卒中后认知障碍（PSCI），其发生率可高达53.1%，给个人、家庭及社会带来了沉重负担^［1］。PSCI发病机制尚未完全明确，已知神经炎性损伤^［2］、血脑屏障损害^［3］、线粒体功能障碍^［4］及氧化应激^［5］等病理损伤激活细胞死亡机制，加重神经元损伤，最终导致了卒中患者神经功能缺损，出现不同程度的认知障碍。

内质网（ER）作为核心细胞器，其功能异常是许多病理过程的关键环节，目前对内质网的研究主要集中在内质网应激等方向。在脑卒中刺激下，内质网稳态失衡，触发未折叠蛋白反应和内质网相关降解清除受损蛋白以维持内质网稳态，但仍有一部分受损蛋白不能被清除，持续存在的应激导致细胞损伤甚至死亡^{［6， 7］}。研究发现，存在一种对受损蛋白及内质网的特异性清除途径，即内质网自噬。内质网自噬由特定的内质网噬受体介导，它不光能够及时清除受损蛋白，还能在应激结束后吞噬扩张的内质网以恢复内质网体积^{［8， 9］}。在癌症中，该机制一方面通过减轻过度的内质网应激帮助癌细胞适应环境，促进癌细胞转移；另一方面也可能直接诱导癌细胞死亡^{［10， 11］}。内质网自噬机制也参与了一些脑血管疾病，对于PSCI的发生，我们猜测该机制也参与其中。

近年来，中医药在治疗PSCI上也做出了巨大贡献。头顶一颗珠（TTM）是土家族珍惜药物。目前从TTM中分离出的有效成分包括延龄草皂苷、薯蓣皂苷、甾醇及其他微量元素。研究发现TTM是一种新型自噬激活剂，并且在体外和体内均有抗氧化作用^［12］。本课题组前期研究也发现延龄草皂苷能够通过调节Rheb-mTOR信号通路介导的自噬，改善D-半乳糖诱导的衰老大鼠的学习记忆能力，从而发挥抗衰老作用^［13］。然而其在PSCI中的研究还不够深入，本研究使用改良线栓法建立PSCI大鼠模型，研究内质网自噬对PSCI大鼠的影响，探讨TTM对PSCI大鼠发挥神经保护作用及其潜在机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠90只，2月龄，体质量210~250 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2020-0001，饲养环境24~26 ℃，相对湿度50%~60%，光线明暗交替，保持通风，自由饮食，适应性喂养7 d后开始实验。本实验经湖北民族大学医学伦理委员会审核通过（伦理批号：2023040），实验过程符合相关规定。

1.2 主要试剂与仪器

头顶一颗珠提取物，由湖北民族大学中药实验室提取，自噬抑制剂3-甲基-3H-嘌呤-6-胺（3-MA，IM0190）、自噬诱导剂雷帕霉素（Rap，R8140）（北京索莱宝科技有限公司）；兔抗FAM134B多克隆抗体（21537-1-AP）、兔抗ATG5多克隆抗体（10181-2-AP）、鼠抗IL-10单克隆抗体（60269-1-Ig）、兔抗TNF-α多克隆抗体（17590-1-AP）、兔抗Bcl-2多克隆抗体（26593-1-AP）、鼠抗NeuN单克隆抗体（66836-1-Ig）、兔抗Bax多克隆抗体（50599-2-Ig）、鼠抗beta actin单克隆抗体（66009-1-Ig）（武汉三鹰生物技术有限公司）；兔抗Calnexin（340144，正能生物）；兔抗LC3B多克隆抗体（ab51520）、兔抗GRP78多克隆抗体（ab21685）、兔抗IL-1β多克隆抗体（ab9722）山羊抗兔（ab6721）、山羊抗小鼠（ab6789）（abcam）；鼠抗P62单克隆抗体（88588S，CST）；尼氏染色液（C0117）、苏木素伊红（HE）染色试剂盒（C0105S）、SDS-PAGE 快速配制试剂盒（P0012AC）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0010）、Western封闭液（P0252）（碧云天生物技术）；免疫组化试剂盒（KIT-9710，迈新生物）；高尔基染色液（GMS80020.3，杰美基因医药科技）；ECL发光显色试剂盒（RG235693，赛默飞）。

Morris 水迷宫系统（中国医学科学院药物研究所）；1510型酶标仪（赛默飞），Western blotting全套设备（Bio-Rad），全自动曝光成像系统（上海天能科技公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 动物分组与造模

采用改良线栓法^［14］建立卒中后认知障碍模型，具体操作如下：将大鼠麻醉后以仰卧位固定于手术台面，备皮消毒，逐层打开左侧颈部组织，分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉、翼腭动脉，将线栓插入颈内动脉后固定线栓。假手术组（n=10）仅分离血管，不结扎。术后将大鼠移至清洁垫料盒中复苏，2 h后拔出线栓并立即采用Zea-Longa五分法筛选出1~3分符合实验的大鼠，其余剔除^［14］。将筛选后大鼠随机分为模型组、自噬抑制剂（3-MA）组，自噬诱导剂（Rap）组，TTM组、TTM+自噬抑制剂（TTM+3-MA）组，10只/组。分组后，各组注射及灌胃不同药物。具体如下：3-MA组及TTM+3-MA组腹腔注射3-MA 15 mg/kg，Rap组腹腔注射Rap 1 mg/kg，其余3组注射等体积生理盐水，连续注射3 d^{［15， 16］}。TTM组及TTM+3-MA组给予TTM 100 mg/kg灌胃，假手术组与模型组、3-MA组、Rap组给予等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续灌胃28 d。

1.3.2 Morris水迷宫实验

主要测试大鼠空间记忆及学习能力，主要参考文献^［17］进行。将圆形泳池分成4个象限，从不同象限将大鼠面对池壁放入水中，记录大鼠活动轨迹及寻找平台时间，若大鼠在60 s内未能找到逃生平台，则人为引导至平台休息15~20 s，熟悉平台位置。学习3次/d，连续5 d。学习完成24 h后将平台撤走，记录大鼠60 s活动轨迹、穿越平台次数及在目标象限停留时间。

1.3.3 Golgi染色观察各组大鼠神经元树突棘变化

给药 28 d 并完成水迷宫实验后，每组随机抽出3只大鼠麻醉，经生理盐水心脏灌注后断头取脑，按照高尔基染色液说明书固着、切片、染色，使用中性树胶封片，使用高倍镜观察神经元树突及树突棘形状、数量及密度等，使用Image J软件对各组大鼠树突棘密度进行分析。

1.3.4 HE染色、Nissl染色观察各组大鼠脑组织病理学改变

给药 28 d 并完成水迷宫实验后，每组随机抽出3只大鼠麻醉，经心脏灌流后断头取脑，将脑组织脱水、包埋制成石蜡块。行4 μm切片，经过烤片、脱蜡、HE染色液或Nissl染色液染色后，中性树胶封片，扫描并观察病理改变。

1.3.5 TUNEL染色

同上将蜡块行4 μm切片，烤片脱蜡至水后按照试剂盒说明书操作，具体方法如下：将4 μm切片常规脱蜡后滴加蛋白酶K工作液，37 ℃反应20 min，PBS清洗后滴加1×DNaseⅠBuffer工作液，平衡5 min后滴加DNaseⅠ工作液，37 ℃孵育30 min。PBS清洗后滴加TdT Equilibration Buffer，37 ℃孵育30 min后，滴加阳性标记工作液反应60 min。PBS清洗后滴加DAPI孵育5 min，PBS清洗3次后滴加抗荧光猝灭封片剂，盖玻片封片，显微镜下观察神经元凋亡情况。

1.3.6 免疫组化法观察GRP78、ATG5蛋白的表达

同上将蜡块行4 μm切片，烤片过夜，脱蜡后使用柠檬酸高压修复，按照免疫组化试剂盒说明操作，具体方法如下：A液孵育10 min，PBS清洗3次，B液孵育10 min后分别滴加GRP78（1∶500）、ATG5 （1∶200）室温孵育2 h，PBS清洗3次，C液孵育10 min后PBS清洗3次，滴加D液孵育10 min清洗后滴加DAB显色液显色，上色后流水冲洗、苏木素复染、分化、返蓝，经无水、二甲苯后中性树胶封片，扫描观察病理变化。

1.3.7 免疫荧光法观察NeuN的表达及FAM134B、Calnexin与LC3的共定位表达

同上将蜡块行4 μm切片，脱蜡至水后采用EDTA抗原修复液修复，自然冷却后使用PBS清洗3次，5 min/次，甩干玻片后滴加自发荧光淬灭剂孵育5 min，流水冲洗10 min，BSA封闭30 min后滴加一抗（FAM134B 1∶300 、Calnexin 1∶100、NeuN 1∶300）4 ℃过夜，次日PBS清洗后滴加二抗孵育1 h，双标法加入第2个一抗（LC3 1∶1000）4 ℃过夜（单标法无此步骤），次日经PBS清洗后滴加二抗孵育1 h，PBS清洗后滴加DAPI染液孵育10 min，清洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.3.8 Western blotting检测大鼠海马组织中相关蛋白的表达

将剩余大鼠麻醉处死后，取出新鲜海马组织，部分放入-80 ℃冰箱备用。按组织与裂解液与蛋白酶抑制剂比例为10∶100∶1的比例裂解匀浆，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度并配平。按4 μL/孔上样，进行电泳、转膜、封闭、洗膜、一抗（FAM134B 1∶8000、GRP78 1∶1000、Bax 1∶50000、BCL-2 1∶1500、P62 1∶1000、LC3 1∶2000、IL-10 1∶4000、IL-1β 1∶5000、TNF-α 1∶2000、ATG5 1∶2500）孵育，4 ℃过夜，次日洗膜，二抗（鼠、兔）孵育1 h，洗膜后经ECL发光显色液显色，以β-actin为内参，采用 GIS 1D 分析软件计算灰度值。

1.3.9 统计学分析

使用SPSS 22.0软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差表示，服从正态分布且方差齐的数据做单因素方差分析和两两比较，对方差不齐做Welch校正和Tamhane's T₂两两比较；不服从正态分布的做Wilcoxon秩和检验，使用Graph Pad Prism 9.0软件绘制数据结果图。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内质网自噬减轻了PSCI大鼠脑组织病理损伤

与Model组相比，自噬抑制剂3-MA组海马细胞排列无规则，稀疏，紊乱，炎症浸润明显。而自噬诱导剂Rap组海马组织细胞清晰，排列整齐（图1A）。凋亡标记信号TUNEL染色发现，Model组较Sham组增加，3-MA组显著高于模型组，而Rap组低于模型组（图1B）；Western blotting结果发现3-MA组大鼠海马组织中FAM134B、GRP78、Bax、P62、LC3蛋白表达上调（P<0.05），Bcl-2蛋白表达下调；而Rap区别于3-MA组（图2）。

2.2 TTM可改善PSCI大鼠学习记忆功能

各组大鼠逃避潜伏时间在总体上呈下降趋势，但Model组大鼠逃避潜伏期显著延长，穿越平台次数减少，在目标象限停留时间较短（P<0.05）；TTM组较Model组逃避潜伏时间减少，穿越平台次数增加，在目标象限停留时间延长（P<0.05）；3-MA组与TTM组相反（P<0.05）；TTM+3-MA组成绩优于3-MA组（P<0.05）（图3）。

2.3 TTM可减轻PSCI大鼠脑组织炎症反应，减少神经元损伤及树突棘丢失

免疫荧光结果显示，模型组海马组织中NeuN数量减少，TTM组数量较之增加，3-MA组神经元数量极少，TTM+3MA组较之有所增加（图4A）。高尔基染色结果显示，Model组与3-MA组神经元树突棘显著减少，TTM组较之增加（P<0.05，图4B）。Western blotting结果显示，Model组大鼠海马组织中IL-1β、TNF-α、Bax蛋白表达升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表达下降（P<0.05）；TTM组与TTM+3-MA组神经元数量有所增加，TTM组IL-1β、TNF-α、Bax蛋白表达下降（P<0.05），IL-10、Bcl-2蛋白表达升高（P<0.05，图5）。

2.4 TTM可上调内质网自噬相关蛋白的表达

与Sham组对比，Model组ATG5与GRP78阳性细胞表达增加；与Model组对比，TTM组ATG5表达进一步增加，而GRP78表达减少（图6A）；免疫荧光共定位提示，Model组、3-MA组中FAM134B、Calnexin与LC3共定位表达减少，TTM组与TTM+3-MA组共定位表达增加，其中TTM组中共定位表达最显著（图6B）；Western blotting结果显示：与Model组对比，TTM组中FAM134B、ATG5、LC3蛋白表达增加，P62、GRP78蛋白表达减少（P<0.05），3-MA组结果与之相反（图7）。

3 讨 论

在脑血管疾病中，卒中是第3大致残原因。卒中发生20 min后即可导致缺血核心区域广泛性神经元死亡，若缺血组织长时间得不到再灌注，其他区域神经元也可能因与缺血神经元失去接触而死亡，造成PSCI或其他继发性疾病^［18］。目前对PSCI没有确切的治疗方案，但在缺血急性期快速恢复血流、减轻脑实质损伤及减少神经元凋亡可能对后期出现认知障碍具有预防作用。本研究结果显示，PSCI的发生与内质网应激的持续激活有关，通过内质网自噬减轻细胞内持续激活的应激状态，可改善PSCI大鼠的认知功能。本研究围绕TTM通过调节内质网自噬机制，探讨其在PSCI中的特殊效应，揭示了内质网稳态在神经元存活中的核心地位。

目前，内质网自噬在 PSCI 中的作用研究较少。在前期研究中，我们发现TTM可以改善衰老大鼠的认知障碍并通过抑制内质网应激减少 PSCI 大鼠神经元损伤^［19］。为了进一步研究TTM的作用机制，我们通过建立卒中后认知障碍模型观察到大鼠的学习记忆能力受损，海马组织中内质网应激相关蛋白水平有所上调，同时大鼠脑组织病理损伤加重，神经元凋亡增加，数量减少。此外，我们通过3-MA抑制自噬后发现大鼠学习记忆能力进一步下降，脑组织病理损伤进一步加重，海马区神经元凋亡不断增加，神经元数量显著减少，与Li^［20］的研究结果——内质网自噬为保护性机制相符。

脑缺血后内质网感受压力并启动 UPR 应对细胞环境变化，恢复稳态，但如果这一机制不能达到其目的，炎症和凋亡通路可能被激活，导致神经系统炎症反应加重，影响细胞存活^［21］。这种适应性应激向病理性应激的转化，说明了即使急性卒中后梗死灶稳定，认知功能仍下降的核心逻辑。自噬能通过促进免疫细胞存活和调节炎性细胞因子的表达和分泌，在调节炎症方面发挥着关键作用^［22］。我们发现抑制卒中后认知障碍大鼠内质网自噬后，GRP78的表达不断增加，后期虽有回落但仍处于高位，这提示细胞从急性应激转向慢性适应不良。IL-1β与 TNF-α的大量释放可导致神经元的死亡，而IL-10的释放可以诱导免疫抑制通路^［23］。自噬可以通过调节炎症因子的极化来促进炎症反应的下调。与此同时，Tack^［24］的研究显示在人类或实验动物中接受抗炎治疗均可以改善认知功能，说明卒中触发炎症反应，可能影响突触功能和认知状态。在既往的研究中我们已经发现TTM能够降低血管性痴呆大鼠海马组织中炎症因子的表达，从而保护 VCI 大鼠认知功能^［25］。在本研究中，模型组大鼠海马组织中促炎反应与凋亡反应显著激活，抗炎因子与抗凋亡因子被抑制，神经元树突棘数量显著下降。经过TTM处理后，炎症反应与凋亡反应得到抑制，神经元树突棘数量增加。

当神经元感受压力时，可以通过自噬清除蛋白质聚集和受损细胞器，回收氨基酸、脂肪酸和葡萄糖保存能量平衡，以及减轻 ER 压力，从而维护神经元细胞的生存和中枢神经系统的整体健康^{［26， 27］}。有研究发现内质网自噬功能失调会导致神经退行性病变遗传性感觉和自主神经病变（HSAN）Ⅱ型患者中基因突变使得 FAM134B 过度活跃，从而诱导过度的内质网自噬，这似乎是导致感觉神经元死亡的原因^{［28， 29］}。而在 HSAN I型患者中发现基因突变削弱了内质网自噬受体 ATL3 与 GABARAP 之间的相互作用，阻止了内质网自噬，导致内质网形态异常和神经元轴突生长缺陷^{［30， 31］}。这充分说明了在同一个疾病中，内质网自噬的机制也有所不同。FAM134B是内质网自噬特有受体，上调 FAM134B可以增强细胞内质网自噬；GRP78 是一种内质网腔分子伴侣，它能够在内质网应激时表达增加；Calnexin作为内质网跨膜蛋白，在内质网应激发生时可转化为自噬受体与LC3相结合。两者结合后，自噬膜包裹住Calnexin标记的内质网区域，形成内质网自噬体，最终与溶酶体融合，完成降解。P62、ATG5与 LC3属自噬的核心蛋白；ATG5主要参与自噬体的形成；P62作为自噬的效应因子与底物可以与LC3相互作用附着在自噬体上，并通过一系列途径将“货物”运送至溶酶体降解。在本研究中，TTM通过上调 PSCI大鼠脑组织中内质网自噬相关蛋白的表达，缓解了持续存在的内质网应激。

综上所述，本实验表明PSCI并非简单的神经元坏死，而是内质网稳态调控失败的后果，TTM通过调节细胞内质网自噬发挥神经保护功能。在卒中发生后，细胞内质网应激被过度激活，适应性信号转变为促凋亡信号，内质网自噬通量不足，造成细胞组织损伤、神经元凋亡，导致神经功能下降。TTM能够通过激活细胞内质网自噬抑制过度的内质网应激，减轻炎症反应与细胞凋亡，减轻细胞组织病理性损伤，从保护PSCI大鼠认知功能。

本研究仍存在局限性，尽管在动物模型中通过药物干预内质网自噬显示出神经保护作用，但本研究仅模拟了年轻健康大鼠急性期脑组织细胞死亡，而人类患病者常伴有其他基础病变，TTM是否还能通过其他机制对卒中后神经元起保护作用暂未可知，目前对中医药的研究仍任重而道远。

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基金资助

国家自然科学基金(82260821)

研究生教育创新项目(MYK2023072)

湖北民族大学科研项目(XN2303)

风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室青年项目(OIR202407Q)

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