痛泻要方通过调控SREBP-1/SCD1通路改善5-HT诱导的BRL 3A细胞氧化应激损伤

Mechanism of Tongxie Yaofang for reducing 5-HT-induced oxidative stress injury in BRL 3A cells: the mediating role of the SREBP-1/CD1 pathway

摘要

目的 研究SREBP-1/SCD1通路在5-HT致肝细胞BRL 3A细胞损伤中的作用，探讨痛泻要方含药血清对氧化应激损伤的保护作用及机制。 方法 制备含药血清及培养BRL 3A细胞：14只SD雄性大鼠予痛泻要方灌胃，每日1次，连续7 d，腹主动脉取血制备含药血清；用10%胎牛血清37 ℃、5%CO₂饱和湿度条件下培养。CCK-8法检测不同浓度5-HT（0.2、0.5、1、1.5 mmol/L）处理 BRL 3A 细胞48、72、96 h后细胞存活率。细胞培养给药后进行超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量检测，流式法检测细胞活性氧（ROS）含量。采用JC-1染色检测细胞线粒体膜电位变化，细胞电镜观察线粒体形态变化。免疫荧光法检测细胞自噬小体（由MDC特异性标记）及其标志蛋白LC3B，荧光显微镜下观察自噬体及其标志蛋白在细胞内的位置、表达情况及细胞核的形态变化。Western blotting法检测细胞Cyt-c、Caspase3、Gsk3β、beclin-1、LC3Ⅰ/Ⅱ、p62，SREBP-1、SCD1，5-HT_2AR蛋白表达水平。 结果 通过CCK-8测定细胞最适宜的生长浓度为1.5 mmol/L（P<0.01）；与model组相比，TXYF组ROS含量显著降低（P<0.0001）、MDA含量降低（P<0.05）、SOD含量升高（P<0.01）。与model组相比，TXYF组线粒体膜电位降低，UR降低（P<0.001），LR升高（P<0.001）；在透射电子显微镜下可观察到TXYF组线粒体肿胀程度较model组明显减轻，大部分线粒体嵴结构形态恢复。与model组相比，TXYF组LC3B和MDC免疫荧光强度下降（P<0.05），自噬相关蛋白Beclin-1降低（P<0.05）、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低、p62升高（P<0.01）；通过检测线粒体途径凋亡，TXYF组较model组Cyt-c降低（P<0.01），Caspase3及Gsk3β蛋白量降低但无统计学意义。与model组相比，TXYF组SREBP-1蛋白表达升高（P<0.05）、SCD1蛋白表达降低（P<0.01），5-HT_2AR蛋白表达降低（P<0.05）。 结论 痛泻要方含药血清可能通过SREBP-1/SCD1通路，调节SOD活力与自噬功能来减轻氧化应激和脂质过氧化损伤，对5-HT诱导的BRL 3A细胞损伤具有保护调节作用。

Abstract

Objective To investigate the role of the SREBP-1/SCD1 pathway in mediating the protective effect of Tongxie Yaofang (TXYF) against 5-hydroxytryptamine (5-HT)-induced injury in BRL 3A cells. Methods Fourteen SD rats were gavaged with TXYF for 7 consecutive days to prepare TXYF-medicated serum. BRL 3A cells in routine culture were examined for changes in cell viability using CCK-8 assay following treatment with different concentrations of 5-HT. In BRL 3A cells treated with 5-HT and different concentrations of the medicated serum, SOD, MDA, and ROS levels were measured, and mitochondrial membrane potential and cell morphology were evaluated using JC-1 staining and electron microscopy; autophagosomes and LC3B expression were detected with immunofluorescence staining, and the protein expression levels of Cyt-c, caspase-3, Gsk3β, Beclin-1, LC3 I/II, p62, SREBP-1, SCD1, and 5-HT_2AR were analyzed using Western blotting. Results The optimal 5-HT concentration for modeling was 1.5 mmol/L. In 5-HT-treated cells, treatment with TXYF-medicated serum significantly reduced cellular ROS and MDA levels, increased SOD activities, lowered mitochondrial membrane potential, and alleviated mitochondrial swelling. The cells treated with TXYF-medicated serum also showed decreased expression levels of LC3B, MDC, Beclin-1, LC3 II/LC3 I, Cyt-c, SCD1 and 5-HT_2AR and increased expressions of p62 and SREBP-1 without significant changes in caspase-3 and Gsk3β expressions. Conclusion TXYF-medicated serum alleviate oxidative stress and autophagy dysfunction via the SREBP-1/SCD1 pathway to protect BRL 3A cells against 5-HT-induced injury.

Graphical abstract

关键词

痛泻要方 / 5-羟色胺 / BRL 3A细胞 / 氧化应激 / 细胞自噬

Key words

Tongxie Yaofang / 5-hydroxytryptamine / BRL 3A cells / oxidative stress / autophagy

肝脏作为人体物质代谢的核心器官，易受内外源性因素（如酒精、高脂饮食、药物毒性、病原体感染等）影响，引发氧化应激损伤，是多种肝脏疾病（如非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎、肝纤维化乃至肝癌）发生发展的关键病理基础^［1］。尽管不同病因导致肝脏损伤的起始环节存在差异，但活性氧（ROS）过量生成与清除失衡引发的氧化应激，始终是贯穿肝脏损伤进程的核心事件^［2］。

过量的ROS会攻击线粒体自身的脂质、蛋白质等，进一步加剧线粒体功能障碍，形成“ROS-线粒体损伤”的恶性循环，最终导致细胞损伤甚至死亡^［3-5］。为限制氧化应激扩散，细胞可迅速启动线粒体自噬，选择性消除受损线粒体^［6］，然而，一旦氧化应激超过自噬清除能力，残存线粒体进一步泄漏ROS，反而加剧氧化损伤并触发细胞死亡^［7］。氧化应激和线粒体功能障碍是慢性肾病发生和发展的核心环节^［8］。Atox1通过铜依赖方式激活DJ-1，同步阻断氧化应激级联并启动线粒体自噬，从而维护海马神经元线粒体稳态并减轻TBI后的氧化损伤^［9］。固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）/硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）通路是调控肝脏脂质合成与代谢的核心通路^［10］。研究证实，靶向调控 SREBP-1/SCD1 通路可缓解肝脏氧化应激与脂质紊乱，为肝纤维化等治疗提供了潜在靶点^［11］。这些研究提示，靶向氧化应激-线粒体轴可能是干预多器官损伤的共通策略。

5-羟色胺（5-HT）是一种经典的神经递质，参与多种中枢与外周生理功能。肠道是外周5-HT最主要的合成和储存部位，肠道嗜铬细胞（ECCs）以色氨酸为前体，在色氨酸羟化酶 1（TPH1）催化下合成5-HT^［12］。此外，肾小管上皮细胞、胰岛β细胞、皮肤肥大细胞和角质形成细胞亦可少量合成5-HT，参与局部生理功能^［13-15］。ECCs合成的5-HT不储存于神经末梢，而是直接释放到肠道黏膜间隙或血液中。虽然肝脏本身合成5-HT与否仍存在争议^［16］，但肝细胞、肝星状细胞表面表达的5-HT受体，通过结合肠道或血小板来源的5-HT，在调控肝脏糖脂代谢、肝纤维化等生理功能与病理进程中发挥重要作用^{［17，18］}。研究表明，肝细胞本身可低水平表达TPH1，当受到CCl₄、高糖等刺激时，5-HT受体表达上调，进而驱动5-HT合成酶与降解酶同步升高，形成“5-HT降解系统”过度激活。大量5-HT在线粒体外膜降解，导致线粒体ROS爆发、氧化应激、MAPK/NF-κB等炎症信号活化，最终诱发脂质代谢紊乱、炎症及细胞凋亡^{［19， 20］}。

中医经典名方痛泻要方（白术、白芍、防风、陈皮）出自《丹溪心法》，具有健脾柔肝，祛湿止泻的功效。现代研究证实痛泻要方具有抗炎、抗氧化及调节胃肠功能等药理作用^［21］，其机制与抑制5-HT过度释放及受体信号传导，上调SERT表达，降低组织5-HT含量，改善肠道高敏感性密切相关^［22］，通过抑制5-HT的过度合成、表达与再摄取，改善肠道黏膜损伤^［23］。课题组前期在肝郁脾虚型溃疡性结肠炎研究中发现，痛泻要方降低5-HT含量的同时，还可以调控肝脏脂质代谢^［24］，初步提示其具有通过“肠-肝轴”干预肝病的作用。现有研究发现，5-HT能通过“肠-肝轴”调控肝脏脂质代谢，其核心机制与5-HT_2A受体激活促进脂肪生成、加重肝脂肪变性有关^{［25， 26］}。虽然5-HT诱导肝细胞氧化应激与脂质过氧化损伤的机制目前已有研究证实，但是痛泻要方在5-HT调控肝脏脂质代谢，尤其是在SREBP-1/SCD1通路中的调控作用尚不明确。

基于此，本研究以5-HT诱导的肝细胞BRL 3A损伤模型为研究对象，引入痛泻要方含药血清干预，重点探讨其通过SREBP-1/SCD1通路调控脂质代谢、缓解氧化应激损伤的作用机制，将痛泻要方的抗氧化作用拓展至肝脏领域，明确其对5-HT诱导肝细胞损伤的保护效应，构建“5-HT—SREBP-1/SCD1—氧化应激”的调控链条，揭示痛泻要方干预相关损伤的靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物

依据《太平惠民和剂局方》记载痛泻要方经典配伍（炒白术、炒芍药、炒陈皮、防风饮片按比例6∶4∶3∶2），饮片均为符合《中国药典》标准的合格产品。于医院规范化中药煎药室，去除杂质后放入中药熬制机中熬制，最终浓缩成15 mL汤药，此时汤药浓度为1 g/mL，放入4 ℃冰箱保存。

1.1.2 动物和细胞

14只雄性SPF级健康SD大鼠，12周龄，体质量（200±10）g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物合格证号SCXK（湘）2024-0011。本次动物实验获得贵州中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批号20250612001）。在12 h光照12 h黑暗，室温18~24 ℃，湿度50%~70%，自由饮水进食，适应性饲养7 d。大鼠BRL 3A细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司（货号：CL-0036）。

1.1.3 主要试剂

CCK8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（MCE）；超氧化物歧化酶（SOD）测试试剂盒（南京建成生物工程研究所），丙二醛（MDA）测试试剂盒（南京建成生物工程研究所）；细胞ROS检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（碧云天）；Ketanserin拮抗剂（MCE）；兔多抗GAPDH（杭州贤至生物有限公司）；兔多抗SCD1（Bioss）；兔多抗SREBP-1（Affinity）；兔多抗5-HT_2AR（Absin，货号：Abs138420）；兔多抗LC3（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：14600-1-ap）；鼠单抗p62（abcam，货号：ab56416）；兔单抗beclin1（Cst，货号：3495）；鼠单抗Caspase3（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：66470-2-ig）；兔多抗GSK3β（武汉三鹰生物技术有限公司，货号：22104-1-ap）；兔单抗Cyt-c（Abcam，货号：Ab133504）；HRP标记羊抗兔二抗、HRP标记羊抗小鼠二抗（武汉博士德生物工程有限公司，货号分别为：BA1054、BA1051）。

1.1.4 主要仪器

Multiskan MK3全自动酶标仪（Thermo）；CytoFLEX流式细胞仪（BECKMAN）；倒置显微镜（OLYMPUS）；DYCZ-24DN垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；透射电子显微镜（Servicebio）。

1.2 模型与分组

1.2.1 动物饲养及痛泻要方含药血清制备

14只SPF级雄性SD大鼠，每日灌胃1次，给药剂量按1 g生药/kg体质量计算，并根据大鼠每日实测体质量调整给药体积，连续给药7 d。末次给药后1 h，以20%乌拉坦腹腔注射麻醉，采用腹腔腹主动脉采血，放于10 mL预灭菌离心管，静置2 h以上，无菌分离血清，56 ℃水浴30 min灭活后，经滤膜过滤，放于-80 ℃冰箱保存备用，经前期预实验测定含药血清浓度为10%^［27］。分别取两段结肠标本放入2 mL离心管，一段放于-80 ℃冰箱保存备用，一段放入4%多聚甲醛固定液中固定。

1.2.2 细胞培养与分组处理

将BRL 3A细胞从液氮中取出，快速溶解后把细胞转移到含有5 mL培养基的离心管中，室温1000 r/min，离心5 min，弃上清，收集细胞；用含10%胎牛血清培养基，37 ℃、5%CO₂饱和湿度条件下培养细胞。细胞密度达到80%时，对细胞进行传代：弃去培养基，PBS洗1遍，加1 mL0.25%胰蛋白酶消化细胞，显微镜下观察，消化1-2 min；弃去胰酶，加入完全培养基，按1：3的比例传代培养。设置分组为control组（BRL 3A肝细胞）、model组（5-HT刺激损伤）、antagonist组（使用5-HT₂R拮抗剂Ketanserin）、TXYF组（使用痛泻要方含药血清）。

1.3 方法

1.3.1 CCK-8检测细胞活性

取处于对数生长期，生长状态良好的BRL 3A细胞，胰酶消化收集细胞，用培养基将细胞密度调整到1.5×10⁴ /mL，96孔板每孔加200 μL细胞悬液，同时设空白组，37 ℃、5%CO₂培养箱中培养过夜；待细胞贴壁后，换成含有不同浓度的5-HT培养基（0、0.2、0.5、1、1.5 mmol/L），每组3复孔；37 ℃、5%CO₂培养箱中分别培养48、72、96 h，加入CCK8溶液20 μL/孔；将培养板在培养箱内孵育2 h后，用酶标仪测定在吸光度A_450nm。细胞活力（%）=［（A_实验孔-A_空白孔）/（A_对照孔-A_空白孔）］×100%。

1.3.2 对细胞超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）进行生化检测

将制备好的细胞悬浮液取出，1000 r/min，离心10 min，弃上清液，细胞沉淀；用等渗缓冲液清洗1~2次，同样1000 r/min，离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀；加入0.3 mL的匀浆介质进行匀浆，并在水浴条件下超声波破碎，制备好的匀浆液不离心待测。按照说明书分别配制试剂，用酶标仪测定SOD吸光度A_{450 nm}，MDA吸光度A_{532 nm}。

1.3.3 细胞内ROS含量测定

ROS荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS分布及含量。用0.25%胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，1500 r/min，离心5 min，去上清，加PBS重悬；用PBS将细胞润洗2次，1500 r/min，离心5 min；按照DCFH-DA细胞ROS检测试剂盒操作说明进行，1500 r/min，离心5 min，去上清，加PBS重悬；流式细胞仪上机检测。

1.3.4 JC-1流式细胞术检测线粒体膜电位

采用JC-1荧光探针通过流式细胞术检测线粒体膜电位。JC-1在线粒体膜电位较高时于基质内聚集形成红色荧光聚合物，而在膜电位降低时则以绿色荧光单体形式存在于胞质中。细胞经处理后，用PBS将细胞润洗2次，1200 r/min，离心3 min。按照线粒体膜电位检测试剂盒操作说明，配制JC-1工作液，加入0.5 mL工作液混匀后37 ℃孵育20 min，结束后离心4 min，沉淀细胞，弃上清。用JC-1染色缓冲液洗涤2次，离心，弃上清。再用适量JC-1染色缓冲液重悬后，用流式细胞仪检测分析。

1.3.5 免疫荧光检测细胞自噬标志蛋白表达情况

LC3B和MDC可用于自噬体形成到溶酶体降解过程的定位及测定。将培养好的细胞分组，预温的PBS洗涤细胞2次，加入现配的MDC工作液，37 ℃避光孵育45 min，预温PBS洗3次后对细胞进行固定与透化，使用LC3B一抗（兔多抗LC3，1∶200）进行4 ℃过夜孵育，荧光二抗（Cy3标记山羊抗兔IgG，1∶500）室温避光1 h，加入DAPI染色液染色，在共聚焦显微镜下成像。

1.3.6 Western blotting法检测相关蛋白表达量

提取单层贴壁细胞总蛋白，进行BCA蛋白浓度测定，计算样品蛋白浓度。加样后先恒压80V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压120V至溴酚蓝到凝胶底部。5%脱脂奶粉封闭2 h，分别孵育一抗beclin1（1∶1000）、LC3（1∶2000）、p62（1∶2000）、SREBP-1（1∶1000）、SCD1（1∶1000）、5-HT_2AR（1∶1000）、Cyt-c （1∶5000）、Caspase3（1∶2000）、Gsk3b（1∶4000）、GAPDH（1∶1000）4 ℃过夜，TBST清洗3次，每次10 min；二抗 （1∶10 000）室温2 h，TBST清洗3次，每次10 min；ECL发光液显色，用BandScan分析胶片灰度值。

1.3.7 细胞电镜观察超微结构

细胞收集后，用2.5%戊二醛4℃固定过夜。经PBS清洗后，用1%锇酸后固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂包埋。制备超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双染色。于透射电子显微镜下观察细胞超微结构，拍照记录。

1.3.8 统计学分析

采用SPSS 26.0版进行统计分析，GraphPad 10.0版软件作图。多组均值比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的5-HT培养基对BRL 3A细胞存活率的影响

通过CCK-8检测发现，在培养48 h后，BRL 3A细胞的细胞存活率于5-HT浓度在0.5 mmol/L时达到峰值（P<0.05），随后开始呈现逐渐降低趋势，在1.5 mmol/L浓度时细胞存活率明显下降（P<0.01）。在培养72 h后，细胞存活率于1.5 mmol/L浓度时最低，培养96 h后，细胞活力在该浓度下反而升高。培养96 h时，细胞存活率在浓度为0.2 mmol/L时较对照组降低，随着5-HT的浓度而升高，但细胞活性均不如培养48 h。故在后续试验中均以1.5 mmol/L浓度5-HT培养BRL 3A细胞（图1）。

2.2 痛泻要方对BRL 3A细胞氧化应激水平和脂质过氧化损伤的影响

与control组相比，使用5-HT后model组细胞内ROS表达显著升高（P<0.0001）；antagonist组与TXYF组ROS表达下调，尤其TXYF组较为明显（P<0.0001）；用FITC荧光通道，检测细胞内ROS水平结果显示，model组的荧光强度较对照组高，使用拮抗剂和痛泻要方后荧光强度下调，以TXYF组最明显。与control组相比，model组MDA升高（P<0.001），SOD活力降低（P<0.0001），痛泻要方部分逆转了5-HT对SOD的作用（P<0.01，图2）。

2.3 痛泻要方对BRL 3A细胞线粒体功能的影响

如图3A-C所示，在5-HT刺激细胞后，促进细胞增殖，细胞内线粒体膜电位聚集增强，UR区域数值显著升高（P<0.0001），LR区域数值显著降低（P<0.0001）；当TXYF处理后，线粒体膜电位下降，JC-1不能聚集变为单体形态，UR降低（P<0.001），LR升高（P<0.001）。为进一步在超微结构水平验证上述改变，利用透射电子显微镜观察细胞的线粒体形态。control组细胞线粒体形态规则，嵴结构清晰、密集（黑色箭头所示），model组细胞线粒体表现出明显的肿胀、体积增大、基质变淡，并且嵴结构断裂、减少甚至完全消失（红色箭头所示）；在TXYF组中，线粒体肿胀程度明显减轻，大部分线粒体嵴结构得以保留，形态接近control组（蓝色箭头所示）（图3D）。

2.4 痛泻要方抑制BRL 3A细胞的自噬能力

与control组比较，model组BRL 3A细胞中LC3B和MDC的荧光强度明显增加，使用含药血清后荧光强度均降低（P<0.05，图4A~D）。通过WB进一步检测Beclin-1、LC3、p62蛋白。如图4E-I，model组Beclin-1含量相对control组显著升高（P<0.0001）；antagonist组与TXYF组蛋白量降低（P<0.001，P<0.05）。与control组相比，model组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高（P<0.001）；antagonist组与TXYF组能部分抑制LC3积累，但TXYF组差异没有统计学意义。model组p62显著降低（P<0.0001）；与model组相比，antagonist组与TXYF组蛋白表达量升高（P<0.001，P<0.01）。

2.5 痛泻要放对BRL 3A细胞线粒体途径凋亡的影响

与control组相比，model组Cyt-c蛋白水平的显著增加（P<0.0001）；与model组相比，TXYF组Cyt-c蛋白量降低（P<0.01，图5A）。如图5B、C所示，与control组相比，model组中Caspase-3（17 000）的蛋白水平显著升高（P<0.05），而Caspase-3（32 000）的全长蛋白水平在各组间差异无统计学意义。与control组相比，model组GSK3β蛋白表达显著降低（P<0.05）；而TXYF组干预后，GSK3β虽有所降低，但差异没有统计学意义（P>0.05）。

2.6 痛泻要方对5-HT刺激肝细胞SREBP-1/SCD1通路相关蛋白的影响

与control组相比，model组的SREBP-1蛋白表达量显著降低（P<0.001），而使用拮抗剂与含药血清后蛋白表达量上升（P<0.01，P<0.05）。与control组相比，model组SCD1蛋白表达量显著上升（P<0.001），在使用了拮抗剂与含药血清后，蛋白表达量降低（P<0.05，P<0.01）。与control组相比，model组的5-HT_2AR蛋白含量显著上升（P<0.001），含药血清组的蛋白表达量显著降低（P<0.05，图6）。

3 讨论

正常生理状态下，肝脏通过抗氧化系统维持ROS的动态平衡^{［28， 29］}，当ROS产生速率远超清除能力时，过量ROS会攻击肝细胞内的脂质、蛋白质及线粒体等生物大分子，导致脂质过氧化产物（如MDA）蓄积、蛋白质氧化失活及DNA损伤，进而破坏肝细胞结构与功能完整性^{［30， 31］}。

本研究发现，1.5 mmol/L 5-HT处理可诱导BRL 3A细胞出现以“氧化应激-脂质代谢异常-自噬紊乱”病理表型。具体表现为ROS生成量增加、MDA 含量增加、SOD活力降低，提示脂质过氧化损伤加剧；JC-1检测及电镜超微结构观察显示，5-HT诱导会导致线粒体结构破坏与功能异常，表现为线粒体肿胀、嵴断裂甚至空泡化（图3）。受损的线粒体进一步触发自噬与凋亡通路：Beclin1蛋白表达上调、LC3II/LC3I比值升高及p62蛋白降低，提示自噬激活；同时Cyt-c释放增加，Caspase-3活性增强以及GSK3β蛋白表达显著降低，提示当线粒体受损严重且未被及时清除时，会释放凋亡因子。此外，SREBP-1水平降低及其下游SCD1蛋白表达升高，提示脂质合成通路过度激活。以上结果表明，5-HT可通过多重途径协同诱导肝细胞损伤。

在此模型基础上，本研究进一步观察了痛泻要方含药血清对上述损伤的保护作用。首先，痛泻要方可以显著降低5-HT诱导的ROS和MDA水平降低，并且提升SOD活性（P<0.001），这与痛泻要方中白术、白芍“健脾益气、抗氧化”的功效及现代药理学研究中“白术多糖抑制脂质过氧化、白芍总苷清除ROS”的结论相印证^{［32， 33］}，提示痛泻要方可能通过增强细胞自身抗氧化能力，减轻氧化损伤。其次，痛泻要方能够保护线粒体结构与功能完整性，显著抑制Cyt-c的释放，提示其具有良好的线粒体膜稳定作用。在自噬调控方面，痛泻要方可下调Beclin1表达，同时回调p62蛋白水平；LC3II/LC3I比值虽呈现下降趋势，但未表现出显著统计学差异，提示其对LC3形成过程的直接抑制作用可能较弱或存在其他调节路径。值得注意的是，TXYF组p62蛋白较model组显著上升（P<0.01），表明该药物可能通过促进p62积累、影响自噬体降解环节来调节自噬。这一结果提示，TXYF调控自噬的分子靶点可能不仅限于LC3转化环节，或许涉及更复杂的信号网络或LC3非依赖性通路。在凋亡相关指标上，尽管其对Caspase-3与GSK3β的影响未达到统计学显著性，但表达量的下降趋势仍提示痛泻要方可能在一定程度上干预凋亡下游过程。最后，痛泻要方能回调SREBP-1表达，并调节下游SCD1蛋白表达，提示SREBP-1/SCD1 通路可能是痛泻要方干预5-HT导致的肝细胞损伤的重要靶点之一。

既往研究表明，SCD1催化生成的单不饱和脂肪酸是细胞膜磷脂的重要成分，其含量异常会导致膜流动性增加、ROS敏感性升高^［34-36］。本研究中，痛泻要方下调SCD1后，MDA含量与ROS水平同步降低，证实其通过减少“易氧化脂质底物”，直接削弱脂质过氧化链反应。此外，有研究发现SREBP可通过下调溶酶体相关蛋白抑制自噬溶酶体形成^［37］。本研究发现，痛泻要方回调SREBP-1后，LC3II累积减少，提示其通过恢复溶酶体功能调节自噬，这为痛泻要方的多靶点作用提供了新解释。

基于上述结果，本研究提出痛泻要方含药血清干预5-HT诱导BRL 3A细胞损伤的核心机制，5-HT通过激活其受体，一方面诱发ROS并启动脂质过氧化，另一方面经SREBP-1/SCD1通路异常驱动脂质合成；后者与氧化应激相互作用，导致自噬紊乱，并产生MDA等产物放大氧化损伤。此外，痛泻要方含药血清可通过抑制SREBP-1核转位与SCD1表达，阻断该恶性循环，协同改善氧化应激与自噬，从而实现细胞保护。

现代研究已证实，痛泻要方可通过调节“肠-肝轴”改善肠道屏障功能^{［38， 39］}。本研究在此基础上进一步揭示，5-HT可能是介导“肠病及肝”病理过程的关键信号分子。研究结果显示，痛泻要方可能通过干预5-HT的损伤效应，调控肝细胞的SREBP-1/SCD1脂质代谢通路，从而发挥保肝作用。

从中医理论视角解读，上述分子机制与“脾虚生湿、湿浊困肝”的中医病理机制高度契合。具体而言，“脾虚失运”（相当于肠道功能紊乱）可导致水湿内停，郁而化热，本研究中5-HT诱导的氧化应激与脂质过氧化损伤，可视为“湿热/浊毒”的微观表现；“湿浊困遏肝络”（相当于肝细胞损伤），在本研究中表现为SREBP-1/SCD1通路介导的脂质代谢异常及线粒体功能障碍。痛泻要方以白术、白芍健脾祛湿为主，佐以陈皮理气、防风散肝，其复方效应在分子层面上正对应了“抑制异常5-HT信号、纠正脂代谢紊乱、恢复线粒体功能”的多靶点保护作用。这从现代药理层面为痛泻要方“扶土抑木”和“从脾治肝”的传统治则提供了新的实验依据^［40］。

需要指出的是，本研究结论仅基于BRL 3A细胞模型得出，虽能揭示细胞与分子事件，但无法完全模拟体内“肠-肝轴”的复杂调控网络及“脾虚”的整体病理状态。并且本研究未使用自噬抑制剂或激动剂进行功能性验证，以及缺少ROS清除剂对照组。后续研究有必要通过脾虚证动物模型，进一步验证痛泻要方通过调控肠源性5-HT对肝脏的体内保护效应。

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基金资助

2026年度贵州省中医药、民族医药科学技术研究专项课题项目(QZYY-2026-008)

国家自然科学基金(81760827)

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