清肾颗粒通过调控Akt3介导的M1型巨噬细胞极化改善单侧输尿管梗阻小鼠肾纤维化

Qingshen Granules alleviate renal fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction by regulating Akt3-mediated M1 macrophage polarization

摘要

目的 探究清肾颗粒抑制肾纤维化的作用机制，明确其是否通过调控 Akt3 介导的巨噬细胞极化发挥效应。 方法 体内构建单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠肾纤维化模型，分为假手术组、模型组、清肾颗粒治疗组［4.0 g·kg^-1·d^-1）］，6只/组，灌胃2周；通过 AAV9 介导肾脏Akt3 敲低，设置 Sham+NC、Sham+shAkt3、Model+NC、Model+shAkt3组；体外以TGF-β1 诱导 HK-2细胞纤维化，用清肾颗粒含药血清干预，同时构建HK-2细胞与THP-1来源巨噬细胞的共培养体系。采用 HE、Masson 染色观察肾脏病理变化；ELISA 检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）；Western blotting、RT-qPCR检测Akt3、α-SMA、E-cad、IL-6、TNF-α蛋白及 mRNA 表达；免疫组化、免疫荧光验证蛋白定位；流式细胞术检测巨噬细胞极化表型；CCK-8、EdU 实验评估细胞活力与增殖能力。 结果 体内实验表明，与假手术组相比，模型组小鼠肾功能显著受损，Scr、BUN水平升高（P<0.05），伴肾小管损伤、肾间质胶原纤维沉积，肾组织IL-6、TNF-α的mRNA及α-SMA蛋白表达上调， E-cad蛋白表达下调（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒治疗组上述指标均改善（P<0.05）。AAV9介导肾脏特异性Akt3敲低实验中，与Sham+NC组相比，Model+NC组小鼠肾纤维化加重，肾组织M1型巨噬细胞占比升高（P<0.05），M2型无显著变化（P>0.05）；与Model+NC组相比，Model+ shAkt3敲低组肾纤维化减轻，M1型巨噬细胞极化受抑制（P<0.05），M2型仍无明显差异（P>0.05）；清肾颗粒显著下调肾组织 Akt3 蛋白表达，降低 M1 型巨噬细胞比例（P<0.05）。体外实验中，与对照组相比，模型组细胞活力、增殖能力下降，Akt3、α-SMA蛋白上调，E-cad蛋白下调，清肾颗粒含药血清组可逆转上述变化（P<0.05）；流式细胞术检测显示，TGF-β1诱导的HK-2细胞可促进M0巨噬细胞向M1型极化，清肾颗粒含药血清干预后M1型极化被抑制（P<0.05）。 结论 清肾颗粒通过抑制Akt3介导的M1型巨噬细胞极化，发挥减轻UUO小鼠肾纤维化的作用。

Abstract

Objective To clarify whether Qingshen Granules (QSG) inhibits renal fibrosis by regulating Akt3-mediated macrophage polarization. Methods Adult C57BL/6 mice were randomized into Sham group, unilateral ureteral obstruction (UUO) model group, and UUO with QSG treatment group (n=6) for treatment with daily gavage of distilled water or QSG (4.0 g/kg) as indicated for 2 weeks. In AAV9 experiments, the mice received intrarenal injections of AAV9-shRNA(Akt3)-GFP for Akt3 knockdown or AAV9-shRNA-GFP (negative control) 2 weeks before sham operation or UUO modeling. After the treatments, the mice were examined for renal fibrosis, renal function, and macrophage polarization using HE staining, Masson staining, ELISA, Western blotting, RT-qPCR, immunohistochemistry, immunofluorescence staining, and flow cytometry. In the cell experiment, TGF‑β1-induced HK-2 cells were co-cultured with THP-1-derived macrophages, and the effects of QSG-medicated rat serum on cell viability, proliferation, and macrophage polarization were evaluated using CCK-8 and EdU assays, Western blotting and flow cytometry. Results Compared with the sham-operated mice, the UUO mice showed impaired renal function, renal tubular injury, collagen deposition, upregulated expressions of IL-6 and TNF-α mRNA and α-SMA protein, and downregulated E-cad protein expression, which were significantly improved by QSG treatment. In AAV9 experiments, the UUO mice with control virus injection showed obvious renal fibrosis and increased M1 macrophages, while AAV9-shRNA(Akt3)‑GFP injection significantly alleviated renal fibrosis and inhibited M1 macrophage polarization without affecting M2 macrophages. In the co-cultured cells, treatment with QSG-medicated serum significantly reversed TGF-β1-induced reduction of HK-2 cell viability and proliferation, upregulated Akt3 and α‑SMA expressions, downregulated E-cad expression, and inhibited M0-to-M1 polarization of THP-1 cells induced by TGF‑β1-treated HK-2 cells. Conclusion QSG alleviates renal fibrosis in UUO mice by inhibiting Akt3-mediated M1 macrophage polarization.

Graphical abstract

关键词

清肾颗粒 / Akt3 / 巨噬细胞极化 / 肾纤维化

Key words

Qingshen Granules / Akt3 / macrophage polarization / renal fibrosis

慢性肾脏病（CKD）是以肾脏结构或功能持续损伤为核心特征的进展性疾病^［1］，肾纤维化作为其进展的共同病理基础，以肾脏细胞外基质异常沉积、成纤维细胞过度活化为主要表现^{［2， 3］}，最终导致肾单位结构破坏与功能不可逆丧失，是CKD向终末期肾病进展的关键驱动因素^{［4， 5］}。流行病学数据显示，美国成人CKD患病率约14%^［6］，亚洲地区成人患者已达4.343亿，构成主要的疾病负担^［7］。尽管肾纤维化具体机制尚未完全阐明，但巨噬细胞的核心调控作用已得到广泛证实。巨噬细胞主要分为经典活化型（促炎型，M1型）与交替活化型（抗炎型，M2型）^［8］，作为关键免疫细胞，其M1/M2亚型极化失衡在CKD肾纤维化进程中发挥核心调控作用^［9］。M1型巨噬细胞可被受损肾脏微环境中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子诱导极化，通过释放炎症介质加剧局部炎症，驱动纤维化进程^［10］；M2型巨噬细胞则在肾损伤晚期富集，通过分泌白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）等因子参与炎症消退与组织修复^{［11， 12］}。Akt3作为PI3K/Akt通路的重要亚型^{［13， 14］}，近年研究证实其参与炎症反应及纤维化疾病调控^{［15， 16］}，但关于其是否通过调控巨噬细胞极化参与肾纤维化进程，目前仍需深入探讨。

清肾颗粒是安徽中医药大学第一附属医院的临床常用制剂，具有清热利湿、活血化瘀、健脾益肾之功效，已在CKD临床治疗中取得确切疗效^［17-19］。前期实验研究证实，该复方可改善CKD模型动物的肾功能、减轻肾纤维化并发挥抗炎作用^［20-22］。但是其否通过调控Akt3介导的巨噬细胞极化发挥作用，仍有待深入探究。本研究通过构建体内外实验模型，系统探究清肾颗粒是否通过调控Akt3介导的巨噬细胞极化发挥抗肾纤维化效应，以期为该复方的临床应用提供实验依据，同时为肾纤维化的靶向治疗提供新思路与实验支撑。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

1.1.1 实验动物

8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠，体质量20~25 g［江苏集萃药康生物科技股份有限公司，生产许可证：SCXK（苏）2023-0009］；8周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量180~220 g［河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，生产许可证：SCXK（苏）2020-0005］。动物实验方案经安徽中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批号：AZYFY-2025-3003）。

1.1.2 实验细胞

人肾近曲小管上皮细胞系（HK-2）、人单核细胞系（THP-1）（上海赛百慷生物技术股份有限公司）。

1.1.3 实验药物

清肾颗粒，10 g/包（安徽中医药大学第一附属医院制剂室，皖药制字：BZ20080011，批号：20210215）由茵陈、丹参、大黄、白花蛇舌草、白术、猪苓、茯苓、白蔻仁、扁豆、薏苡仁、泽泻、黄连、益母草、车前草组成。

1.1.4 主要试剂

Masson三色染色液（Solarbio）；苏木素染液、醇溶伊红染液（Baso）；山羊抗兔 IgG、山羊抗小鼠IgG、β-actin（Zs-BIO）；Akt3（Proteintech）；α-SMA、E-cadherin（Affinity）；CD80、CD86（Biolegend）；F4/80、CD14（联科生物）；CD206（Elabscience）。

1.1.5 主要仪器

生物组织脱水机、生物组织包埋机、生物组织摊烤片机（湖北亚光）；病理切片仪（Leica）；荧光定量PCR仪（ABI）；显微镜（OLYMPUS）；离心机（安徽嘉文）；流式细胞仪（安捷伦）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模

8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠饲养于标准环境中，适应性饲养1周。用随机数字表法将小鼠随机分为3组，6只/组：假手术组（Sham组）、模型组（Model组）、清肾颗粒治疗组（QSG组）。参照既往文献报道的单侧输尿管梗阻（UUO）造模方法^［23］，小鼠置于37 ℃恒温加热垫上，腹腔注射1.25%三溴乙醇溶液（20 mL/kg）行全身麻醉。于左侧腹部纵行切口约1 cm，逐层分离暴露左肾及输尿管，采用4-0可吸收缝线结扎并离断输尿管，随后逐层缝合腹壁。假手术组小鼠接受相同手术流程，但仅分离输尿管而不进行结扎处理。术后，清肾颗粒组小鼠给予清肾颗粒灌胃干预，剂量为4 g/（kg·d），1次/d；假手术组与模型组均给予常规动物饲料喂养及蒸馏水灌胃。连续干预 2周后，采集小鼠外周血样本，随后处死小鼠并分离左侧肾脏组织。所有实验结束后，动物尸体集中密封装袋，送至安徽中医药大学科研实验中心，依据医疗废物处理相关规定统一规范处置。

1.2.2 腺相关病毒体内干预模型的制备

采用肾盂原位注射方式，将携带绿色荧光蛋白（GFP）标签的9型腺相关病毒（AAV9）导入小鼠体内，实现肾脏Akt3基因敲低，小鼠注射剂量为5×10¹¹ vg/只。AAV9编码小鼠Akt3由中国山东维真生物科技有限公司提供。其中，敲低干预采用AAV9-shRNA（Akt3）-GFP（携带靶向Akt3的shRNA，序列为GGTGTTGTCATGTATGAAA TGTTCAAGAGACATTTCATACATGACAACACCTTTTTT），阴性对照采用AAV9-shRNA-GFP（插入无义序列，序列为TTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAG AGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTT）。AAV注射2周后，将小鼠分为4组：假手术+阴性对照组（Sham+NC）、假手术+Akt3敲低组（Sham+shAkt3）、UUO模型+阴性对照组（Model+NC）、UUO模型+Akt3敲低组（Model+shAkt3），分别进行假手术处理或UUO肾纤维化模型构建。

1.2.3 含药血清制备

健康雄性SPF级SD大鼠20只，适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白对照组和清肾颗粒含药血清组，10 只/组。清肾颗粒含药血清组大鼠给予清肾颗粒灌胃干预，剂量为8 g/（kg·d），1次/d，连续给药10 d 后处死；经腹主动脉无菌采血，室温静置2 h 后，以3000 r/min 离心15 min，收集上清血清并将同组血清混合均匀，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，56 ℃水浴灭活 30 min，分装后于-80 ℃超低温冰箱保存备用。空白对照组大鼠给予等量生理盐水灌胃，其余处理均同清肾颗粒含药血清组，制备大鼠空白血清。

1.2.4 HE和Masson染色

取肾脏组织后，经多聚甲醛固定、石蜡包埋处理，制备3 μm厚切片，分别行HE染色及Masson染色。

1.2.5 Western blotting

将肾组织或细胞置于RIPA裂解缓冲液中，裂解后收集上清液并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。等量蛋白经SDS-PAGE分离后转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。膜与一抗（α-SMA 1∶500，E-cadherin 1∶500，Akt3 1∶500，β-actin 1∶1000）在4 ℃条件下孵育过夜，再用酶标二抗（1∶10 000）处理。使用ImageJ软件以目标蛋白与内参蛋白β-actin的灰度值比值做统计分析。

1.2.6 免疫组织化学

小鼠肾组织石蜡包埋切片按照制造商的操作规程，随后进行抗原修复和过氧化物酶去除处理。然后与特定一抗（α-SMA 1∶150，E-cadherin 1∶150）在 4 ℃孵育过夜。切片随后与二抗（1∶500）孵育，进行 DAB 染色，随后用苏木精复染。并使用前面描述的方法进行定量分析。

1.2.7 免疫荧光染色

小鼠肾组织经石蜡包埋切片后，依次经脱蜡、梯度水化处理后，采用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复处理。与特异性一抗（α-SMA 1∶200、E-cadherin1∶200）孵育过夜，次日加入100 μL二抗 （1∶500）孵育。随后滴加 100 μL DAPI 染色液，室温避光孵育以染核。最后置于荧光显微镜下采集荧光图像，通过 ImageJ 软件定量分析目标蛋白的荧光强度，用于统计学分析。

1.2.8 分子对接与计算

使用 AutoDock Vina 1.2.2 进行分子对接。在对接过程中，配体在设定的网格区域内进行多次旋转和位移，Vina通过模拟不同的结合模式来优化配体与蛋白质的结合能。对接计算包括设置最大旋转次数和最大对接次数，以确保全面搜索可能的结合构象。在对接过程中，设置了 AutoDock Vina 的参数：最大搜索次数：50，最大旋转次数：10。AutoDock Vina 输出多个配体与靶标蛋白的结合构象及其对应的结合能。为了筛选最可能的结合模式，选择具有最低结合能的构象。

1.2.9 细胞活力测定

各组细胞正常消化后用培养基重悬至密度1×10⁵，混匀后接种100 μL/孔至培养板，于5% CO₂、37℃培养箱中过夜培养。待细胞贴壁后进行分组处理：正常组更换完全培养基继续培养48 h；模型组加入终浓度10 ng/mL的TGF-β1培养48 h；含药血清组加入终浓度10 ng/mL的TGF-β1与20%含药血清的混合培养基，共同培养48 h。培养结束后，加入10 μL/孔 CCK-8试剂，继续孵育1 h，随后在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光值A_{450 nm}，同时设置仅含培养基与CCK-8的空白孔用于背景校正。

1.2.10 EdU增殖试验

将处理后的不同组别的细胞按说明书加入10 μmol/L EdU 染料，孵育2 h。采用DAPI工作液对 DNA 进行染色，染色后细胞核呈现蓝色荧光，而标记EdU的增殖细胞则发出鲜艳的绿色荧光。通过计算每个视野中EdU阳性细胞数与总细胞数的比值，确定EdU标记细胞的相对数量。

1.2.11 细胞培养与处理

HK-2 细胞培养于含 10% 胎牛血清及1%青霉素和链霉素的的 DMEM 培养基中，培养条件为37 ℃、5% CO₂。细胞接种于六孔板，过夜贴壁后将HK-2细胞分3组进行干预：空白对照组（Control 组），加入含20%空白血清的完全培养基换液培养 48 h；模型组（TGF-β1组），加入含10 ng/mL TGF-β1+20%空白血清的完全培养基培养48 h；清肾颗粒含药血清干预组（QSG组），加入含10 ng/mL TGF-β1+20%清肾颗粒含药血清的完全培养基培养48 h。Transwell共培养：将THP-1细胞和HK-2细胞分别在含有10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的RPMI 1640/DMEM培养基中培养。使用100 ng/mL的佛波酯（PMA）持续处理 THP-1细胞72 h，诱导其分化为 M0 型巨噬细胞。同时，将3组处理好的 HK-2 细胞接种于 Transwell 小室，随后将小室置于已诱导形成 M0 型巨噬细胞的 6 孔板中，进行48 h间接共培养。共培养结束后，分别收集上室的 HK-2 细胞及下室的巨噬细胞，用于后续实验检测。

1.2.12 反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）

检测肾组织中IL-6、TNF-α、α-SMA、E-cad的mRNA表达水平 用Trizol提取总RNA，用逆转录试剂盒反转录为cDNA。cDNA用使用 SYBR 绿色 qPCR 试剂盒进行RT-qPCR。将相对基因表达归一化为β-actin，用2^-ΔΔCt方法进行分析。引物由上海生物工程公司合成，引物序列见表1。

1.2.13 流式细胞术

组织样本取50 mg新鲜组织加0.5 mL PBS研磨，1000 r/min离心5 min后取100 μL上清；贴壁细胞先经胰酶消化，计数收集0.5~1×10⁶细胞，PBS洗涤后用100 μL PBS重悬。加入对应表面抗体（组织加CD80、F4/80，细胞加CD86、CD14），室温避光孵育30 min，加1mL含5%FBS的PBS离心弃上清。用含5%FBS的PBS重悬后加固定液室温固定1 h，加破膜液离心弃上清，重悬沉淀加入CD206抗体，室温避光孵育30min，再次离心洗涤。最后用PBS重悬细胞，经200目滤网过滤后上机检测，以NovoExpress软件分析，通过四象限1、4区域分别判定M1、M2型巨噬细胞比例。

1.2.14 统计学分析

采用GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析，以Tukey检验进行组间两两比较。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 清肾颗粒改善UUO小鼠肾功能，减轻肾纤维化与炎症反应

HE染色显示，与假手术组相比，模型组小鼠肾脏出现显著肾损伤，主要表现为肾小管扩张、上皮细胞空泡变性、肾小管萎缩与坏死及炎症细胞浸润等病理改变。Masson 染色结果显示，其肾间质及肾小管周围胶原纤维沉积显著增多。与模型组相比，经清肾颗粒治疗后，小鼠的肾小管损伤程度及肾间质纤维化水平均显著减轻（P<0.05，图1A、B）。同时，清肾颗粒降低了模型组小鼠体内升高的血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平（P<0.05，图1C、D）。RT-qPCR检测结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠肾脏中炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA水平升高（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组小鼠肾脏IL-6和TNF-α-的mRNA水平均降低（P<0.05，图1E、F）。

2.2 清肾颗粒对UUO小鼠肾组织中α-SMA、E-cad表达的影响

Western blotting 检测结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠肾组织中纤维化标志物α-SMA蛋白表达升高，而上皮表型标志物E-cad蛋白表达下调（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组α-SMA蛋白表达下降，E-cad 蛋白表达回升（P<0.05，图2A~C）。RT-qPCR检测在 mRNA水平进一步验证了这一调控趋势（图2D、E）。免疫组化结果显示，模型组小鼠肾脏中 α-SMA 的阳性表达面积增加，E-cad 的阳性表达面积减少（P<0.05）；与模型组相比，清肾颗粒组 α-SMA 的阳性表达面积减少，E-cad 的阳性表达面积增加（P<0.05，图2F~H）。

2.3 敲低Akt3表达，减轻肾纤维化

Western blotting检测结果显示，与 Sham+NC 组相比，Model+NC 组小鼠肾组织中 Akt3 蛋白表达水平升高（P<0.05）；同时，该组小鼠肾组织中纤维化标志物α-SMA蛋白表达上调，而上皮表型标志物 E-cad蛋白表达下调（P<0.05）。与Model+NC组相比，Model+shAkt3 组小鼠肾组织中 Akt3 蛋白表达水平下调（P<0.05，图3A、B），且α-SMA蛋白表达降低，E-cad 蛋白表达升高（P<0.05，图3C~E）。进一步通过免疫荧光染色检测发现（图3F~H），与Sham+NC 组相比，Model+NC组肾间质α-SMA阳性表达面积增加，肾小管E-cad阳性表达面积减少（P<0.05）；而相较于 Model+NC 组，Model+shAkt3组肾间质 α-SMA 阳性表达面积减少，肾小管E-cad阳性表达面积增加（P<0.05）。

2.4 敲低Akt3表达，抑制M1巨噬细胞极化

流式细胞术检测结果表明（图 4A），与 Sham+NC 组相比，Model+NC 组小鼠肾组织中 M1 型巨噬细胞占比升高（P<0.05），而 M2 型巨噬细胞占比差异无统计学意义（P>0.05）。相较于Model+NC组，Model+shAkt3 组小鼠肾组织M1型巨噬细胞占比降低（P<0.05，图4B），两组间M2型巨噬细胞占比差异无统计学意义（P>0.05，图4C）。

2.5 清肾颗粒主要入血成分与Akt3的分子对接验证

分子对接结合能热图（图5A）显示，清肾颗粒中与Akt3结合能低于-5.0 kcal/mol的活性成分里，结合亲和力最优的5种核心成分为黄芩苷、染料木素4'-O-葡萄糖醛酸苷、黄连素、茜黄素、芹菜素。分子对接结构模拟结果（图5B~F）表明，上述成分与Akt3的结合能均低于-7.8 kcal/mol，呈现较强的理论结合亲和力，其中黄芩苷结合潜能最为显著，结合能低至-9.332 kcal/mol。

2.6 清肾颗粒抑制Akt3介导的M1巨噬细胞极化，减轻肾纤维化

Western blotting 检测结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠肾组织中Akt3蛋白表达水平升高（P<0.05）；而经清肾颗粒干预后，小鼠肾组织中 Akt3 的蛋白表达水平下调（P<0.05，图6A、B）。此外，流式细胞术检测结果表明（图6C），与假手术组相比，模型组小鼠肾组织中 M1型巨噬细胞占比增加（P<0.05），M2 型巨噬细胞占比差异无统计学意义（P>0.05）；相较于模型组，清肾颗粒干预组小鼠肾组织中 M1 型巨噬细胞占比降低（P<0.05，图6D），M2型巨噬细胞占比差异无统计学意义（P>0.05，图6E）。

2.7 清肾颗粒含药血清下调Akt3表达，抑制 TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化

CCK-8 法检测细胞活力结果显示（图7A），与正常组相比，模型组细胞活力显著降低（P<0.05）；相较于模型组，清肾颗粒含药血清组细胞活力显著升高（P<0.05）。EdU 细胞增殖实验结果表明，与正常组相比，模型组 EdU 阳性细胞比例显著下降（P<0.05）；而清肾颗粒含药血清干预后，EdU 阳性细胞比例显著回升（P<0.05，图7B、C）。

Western blotting结果显示，与正常组相比，TGF-β1 诱导的模型组细胞中 Akt3 和 α-SMA 蛋白表达上调，E-cad 蛋白表达降低（P<0.05）；相较于模型组，清肾颗粒含药血清干预组细胞中 Akt3 和 α-SMA 蛋白表达下调，E-cad 蛋白表达升高（P<0.05，图7D~G）。

2.8 清肾颗粒含药血清抑制M1巨噬细胞极化

流式细胞术检测显示（图8A），与Control+M0组相比，TGF-β1+M0组的M1型巨噬细胞比例升高（P<0.05），相较于TGF-β1+M0组，QSG含药血清+M0组的M1型巨噬细胞比例下降（P<0.05，图8B），M2型巨噬细胞比例在各组间差异无统计学意义（P>0.05，图8C）。

3 讨论

本研究通过体内外实验，及AAV9介导Akt3敲低模型，系统探讨了清肾颗粒改善肾纤维化的作用及机制，核心证实其可通过下调Akt3表达、抑制M1型巨噬细胞极化，减轻肾脏炎症与纤维化进程，为其临床应用于CKD治疗提供了实验支撑。

本研究充分证实了清肾颗粒对UUO模型小鼠的肾脏保护作用。UUO模型组小鼠肾脏表现出显著的肾小管扩张、上皮细胞变性坏死及肾间质胶原纤维异常沉积，同时Scr、BUN水平显著升高，提示肾功能衰竭与纤维化进展；而清肾颗粒干预后，小鼠肾脏的上述病理形态学损伤得到显著改善，促炎因子IL-6、TNF-α的mRNA表达水平显著下调，纤维化标志物α-SMA表达降低，上皮表型标志物E-cad表达显著回升。该结果与清肾颗粒“清热化湿祛瘀”的中医功效高度契合，其组方中丹参、大黄等药材的协同作用，与既往关于丹参-大黄药对延缓UUO大鼠肾纤维化的研究结论相符^［24］，进一步为清肾颗粒的临床应用提供了实验依据。

Akt3是丝氨酸/苏氨酸激酶家族的重要成员，参与调控细胞生长、分化、增殖及凋亡等多种生理病理进程^［25］。临床研究显示，Akt3在头颈部鳞状细胞癌相关成纤维细胞中的表达水平与肿瘤相关巨噬细胞浸润量呈正相关^［26］，同时可调控巨噬细胞内胆固醇酯代谢、抑制泡沫细胞形成，参与动脉粥样硬化早期进程^［27］。但目前Akt3相关研究多集中于肿瘤发生发展、神经损伤修复等领域^［28-30］，其在巨噬细胞极化调控及肾纤维化病理进程中的具体作用与分子机制仍不明确。PI3K/Akt通路是调控巨噬细胞极化与肾脏炎症反应的经典通路^{［31， 32］}，该通路可通过下游NF-κB、CXCL3、mTOR等分子介导M1型巨噬细胞极化，推动IL-6、TNF-α等促炎因子的转录与释放^{［33， 34］}。Akt3作为该通路的关键功能亚型，结合本研究中Akt3敲低可抑制M1型巨噬细胞极化、降低肾组织促炎因子水平的结果，提示Akt3可能通过PI3K/Akt通路下游NF-κB/CXCL3/mTOR轴，参与肾纤维化进程中M1型巨噬细胞极化的调控。上述调控关系的具体分子机制与信号传递次序，仍需借助通路特异性抑制剂、基因回补等实验予以验证。

本研究通过AAV9介导的肾脏Akt3敲低实验证实，Akt3高表达是肾纤维化进程的重要驱动因素，靶向敲低Akt3可显著减轻肾间质纤维化程度。同时，体内外实验结果一致表明，模型组小鼠肾组织及体外培养体系中M1型巨噬细胞占比显著升高，而Akt3敲低或清肾颗粒干预后，M1型巨噬细胞极化被显著抑制，M2型巨噬细胞极化则无明显改变。本研究首次揭示Akt3是肾纤维化进程中的关键调控靶点，并阐明清肾颗粒通过抑制Akt3介导的M1型巨噬细胞极化，发挥减轻UUO小鼠肾纤维化的核心作用机制。

值得注意的是，本研究体外Transwell共培养实验采用先干预HK-2细胞，再与M0巨噬细胞共培养的设计，清肾颗粒含药血清对M1型极化的抑制作用可能存在双重调控途径。其一为间接调控途径，即清肾颗粒含药血清首先通过下调HK-2细胞中Akt3的表达，减轻TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞损伤与上皮-间质转分化，减少其分泌IL-6、TNF-α等促炎旁分泌因子，从而改善肾脏微环境，阻断炎症反应对巨噬细胞的极化诱导；其二为直接调控途径，即清肾颗粒中的活性成分可能直接作用于M0巨噬细胞，下调其Akt3表达，抑制其向M1型极化。本研究分子对接结果已证实清肾颗粒多种核心入血成分与Akt3具有较强的结合亲和力，为直接调控途径提供了化学生物学依据。

综上所述，本研究证实清肾颗粒改善肾纤维化的效应，与下调Akt3表达、抑制M1型巨噬细胞极化密切相关。这一发现不仅为清肾颗粒的临床应用提供了全新的分子机制解释，也为肾纤维化的靶向治疗构建了“中药复方-分子靶点-细胞表型”的研究范式，为中医药干预CKD的机制研究与转化应用提供了重要参考。

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基金资助

国家自然科学基金(82274307)

安徽省自然科学基金项目(2308085MH292)

安徽省自然科学基金项目(202407290785)

安徽省卫生健康科研项目(AHWJ2024BAc20084)

安徽省卫生健康科研项目(AHWJ2024Aa30409)

安徽中医药大学临床科研项目(2024YFYLCZX28)

合肥市科技局生命健康专项(GJ2022SM03)

2023年度合肥综合性国家科学中心大健康研究院新安医学与中医药现代化研究所科研项目(2023CXMMTCM018)

国家中医优势专科(国中医药医政函[2024]90号)

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