靶向抑制miR-503可通过上调Apelin表达减轻小鼠心肌梗死损伤

Targeted inhibition of miR-503 upregulates Apelin expression to alleviate myocardial infarction in mice

摘要

目的 探讨抑制miR-503对心肌梗死（MI）的调控作用及分子机制，明确其上游调控因子与下游效应通路，为MI治疗提供潜在靶点。 方法 通过冠状动脉结扎构建小鼠MI模型（分为假手术组、MI组、Antagomir-503组和NC组，5只/组）和原代新生大鼠心肌细胞缺氧模型（分为Control组、Hypoxia组、AMO-503组和NC组）。采用Real-time PCR检测miR-503及长链非编码RNA AK134630的表达变化；通过超声心动图评估小鼠心功能、TTC染色测定梗死面积；利用MTT法、LDH释放检测、TUNEL染色、JC-1染色及透射电镜，分别检测细胞活力、损伤、凋亡、线粒体膜电位及超微结构；采用Western blotting检测凋亡相关蛋白及关键靶点的表达水平。 结果 miR-503在MI模型（P<0.01）和缺氧模型（P<0.01）中表达均显著上调。体内抑制miR-503可改善小鼠心脏射血分数（P<0.01），并缩小梗死面积（P<0.01）；同时，该干预可下调Bax、cleaved caspase-3表达，上调Apelin的表达（P<0.01）。体外抑制miR-503（AMO-503）可提高缺氧心肌细胞活力（P<0.01）、降低凋亡率（P<0.01）、恢复线粒体膜电位（P<0.01）。机制上，AK134630结合并负向调控miR-503；抑制miR-503则能解除其对下游靶基因Apelin的抑制。 结论 抑制miR-503可通过上调Apelin表达，发挥抗心肌细胞凋亡及线粒体保护作用，从而减轻MI损伤；AK134630作为miR-503的上游ceRNA参与这一调控过程。

Abstract

Objective To investigate the effect of inhibiting miR-503 on myocardial infarction (MI) and clarify its upstream regulatory factors and downstream effector pathways to identify potential therapeutic targets for MI. Methods Mouse models of MI established by ligation of the left anterior descending coronary artery were treated with intravenous injections of normal saline, antagomir-503 or antagomiR-NC (n=5). Cardiac function and infarct size of the mice were evaluated by echocardiography and TTC staining, respectively. Primary neonatal rat cardiomyocytes with hypoxic exposure were treated with AMO-503 or its negative control, and the changes in miR-503 expression was detected by qRT-PCR. Cell viability, injury, apoptosis, mitochondrial membrane potential, and ultrastructure were assessed using MTT assay, LDH release assay, TUNEL staining, JC-1 staining, and transmission electron microscopy, respectively. Western blotting was performed to detect the changes in apoptosis-related proteins and the key targets. Results MiR-503 expression was significantly upregulated in both MI mouse hearts and hypoxic cardiomyocytes. In MI mouse models, antagomir-503 significantly improved cardiac function, reduced infarct size, downregulated Bax and cleaved caspase-3 expressions, and upregulated Apelin expression. In hypoxic neonatal rat cardiomyocytes, treatment with AMO-503 significantly enhanced cell viability, decreased cell apoptosis rate, and restored mitochondrial membrane potential. Mechanistically, the long non-coding RNA AK134630 could bind to and negatively regulate miR-503, and inhibition of miR-503 effectively relieved the inhibitory effect of RNA AK134630 on the downstream target gene Apelin. Conclusion Inhibition of miR-503 alleviates MI injury in mice by upregulating Apelin expression to inhibit cardiomyocyte apoptosis and protect mitochondrial function, and AK134630 participates in this regulatory mechanism as an upstream ceRNA of miR-503.

Graphical abstract

关键词

miR-503 / 心肌梗死 / 凋亡 / 线粒体 / Apelin / 长链非编码RNA AK134630

Key words

miR-503 / myocardial infarction / apoptosis / mitochondria / Apelin / long non-coding RNA AK134630

心肌梗死（MI）是冠状动脉急性闭塞导致的致命性心脏疾病，核心病理特征为心肌细胞缺血缺氧性坏死^{［1， 2］}。尽管溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗（PCI）等再灌注技术已显著改善急性期预后，但MI仍面临严峻挑战，表现为死亡率居高不下，且慢性心力衰竭及心肌纤维化等远期并发症发生率高的^［1］。现有治疗手段难以有效逆转心肌细胞丢失及后续病理性修复，因此深入解析MI发生发展的分子调控网络，挖掘潜在治疗靶点具有重要科学价值与临床意义。

微小RNA（miRNAs）是一类长度19~23个核苷酸的短链非编码RNA，通过降解mRNA或抑制翻译发挥基因调控作用^{［3， 4］}。miR-503作为miR-16家族成员，已在心血管疾病和癌症中受到关注^［5］。既往研究显示，miR-503可能通过细胞外囊泡传递至心肌细胞，靶向线粒体相关基因（如转录辅助活化因子-1β、沉默信息调节因子2相关酶类3），影响能量代谢并促进凋亡^［6］；另有研究指出，miR-503可抑制血管内皮祖细胞增殖、迁移及血管生成^［7］，或通过靶向LRIG2调控胶质瘤血管生成^［8］。本课题组前期已明确Apelin是miR-503的直接靶点，且miR-503可通过抑制Apelin促进血管紧张素Ⅱ诱导的心脏纤维化^［9］。然而，既往研究存在明显不足：未明确miR-503在MI中的竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络，其表达上调的上游机制尚不清楚^［6-9］；miR-503与Apelin下游信号通路的功能性偶联，未在缺血损伤模型中验证，缺乏系统性的体内外实验支持^［9］；miR-503作为MI治疗靶点的可行性，尚未通过多维度功能验证（如线粒体保护、凋亡调控等）得到充分证实^{［6， 7］}。

基于芯片数据的前期生物信息学分析显示，MI小鼠中存在miRNA与lncRNA表达差异。本研究研究创新点体现在以下方面：首次鉴定LncRNA AK134630作为miR-503的内源性ceRNA，系统阐明其在心肌梗死进程中对miR-503的负向调控分子机制；依托体内外缺血模型，验证miR-503-Apelin通路的功能性偶联关系，明确Apelin是介导miR-503抑制效应的关键下游分子；从心功能、梗死面积、细胞凋亡、线粒体功能等多个维度开展检测，证实抑制miR-503 所发挥的心脏保护作用，为miR-503作为心肌梗死治疗靶点提供直接且充分的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物：SPF级雄性C57BL/6J小鼠，8~10周龄，体质量20~25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2021-0006。新生（1~3日龄）C57BL/6小鼠，用于原代心肌细胞分离。

主要试剂与抗体：三溴乙醇、戊巴比妥钠、MTT试剂（Sigma-Aldrich）；氯化三苯基四氮唑（TTC，北京索莱宝科技有限公司）；DMEM培养基、胎牛血清、0.125%胰蛋白酶-EDTA（Gibco）；miR-503反义寡核苷酸（antagomiR-503）及其阴性对照（antagomiR-NC）、AMO-503及其阴性对照（NC）（广州锐博生物）；TRIzol试剂（Invitrogen）；ReverTra Ace qPCR RT试剂盒（TOYOBO）；SYBR® Premix Ex Taq™ II（Takara Bio）；RIPA裂解缓冲液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、JC-1线粒体膜电位检测试剂盒（碧云天生物科技）；兔抗Bax、小鼠抗β-actin、HRP标记山羊抗兔/抗小鼠IgG二抗（Proteintech）；兔抗cleaved caspase-3（Abcam）；兔抗Apelin（Santa Cruz）；原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）； pmirGLO双荧光素酶报告基因载体及检测系统（Promega）。

主要仪器：小动物呼吸机（Kent Scientific）；Vevo2100高分辨率小动物超声成像系统（VisualSonics）；模块化缺氧培养箱（Billups-Rothenberg）；ProOx P110氧气控制器（BioSpherix）；ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems）；ChemiDoc XRS+化学发光成像系统（Bio-Rad）；酶标仪（Bio-Rad）；Nikon Eclipse 80i荧光显微镜（Nikon）；Hitachi 7650透射电子显微镜（Hitachi）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物与MI小鼠模型

本研究所有动物实验均经厦门医学院动物实验伦理委员会审查批准（批准号：20230424005）。采用左冠状动脉前降支（LAD）结扎法建立MI模型^{［10， 11］}。小鼠经腹腔注射三溴乙醇（0.2 g/kg）麻醉后，行气管插管连接小动物呼吸机。于左胸第四肋间开胸，切开心包暴露心脏，使用7-0丝线于左心耳下缘结扎LAD。心电图显示ST段太高标志MI小鼠模型成功。假手术组仅穿线不结扎。术后小鼠单独饲养于通风笼中恢复。为探究miR-503功能，将造模小鼠随机分为4组：假手术组、MI模型组、AntagomiR-503干预组（MI+AntagomiR-503）、阴性对照组（MI+AntagomiR-NC），5只/组。实验动物经尾静脉注射AntagomiR-503（miR-503体内特异性抑制剂）或NC，给药剂量为30 mg/kg，每只动物单次给药体积50 μL（溶剂为无菌生理盐水），给药频率为每4日1次，连续干预4次。于最后一次给药完成后48 h，采用LAD结扎法建立MI模型。

1.2.2 超声心动图与MI面积测定

于术后12 h，使用Vevo2100系统配备的10 MHz线阵探头，于小鼠左胸部位获取左心室长轴及短轴M型超声图像，测量并计算左心室射血分数（EF）与短轴缩短率（FS），评估心功能。超声检查后，过量戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，迅速取出心脏，PBS冲洗。心脏于-20 ℃短暂冷冻后，沿心脏长轴将左心室横切成6片厚度均匀（约2 mm）的组织切片，浸入1% TTC溶液（PBS配制），37 ℃避光孵育15 min。存活心肌染为砖红色，梗死区呈苍白色。拍照后，使用Image J软件分别计算每张切片中MI区域面积与左心室总面积，以梗死面积百分比量化心肌损伤程度。

1.2.3 原代心肌细胞分离、培养及缺氧模型建立

取新生1~3日龄C57BL/6小鼠心脏剪碎，加入0.125%胰蛋白酶-EDTA，4 ℃过夜；次日37 ℃水浴间歇振荡消化15-20 min，加入等体积含10% FBS的DMEM培养基终止消化；经200目细胞筛过滤后1000 r/min离心5 min收集细胞沉淀。完全培养基重悬细胞，调整密度1×10⁵~2×10⁵ /cm²，接种至胶原蛋白包被培养皿，37 ℃、5% CO₂培养1.5~2 h后，轻吸上清（含未贴壁心肌细胞）转移至新包被培养皿；继续培养24 h。建立体外缺氧损伤模型时，先用PBS洗涤细胞两次，更换为无血清DMEM培养基；将细胞置于模块化培养箱中培养12 h，箱内通有混合气体（1% O₂，5% CO₂，平衡N2），建立缺氧环境。常氧对照组置于正常条件（21% O₂，5% CO₂）培养。培养过程中使用氧气控制器持续监测并维持箱内氧浓度。实验设置4组：常氧对照组、缺氧组、AMO-503干预组、阴性对照组。AMO-503为miR-503体外特异性抑制剂。

1.2.4 细胞转染

按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书，将AMO-503或其阴性对照NC转染至原代心肌细胞。转染6 h后更换为新鲜完全培养基，继续培养至后续实验时间点。

1.2.5 实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）

使用TRIzol法分别提取心肌组织梗死边缘区（距梗死边界1-2 mm区域）或各组心肌细胞的总RNA。NanoDrop测定RNA浓度与纯度后，取1 μg总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA。以U6 snRNA为内参基因，使用SYBR Green法在ABI 7500系统上进行qRT-PCR反应。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。采用2^-ΔΔCt法计算miR-503的相对表达量。所有引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，经BLAST验证特异性。

U6：正向引物CGCTTCGGCAGCACATATACT，反向引物CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT； AK134630：正向引物 CGTATCGTTATCAACGTCT CC，反向引物 AGGTCAGTTAGCTACGTG；miR-503：正向引物 GCGTAGCAGCGGGAACAGT，反向引物 AGTGCGTGTCGTGGAGT。

1.2.6 蛋白质印迹分析

使用预冷的RIPA裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）提取组织或细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度后，取等量蛋白（40 μg）经12% SDS-PAGE电泳分离，并转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，膜与相应一抗（Bax，1∶500；cleaved caspase-3，1∶200；Apelin，1∶500；β-actin，1∶500）于4 ℃孵育过夜。TBST洗涤后，与HRP标记的二抗（1∶5000）室温孵育1 h。使用ECL化学发光底物显影，ChemiDoc XRS+系统成像，ImageJ软件对条带进行灰度值分析，目标蛋白表达量以β-actin为内参进行标准化。

1.2.7 细胞活力与凋亡检测

细胞活力采用MTT法检测。将细胞接种于96孔板，经相应处理后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续孵育4 h。弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min溶解甲瓒结晶，用酶标仪测定吸光度A_{570 nm}。细胞凋亡采用TUNEL法检测。细胞爬片经4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100透化后，按试剂盒说明加入TUNEL反应混合液，37 ℃避光孵育60 min。DAPI复染细胞核后，于荧光显微镜下观察。凋亡细胞（TUNEL阳性）呈绿色荧光，随机选取5个视野，计算TUNEL阳性细胞数与DAPI阳性细胞总数的比值，即为细胞凋亡率。

1.2.8 线粒体膜电位与超微结构检测

使用JC-1染色试剂盒评估线粒体膜电位。细胞与JC-1工作液于37 ℃共孵育20 min，PBS洗涤后，立即使用荧光酶标仪或荧光显微镜检测。健康细胞线粒体膜电位高，JC-1形成聚合物，发射红色荧光（Ex/Em=525/590 nm）；凋亡或损伤细胞线粒体膜电位下降，JC-1以单体形式存在，发射绿色荧光（Ex/Em=490/530 nm）。计算红/绿荧光强度比值可反映膜电位变化。线粒体超微结构通过透射电镜观察。心肌组织经2.5%戊二醛前固定、1%锇酸后固定、系列梯度乙醇脱水、Epon 812树脂包埋后，制备超薄切片（70 nm），醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，于80 kV加速电压下观察并拍照。

1.2.9 荧光素酶报告基因实验

为验证miR-503与长链非编码RNA AK134630的靶向关系，我们克隆了AK134630基因3'非翻译区（3'UTR）的野生型片段，该片段包含预测的miR-503结合位点；将该片段插入pmirGLO载体的多克隆位点下游，构建野生型报告质粒（AK134630-Wt）。通过定点突变技术改变结合位点种子区序列，构建突变型报告质粒（AK134630-Mut）。将报告质粒与AMO-503或对照NC共转染至细胞中，转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测系统测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参，计算并比较各组萤火虫荧光素酶的相对活性。

1.2.10 统计学分析

所有计量数据先通过Shapiro-Wilk检验验证正态分布，结合GraphPad Prism 9.0软件输出结果，采用Brown-Forsythe检验验证方差齐性。符合正态分布且方差齐性的数据以均数±标准差表示，统计图中采用均数±标准误展示组间差异。采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析：两组数据比较采用双尾Student's t检验；多组数据比较采用单因素方差分析，后续多重比较方法所有组别间两两比较采用 Tukey 检验。样本量计算依据：样本量通过G*Power 3.1软件估算，设定检验水准α=0.05，检验效能1-β=0.8，结合预实验结果设定效应量f=0.4，计算得出每组所需最低样本量：动物实验每组n≥5，细胞实验每组独立重复≥3次，每次重复包含≥3个技术复孔，确保统计检验效能足以检测组间潜在差异。所有实验均独立重复至少3次。

2 结果

2.1 miR-503在MI中表达上调

小鼠LAD结扎模型术后12 h，超声心动图显示MI组小鼠左心室射血分数（EF）与短轴缩短率（FS）均显著下降（P<0.01，图1A）。TTC染色证实MI组梗死面积较Sham组显著增加（P<0.01，图1B）。qRT-PCR检测显示MI小鼠心肌组织中miR-503的表达水平显著上调（P<0.01，图1C）。

体外缺氧模型中，MTT法显示，缺氧处理显著降低细胞活力（图1D）。同时，LDH释放量显著增加（图1E， P<0.01），TUNEL染色显示心肌细胞凋亡率显著升高（图1F）。同时miR-503表达显著上调（P<0.01，图1G）。

2.2 抑制miR-503在体内外均发挥心脏保护作用

体内实验中，antagomiR-503治疗显著减少MI小鼠的梗死面积（P<0.05，图2A、B），提高心功能参数EF与FS（P<0.05，图2C~E）。Western blotting分析表明，antagomiR-503干预下调了MI心肌组织中促凋亡蛋白Bax（1.54±0.17 vs 0.99±0.11，P<0.05）及cleaved caspase-3（P<0.05）的表达，同时上调了保护性因子Bcl-2的表达（P<0.05，图2F~I）。透射电镜观察显示，antagomiR-503组线粒体结构更为完整，嵴排列致密，肿胀空泡化减轻（图2J）。

体外实验中，AMO-503处理逆转缺氧导致的心肌细胞LDH释放增加（P<0.05，图3A），心肌细胞活力下降（P<0.01，图3B）。降低细胞凋亡率（P<0.01，图3C）。Western blotting显示，AMO-503抑制Bax的表达、增加Bcl2的表达（图3D、E），降低cleaved caspase-9与cleaved caspase-3蛋白水平（图3F、G）。JC-1染色显示，AMO-503有效维持线粒体膜电位（P<0.01；图3H）。透射电镜显示其减轻缺氧引起的线粒体肿胀和嵴结构破坏（图3I）。

2.3 Apelin是介导miR-503抑制作用的关键下游靶点

体内模型中，MI小鼠心肌组织Apelin蛋白表达显著下调，AK134630过表达干预后Apelin 表达显著恢复（图4A，P<0.05）；体外缺氧模型中，缺氧导致Apelin表达下降，AK134630过表达可逆转此效应（P<0.05，图4B）。AntagomiR-503治疗显著提升MI心肌组织Apelin蛋白水平（P<0.05，图4C），AMO-503处理拮抗缺氧引起的Apelin表达下调（P<0.05，图4D）。

2.4 AK134630可作为miR-503的上游调控因子

双荧光素酶报告基因实验显示，miR-503 mimic显著抑制包含AK134630野生型结合位点的报告载体荧光素酶活性，但对AK134630-Mut无影响（图5A、B）。Pull down技术富集AK134630相关复合物后，与NC组相比，AK134630组的相对富集水平显著升高（图5C）。MI小鼠心肌组织及缺氧心肌细胞中，AK134630的表达水平均显著下调（图5D、E）；而过表达AK134630后，miR-503表达水平也降低（P<0.05，图5F、G）。

在心肌细胞中进行了功能实验，过表达AK134630可有效降低细胞内源性miR-503的水平，并模拟出与抑制miR-503相似的表型，包括提高缺氧条件下的细胞活力、减少细胞凋亡以及恢复受损的线粒体膜电位（图6）。当共转染miR-503模拟物以回补其功能时，AK134630过表达所诱导的上述保护效应被逆转（P<0.05）。

3 讨论

本研究通过体内外实验证实：miR-503在心肌缺血/缺氧损伤模型中的表达水平显著上调，是介导心肌损伤的关键促损伤因子。AK134630作为miR-503的内源性ceRNA，可通过直接结合负向调控miR-503表达；抑制miR-503可解除其对下游靶基因Apelin的抑制，通过上调Apelin表达发挥抗心肌细胞凋亡及线粒体保护作用，最终改善心功能、缩小梗死面积，减轻MI损伤（图7）。

3.1 抑制miR-503产生明确的抗凋亡与线粒体保护表型

本研究的核心发现之一是抑制miR-503能够发挥心肌保护作用。在体实验中，miR-503的靶向抑制不仅改善了心脏整体功能与组织结构完整性，更关键的是在细胞层面直接逆转了缺血缺氧诱导的凋亡级联反应。抑制miR-503可显著下调Bax、cleaved caspase-3/9等关键促凋亡蛋白的表达水平，同时有效维持线粒体膜电位稳定性，并修复缺血缺氧所致的线粒体超微结构损伤。线粒体作为细胞能量代谢与凋亡调控的核心枢纽，其功能完整性是心肌细胞在缺血应激下存活的先决条件，这些结果明确揭示了miR-503与缺血性损伤中线粒体功能紊乱的直接调控关联。

Sun等^［6］已证实外源性miR-503可破坏线粒体代谢稳态，而本研究则从治疗干预视角进一步拓展了这一认知：通过阻断内源性miR-503的病理性作用，足以挽救线粒体功能损伤并抑制心肌细胞凋亡，这一发现凸显了miR-503作为心肌缺血/氧损伤干预节点的关键价值。值得注意的是，miR-503的功能具有细胞特异性：其在心肌细胞中主要介导凋亡促进效应，而在血管内皮细胞中则可抑制血管生成^［7］。这一功能异质性提示，靶向miR-503的治疗策略需依托心肌细胞特异性递送系统（如心肌靶向脂质纳米颗粒），以在发挥心脏保护作用的同时，避免对缺血区域血管修复过程产生不利影响。

在MI领域，miR-1、miR-133等明星miRNA已得到广泛深入的研究：miR-1被证实通过靶向细胞周期调控基因，抑制心肌细胞增殖并促进凋亡^［12-14］；而miR-133则主要通过调控凋亡通路及纤维化相关因子，发挥心脏保护作用^［15-18］。与这些已明确功能的miRNA相比，miR-503的相关研究相对匮乏，且其作用机制具有显著独特性。本研究首次通过系统的体内外实验证实，miR-503在MI病理进程中的核心致病作用，主要通过调控线粒体功能紊乱及特异性保护肽Apelin的表达抑制来介导。这一发现提示，在MI复杂的miRNA调控网络中，不同miRNA可能通过靶向细胞死亡、纤维化、能量代谢等不同病理环节，协同驱动疾病进展^{［19， 20］}；而针对miR-503的靶向干预，为MI治疗提供了全新的、具有更高特异性的潜在策略，也为完善MI的miRNA调控机制网络提供了关键实验依据。

3.2 Apelin是介导miR-503抑制效应的关键下游信号分子

本研究的另一核心创新点在于，为靶向抑制miR-503所产生的心脏保护效应，明确了一个关键的下游介导通路-Apelin/APJ信号轴，从而建立了“miR-503抑制Apelin上调发挥心脏保护作用”的直接功能关联。我们在MI及缺氧模型中均观察到，Apelin的表达显著降低，而通过Antagomir-503或AMO-503靶向抑制miR-503后，Apelin的表达下调得以有效逆转并恢复至接近正常水平。这一表型结果与本团队前期机制研究结论高度契合：前期通过双荧光素酶报告基因实验已证实，miR-503能够直接结合于Apelin mRNA的3'UTR区域并抑制其翻译^［9］。因此，本研究中观察到的“抑制miR-503促进Apelin表达回升，进而实现心脏保护”这一系列表型，实质上是在病理背景下对该靶向调控关系的功能性验证，清晰地勾勒出miR-503通过负向调控Apelin来影响心肌细胞命运的下游作用轴线。

更重要的是，这一新发现的调控轴线与心肌细胞内经典的生存防御网络密切相连。Apelin是这调控网络的关键节点。其表达恢复后，可激活自身受体APJ；进而启动下游核心细胞存活信号通路，如PI3K/Akt^［21-23］和ERK1/2 MAPK^{［24， 25］}通路。这些通路在抑制细胞凋亡、维持线粒体功能稳态中发挥着至关重要的作用。因此，本研究首次鉴定AK134630为miR-503的内源性ceRNA，证实其通过调控Apelin下游PI3K/Akt通路发挥作用；这一机制与Zhou等^［9］报道的纤维化调控形成差异化，凸显了该通路的临床转化潜力。

3.3 对miR-503上游调控机制的初步探索

除了下游机制，本研究也对miR-503在损伤中为何上调进行了初步探索。本研究首次鉴定AK134630为miR-503的潜在调控分子，通过RNA pull-down实验证实两者存在直接的物理节合，且在体内外缺血/缺氧模型中，AK134630与miR-503的表达水平呈显著负相关。

ceRNA机制已成为基因表达调控研究的热点^［26-30］。这一调控模式在心血管疾病中已得到诸多验证，例如在心肌肥厚病理进程中，lncRNA H19被证实可通过吸附miR-675，解除其对下游靶基因的抑制，进而参与心肌肥厚的发生发展^［31-33］。本研究功能实验表明，过表达AK134630可模拟抑制miR-503的保护作用，且该作用可被miR-503模拟物所逆转。这些结果提示，AK134630可能作为ceRNA参与对miR-503的负调控。值得指出的是，本研究主要聚焦于阐明miR-503本身的功能与下游通路，AK134630的发现为理解miR-503的表达调控提供了新线索，但其在心肌缺血中的具体生物学功能及自身调控网络，将是未来一个重要的研究方向。

3.4 局限性与展望

本研究的结论主要基于临床前动物及细胞模型；其向临床转化的潜力仍需在大型动物等更接近人体的模型中，结合人体样本进一步验证。本研究为短期干预（术后12 h评估），未观察6个月以上的长期心功能及纤维化程度，未来需开展长期随访实验。此外，miR-503可能还存在其他下游靶点共同协调其功能；AK134630作为ceRNA的体内功能及其调控机制也有待深入探索。未来的研究可着眼于：在大型动物MI模型中验证靶向miR-503的治疗效果；利用多组学技术全面绘制miR-503/Apelin轴的下游效应网络；探索基于该通路的联合治疗策略（如miR-503抑制剂与Apelin类似物的联用）。

综上所述，本研究不仅确立了miR-503作为心肌缺血损伤关键促进因子的角色，更重要的是，通过将其与明确的保护性信号通路相偶联，为靶向抑制miR-503的治疗策略提供了扎实的机制依据和实验支持。这一发现为开发针对缺血性心脏病的新型靶向药物奠定了重要的理论基础。

参考文献

[1] Saito Y, Oyama K, Tsujita K, et al. Treatment strategies of acute myocardial infarction: updates on revascularization, pharmaco-logical therapy, and beyond[J]. J Cardiol, 2023, 81(2): 168-78. doi：10.1016/j.jjcc.2022.07.003

[2] Kulick N, Friede KA, Stouffer GA. Safety and efficacy of intracoronary thrombolytic agents during primary percutaneous coronary intervention for STEMI[J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2023, 21(3): 165-75. doi：10.1080/14779072.2023.2184353

[3] Kim H, Lee YY, Kim VN. The biogenesis and regulation of animal microRNAs[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2025, 26(4): 276-96. doi：10.1038/s41580-024-00805-0

[4] Wang ZG, Lu YJ, Yang BF. microRNAs and atrial fibrillation: new fundamentals[J]. Cardiovasc Res, 2011, 89(4): 710-21. doi：10.1093/cvr/cvq350

[5] He YJ, Cai Y, Pai PM, et al. The causes and consequences of miR-503 dysregulation and its impact on cardiovascular disease and cancer[J]. Front Pharmacol, 2021, 12: 629611. doi：10.3389/fphar.2021.629611

[6] Sun P, Wang C, Mang G, et al. Extracellular vesicle-packaged mitochondrial disturbing miRNA exacerbates cardiac injury during acute myocardial infarction[J]. Clin Transl Med, 2022, 12(4): e779. doi：10.1002/ctm2.779

[7] Wen Y, Chen R, Zhu CH, et al. miR-503 suppresses hypoxia-induced proliferation, migration and angiogenesis of endothelial progenitor cells by targeting Apelin[J]. Peptides, 2018, 105: 58-65. doi：10.1016/j.peptides.2018.05.008

[8] Sun SL, Shu YG, Tao MY. miR-503 inhibits proliferation, migration, and angiogenesis of glioma by acting on VEGFA through targeting LRIG2[J]. Cancer Manag Res, 2019, 11: 10599-608. doi：10.2147/CMAR.S222681

[9] Zhou YH, Deng L, Zhao DD, et al. microRNA-503 promotes angiotensin II-induced cardiac fibrosis by targeting Apelin-13[J]. J Cell Mol Med, 2016, 20(3): 495-505. doi：10.1111/jcmm.12754

[10] Yang Y, Zhang Y, Yang JQ, et al. Interdependent nuclear co-trafficking of ASPP1 and p53 aggravates cardiac ischemia/reperfusion injury[J]. Circ Res, 2023, 132(2): 208-22. doi：10.1161/circresaha.122.321153

[11] Bi FF, Cao M, Pan QM, et al. ITFG2, an immune-modulatory protein, targets ATP 5b to maintain mitochondrial function in myocardial infarction[J]. Biochem Pharmacol, 2024, 226: 116338. doi：10.1016/j.bcp.2024.116338

[12] Zhao PC, Zhu YQ, Sun L, et al. Circulating exosomal miR-1-3p from rats with myocardial infarction plays a protective effect on contrast-induced nephropathy via targeting ATG13 and activating the AKT signaling pathway[J]. Int J Biol Sci, 2021, 17(4): 972-85. doi：10.7150/ijbs.55887

[13] Qin W, Zhang LY, Li ZG, et al. Metoprolol protects against myocardial infarction by inhibiting miR-1 expression in rats[J]. J Pharm Pharmacol, 2020, 72(1): 76-83. doi：10.1111/jphp.13192

[14] Zhang TT, Zhang Y, Li S, et al. Gentianella acuta-derived Gen-miR-1 suppresses myocardial fibrosis by targeting HAX1/HMG20A/Smads axis to attenuate inflammation in cardiac fibroblasts[J]. Phytomedicine, 2023, 118: 154923. doi：10.1016/j.phymed.2023.154923

[15] Stein E, Duarte GBS, Bersch-Ferreira AC, et al. microRNAs, nut consumption, cardiovascular risk factors, and coronary artery disease: a narrative review[J]. Nutr Rev, 2025: nuaf243. doi：10.1093/nutrit/nuaf243

[16] Canale P, Nicolini G, Pitto L, et al. Role of miR-133/Dio3 axis in the T3-dependent modulation of cardiac mitoK-ATP expression[J]. Int J Mol Sci, 2022, 23(12):6549. doi：10.3390/ijms23126549

[17] Sun BX, Liu SW, Hao RB, et al. RGD-PEG-PLA delivers miR-133 to infarct lesions of acute myocardial infarction model rats for cardiac protection[J]. Pharmaceutics, 2020, 12(6): 575. doi：10.3390/pharmaceutics12060575

[18] Valussi M, Besser J, Wystub-Lis K, et al. Repression of Osmr and Fgfr1 by miR-1/133a prevents cardiomyocyte dedifferentiation and cell cycle entry in the adult heart[J]. Sci Adv, 2021, 7(42): eabi6648. doi：10.1126/sciadv.abi6648

[19] Faulkner JL, Sullivan JC. Circulating cell-free micro-RNA as biomarkers: from myocardial infarction to hypertension[J]. Clin Sci, 2022, 136(18): 1341-6. doi：10.1042/CS20220056

[20] Liu WH, Higashikuni Y, Sata M. Linking RNA dynamics to heart disease: the lncRNA/miRNA/mRNA axis in myocardial ischemia-reperfusion injury[J]. Hypertens Res, 2022, 45(6): 1067-9. doi：10.1038/s41440-022-00905-4

[21] Wang XJ, Liang GQ, Guo Q, et al. ELABELA improves endothelial cell function via the ELA-APJ axis by activating the PI3K/Akt signalling pathway in HUVECs and EA.hy926 cells[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2020, 47(12): 1953-64. doi：info:doi/10.1111/1440-1681.13382

[22] Liu W, Niu F, Sha H, et al. Apelin-13/APJ system delays intervertebral disc degeneration by activating the PI3K/AKT signaling pathway[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2020, 24(6): 2820-8. doi：10.26355/eurrev_202003_20643

[23] Ye LY, Huang YJ, Liu XQ, et al. Apelin/APJ system protects placental trophoblasts from hypoxia-induced oxidative stress through activating PI3K/Akt signaling pathway in preeclampsia[J]. Free Radic Biol Med, 2023, 208: 759-70. doi：10.1016/j.freeradbiomed.2023.09.030

[24] Gao SH, Chen HP. Therapeutic potential of apelin and Elabela in cardiovascular disease[J]. Biomed Pharmacother, 2023, 166: 115268. doi：10.1016/j.biopha.2023.115268

[25] Bai B, Tang JY, Liu HQ, et al. Apelin-13 induces ERK1/2 but not p38 MAPK activation through coupling of the human apelin receptor to the Gi2 pathway[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2008, 40(4): 311-8. doi：10.1111/j.1745-7270.2008.00403.x

[26] Gao M, Yin LH, Zhang B, et al. Targeting ischemic myocardium: nanoparticles loaded with long noncoding RNA AK156373 siRNA alleviate myocardial infarction[J]. ACS Nano, 2025, 19(19): 18475-91. doi：10.1021/acsnano.5c01641

[27] He JC, Zhou ZH, Kong DJ, et al. Integrative multi-omics identifies MEIS3 as a diagnostic biomarker and immune modulator in hyper-trophic cardiomyopathy[J]. Front Immunol, 2025, 16: 1675467. doi：10.3389/fimmu.2025.1675467

[28] Rong RX, Yuan T, Yan ZZ, et al. LncRNA NAV2-AS2 is critical for fibroblast-to-myofibroblast transition and cardiac fibrosis[J]. Int J Biol Macromol, 2025, 306(Pt 1): 141400. doi：10.1016/j.ijbiomac.2025.141400

[29] Yang PL, Zheng LR, Zhao YQ. Research progress on role of competitive endogenous RNA networks in heart failure and intervention by traditional Chinese medicine[J]. Zhongguo Zhongyao Zazhi, 2025, 50(12): 3232-43.

[30] Yu QT, Li YX, Zhang N, et al. Silencing of lncRNA NEAT1 alleviates acute myocardial infarction by suppressing miR-450-5p/ACSL4-mediated ferroptosis[J]. Exp Cell Res, 2024, 442(2): 114217. doi：10.1016/j.yexcr.2024.114217

[31] Li XQ, Wang H, Yao B, et al. lncRNA H19/miR-675 axis regulates cardiomyocyte apoptosis by targeting VDAC1 in diabetic cardiomyopathy[J]. Sci Rep, 2016, 6: 36340. doi：10.1038/srep36340

[32] Liu LT, An XB, Li ZH, et al. The H19 long noncoding RNA is a novel negative regulator of cardiomyocyte hypertrophy[J]. Cardiovasc Res, 2016, 111(1): 56-65. doi：10.1093/cvr/cvw078

[33] Luo H, Wang J, Liu DH, et al. The lncRNA H19/miR-675 axis regulates myocardial ischemic and reperfusion injury by targeting PPARα[J]. Mol Immunol, 2019, 105: 46-54. doi：10.1016/j.molimm.2018.11.011

基金资助

国家自然科学基金(82400361)

福建省中医药科技项目重点项目(2025ZDB009)

厦门市自然科学基金(3502Z202373125)

厦门市自然科学基金(3502Z20227075)

福建省自然科学基金(2022J011399)

福建省自然科学基金(2026J0011843)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021