1，3-二咖啡酰奎宁酸通过抑制PI3K/Akt通路减轻氧化应激缓解葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎

1,3-dicaffeoylquinic acid mitigates dextran sulfate sodium-induced colitis in mice by alleviating oxidative stress via inhibiting the PI3K/Akt pathway

摘要

目的 探讨1，3-二咖啡酰奎宁酸（1，3-DA）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎的保护作用及调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路的分子机制。 方法 体内构建DSS诱导的小鼠结肠炎模型，设置正常对照组、DSS模型组、1，3-DA干预组、PI3K抑制剂LY294002干预组及5-氨基水杨酸（5-ASA）阳性对照组，评估小鼠结肠炎病理表型，检测结肠组织炎症水平、氧化应激指标、肠上皮紧密连接蛋白及PI3K/Akt通路相关蛋白表达。体外采用过氧化氢（H₂O₂）诱导NCM460肠上皮细胞构建氧化应激损伤模型，设置对照组、模型组、1，3-DA干预组及1，3-DA联合PI3K激活剂740Y-P共处理组，检测细胞活性氧（ROS）生成、紧密连接蛋白与通路蛋白表达以验证调控机制。 结果 体内实验中，与DSS模型组相比，1，3-DA干预组小鼠体质量下降（P<0.001）、结肠长度缩短（P<0.001）、疾病活动指数（DAI）升高（P<0.001）及结肠黏膜病理损伤得到缓解，结肠组织促炎因子γ 干扰素（IFN-γ）（P<0.001）、髓过氧化物酶（MPO）表达显著下调（P<0.001），抗氧化酶：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性含量明显上调（均P<0.001），脂质过氧化产物丙二醛（MDA）水平显著降低（P<0.001），肠上皮紧密连接蛋白：闭锁小带蛋白1（ZO-1）、闭合蛋白1（Claudin-1）的表达上调（P<0.001），同时磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）与磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的表达上调受到显著抑制（均P<0.001）。体外实验中，与H₂O₂诱导的肠上皮细胞模型组相比，1，3-DA干预组细胞内ROS蓄积水平显著降低（P<0.001），紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1的表达显著上调（均P<0.001），p-PI3K（P<0.001）和p-Akt（P=0.014）的表达明显下降，且PI3K激活剂740Y-P与1，3-DA共处理后可部分逆转其对肠上皮细胞的保护作用。 结论 1，3-DA可通过抗炎、抗氧化应激、修复肠上皮屏障功能，减轻DSS诱导的小鼠结肠炎及H₂O₂介导的肠上皮细胞氧化应激损伤，其作用机制与抑制PI3K/Akt信号通路的过度异常激活密切相关。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of 1,3-dicaffeoylquinic acid (1,3-DA) against dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice and its molecular mechanism. Methods Fifty C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group, DSS model group, 1,3-DA treatment group, PI3K inhibitor (LY294002), and 5-aminosalicylic acid (5-ASA; positive control) group. Except for those in the control group, the mice were given DSS to induce colitis and treated with daily intraperitoneal injections the indicated agents during modeling for 7 consecutive days. Colonic pathological phenotypes, inflammation, oxidative stress, and expressions of tight junction proteins and PI3K/Akt pathway proteins in the colon tissues of the mice were detected. In cultured intestinal epithelial NCM460 cells with H₂O₂-induced oxidative stress, the effects of 1,3-DA and 1,3-DA plus 740Y-P (a PI3K activator) were examined on intracellular oxidative stress and expressions of tight junction proteins. Results Treatment of the mice with 1,3-DA significantly alleviated DSS-induced body weight loss, colon shortening, elevation of disease activity index and mucosal injury, downregulated interferon‑γ and myeloperoxidase, upregulated superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase, reduced malondialdehyde, increased zonula occludens-1 and claudin-1, and inhibited overexpressions of phosphorylated PI3K (p-PI3K) and phosphorylated Akt (p-Akt). In NCM460 cells, treatment with 1,3-DA significantly reduced H₂O₂-induced reactive oxygen species accumulation, increased zonula occludens-1 and claudin-1 expressions, and lowered p-PI3K and p-Akt expression. The protective effects of 1,3-DA was obviously attenuated by treatment with 740Y-P. Conclusion 1,3-DA ameliorates DSS-induced colitis in mice and H₂O₂-mediated intestinal epithelial injury by inhibiting inflammation and oxidative stress and promoting repair of intestinal barrier function, which is closely related to inhibition of excessive PI3K/Akt pathway activation.

Graphical abstract

关键词

1，3-二咖啡酰奎宁酸 / PI3K/Akt通路 / 炎症性肠病 / 氧化应激 / 肠屏障

Key words

1,3-dicaffeoylquinic acid / phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) pathway / inflammatory bowel disease / oxidative stress / intestinal barrier

炎症性肠病（IBD）是一种以慢性肠道炎症和进行性黏膜屏障破坏为特征的疾病，其发病涉及遗传、肠道菌群失调、免疫紊乱及氧化应激等多种因素的复杂交互作用^［1-4］。近年来，全球范围内IBD发病率持续攀升，尤其在工业化进程较快的地区，且发病人群越来越呈现年轻化趋势^{［5， 6］}。研究表明，氧化应激是驱动IBD发生与进展的核心环节之一，且IBD患者结肠黏膜中活性氧（ROS）水平显著升高，而超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等关键抗氧化酶的活性却明显下降^{［4， 7-9］}。过量的ROS不仅会破坏肠上皮紧密连接蛋白［如闭合蛋白1（Claudin-1）和闭锁小带蛋白1（ZO-1）］的结构与功能，而且还会进一步损害肠道屏障完整性，由此推进“炎症-氧化应激-屏障损伤”的恶性循环，继而推动疾病发展^［10-12］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路在调控细胞氧化还原平衡与存活中扮演关键角色。在IBD病理状态下，该通路常呈现异常过度激活，进而加剧肠黏膜的炎症反应与氧化损伤；反之，抑制该通路的活化则能在实验模型中减轻结肠炎症状^［13-15］。然而，当前临床主流药物，如5-氨基水杨酸（5-ASA）类虽能控制炎症，但对于伴随的氧化损伤及肠屏障功能的长期修复作用有限^{［16， 17］}。因此，寻找能够多靶点干预、兼具安全性并能促进屏障修复的天然活性成分，成为IBD治疗研究的重要方向。1，3-二咖啡酰奎宁酸（1，3-DA）是菊科植物中富含的一种天然酚酸类化合物，前期研究已显示其具有抗炎与抗氧化的潜力^{［18， 19］}。然而，1，3-DA是否对IBD具有保护作用，特别是其保护效应是否受PI3K/Akt通路影响目前尚未明确。此外，现有关于天然成分防治IBD的研究大多集中于植物粗提物，或仅针对单一病理环节（如抗炎或抗氧化）^［20-22］，缺乏对特定单体成分在“炎症-氧化应激-屏障损伤”这一多环节病理过程中系统性保护作用的深入探讨。为此，本研究采用葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎体内模型，以及过氧化氢（H₂O₂）诱导的人正常结肠上皮细胞NCM460氧化损伤体外模型，系统评价1，3-DA对肠道炎症、氧化应激状态及屏障功能的综合保护效应，探讨其作用机制与抑制PI3K/Akt通路异常激活之间的关联，以期为IBD的天然产物治疗策略提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及细胞

50只雄性无特定病原体（SPF）级C57BL/6小鼠，周龄6~8周、体质量20~26 g，采购于江苏集萃药康生物科技股份有限公司。所有小鼠均饲养在SPF级屏障环境中，环境温度控制在23±2 ℃，相对湿度维持在40%~70%，采用12 h光/暗循环模式，小鼠可自由采食灭菌专用饲料并饮用无菌水。本实验经蚌埠医科大学大学伦理委员会批准（伦理批号：伦动科批字［2025］第398号）。人正常结肠上皮细胞株NCM460由中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。

1.1.2 实验主要试剂

DSS（MP Biomedicals）；1，3-DA（上海陶术生物科技有限公司）；LY294002（MCE MedChemExpress）；740Y-P（MCE MedChemExpress）；5-Aminosalicylic Acid（上海陶术生物科技有限公司）；氧化应激检测试剂盒：GSH-PX、MDA、SOD、CAT活性检测试剂盒（索莱宝科技有限公司）；ROS检测试剂盒（碧云天）；抗体：ZO-1（Invitrogen，1∶200），Claudin-1（Abcam，1∶400）；p-PI3K（Cell Signaling Technology， 1∶1000）、p-Akt（Proteintech，1∶1000）、PI3K（Cell Signaling Technology，1∶1000）、Akt（Proteintech，1∶1000）、β-actin（Proteintech，1∶3000）、γ干扰素（IFN-γ）（Proteintech，1∶100）、髓过氧化物酶（MPO）（Proteintech，1∶100）；二抗：山羊抗兔IgG H&L（异硫氰酸荧光素（FITC） 1∶3000）、山羊抗小鼠IgG H&L（FITC，1∶3000）、山羊抗兔IgG（Alexa Fluor® 555，Abcam，1∶3000）；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔/抗鼠 IgG（中杉金桥，1∶3000）；RPMI 1640培养基、胎牛血清（Gibco）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模及药物干预

SPF级C57BL/6雄性小鼠50 只采用随机数字表法分配分为5 组（10 只/组），所有小鼠经过3 d预适应培养后开始造模及给药干预（图1A），方法如下：对照组（CON）：每日腹腔注射生理盐水1次（100 μL/只），自由饮用无菌水；模型组（DSS）自由饮用2.5% DSS溶液（唯一饮用水源）（w/v）7 d诱导急性结肠炎且同样每日腹腔注射生理盐水1次（100 μL/只）；药物干预组（1，3-DA）：在使用DSS诱导肠炎的同时，结合前人研究发现及预实验将1，3-DA浓度设置为（50 mg/kg，溶于生理盐水，100 μL/只）每日腹腔注射1次^{［18， 19］}，PI3K抑制剂LY294002（LY2）组在使用DSS诱导肠炎的同时，每日腹腔注射LY2（50 mg/kg，溶于生理盐水，100 μL/只）1次，5-ASA组在使用DSS诱导肠炎的同时，每日腹腔注射5-ASA1次（100 mg/kg，溶于生理盐水，100 μL/只）持续7 d。造模完成后，所有实验组小鼠均经腹腔注射1%戊巴比妥钠（剂量40 mg/kg）麻醉，随后实施安乐死。解剖后取出小鼠完整结肠组织，先测量其总长度，再沿肠系膜侧纵向剖开，将结肠均分为两段：近肛门端1/2固定于4%多聚甲醛用于组织病理分析，远肛门端1/2速冻于-80 ℃超低温冰箱用于分子检测。

1.2.2 NCM460细胞培养及实验处理

NCM460细胞采用含10%胎牛血清的1640培养基进行培养，置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中常规传代，每48 h更换1次培养基。待细胞生长至70%~80%汇合度时，使用0.25%无酚红胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液进行消化处理，随后进行传代操作。细胞实验分组和干预：对照组（CON组，常规培养无干预）、模型组（H₂O₂组，500 μmol/L的H₂O₂处理12 h）及药物干预组［1，3-DA（400）］组，本组处理前先用400 μmol/L的1，3-DA预孵育2 h后，联合500 μmol/L的H₂O₂干预共处理12 h，干预结束后收集细胞进行后续实验操作。机制分析：为了探索1，3-DA调控NCM460细胞的氧化应激损伤的分子机制，将细胞分为两组：药物干预组［1，3-DA（400）组］和激活剂组［1，3-DA（400）+740Y-P组］，药物干预组处理同上，激活剂组的细胞先经20 μmol/L的740Y-P预孵育2 h^［23］，后续处理同1，3-DA（400）预处理组，干预结束后收集细胞，用于后续检测。

1.2.3 小鼠肠炎症状评估

小鼠体质量监测于每日腹腔注射给药前进行，采用精度为±0.01 g的电子天平记录体质量数据，进而计算相对体质量下降率。疾病活动指数（DAI）评分包含3项指标：体质量下降率（0~4分）、粪便性状（0~4分，评分范围从成形便至水样便）及便血程度（0~4分，评分范围从无血便至肉眼血便）。DAI评分计算公式为（体质量下降率得分＋粪便性状得分＋便血程度得分）/3，分值区间为0~4分，其数值与肠炎严重程度呈正相关^［24］；结肠形态学分析：小鼠麻醉处死后，完整剖取结肠组织并置于预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液中，仔细清除附着的肠系膜脂肪。采用标准刻度尺测量结肠长度记录。组织病理学评估：将固定后的结肠组织经梯度乙醇脱水、石蜡包埋处理，制备厚度为4 μm的连续切片，随后进行苏木精-伊红（HE）染色。染色操作严格遵循试剂盒说明书流程，染色完成后用中性树脂封片。通过显微镜扫描观察结肠组织的炎症细胞浸润程度、隐窝结构完整性等病变特征，并进行病理学评分（分值范围0~4分）。具体评分标准如下：0分，无炎性细胞浸润，隐窝结构完整；1分，少量中性粒细胞浸润黏膜层，隐窝损伤<1/3；2分，炎性细胞浸润至黏膜下层，隐窝损伤1/3~2/3；3分，透壁性炎性细胞浸润，隐窝结构破坏>2/3；4分，隐窝完全消失，肠壁结构崩解。分值与小鼠结肠炎病变程度呈正相关^［25］。

1.2.4 免疫组化检测小鼠结肠组织炎症因子的表达情况

将固定后的结肠组织经梯度乙醇脱水、石蜡包埋处理后，制备4 μm厚度的小鼠结肠石蜡切片。先经二甲苯与梯度酒精依次完成脱蜡、水化处理，随后加入柠檬酸钠抗原修复液煮沸30 min，冷却至室温后用PBS缓冲液洗涤；以免疫组化笔圈定组织区域，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温放置30 min，再经5%牛血清白蛋白（BSA）封闭30 min。将切片放入湿盒，滴加一抗（MPO，1∶100；IFN-γ，1∶100），置于4 ℃环境孵育过夜。次日取出湿盒待切片复温至室温，PBS洗涤后，室温避光条件下孵育二抗（1∶1000） 1 h；再次用PBS洗涤，进行二氨基联苯胺显色，之后行苏木素染色10 min，流动水冲洗3 次；经1%盐酸酒精分化1~2 s，流动水冲洗3次；再用1%氨水返蓝10 s，纯水清洗2 次，随后按常规流程完成脱水、透明及中性树胶封片操作。采用全自动数字玻片扫描系统（Olympus VS200）扫描采集图像，用于后续观察分析。

1.2.5 小鼠肠屏障功能与紧密连接蛋白表达检测

免疫荧光染色小鼠肠道紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1：取4 μm 厚小鼠结肠石蜡包埋切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水后，以0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）行热诱导抗原修复（100 ℃，60 min）。5% BSA室温封闭30 min，加入兔源Claudin-1一抗（1∶400）与小鼠源ZO-1一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜。PBS漂洗后，滴加Alexa Fluor® 555标记山羊抗兔IgG二抗（1∶1000）、山羊抗小鼠IgG H&L（FITC）二抗（1∶1000）及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（1 μg/mL），避光孵育1 h，最后通过共聚焦显微镜成像并分析。阿利新蓝-过碘酸希夫（AB-PAS）染色小鼠肠道杯状细胞分布及酸性黏蛋白分泌：组织切片脱蜡复水后，按AB-PAS染色试剂盒说明书标准流程操作：经pH 2.5阿利新蓝染液浸染30 min，0.5%过碘酸氧化10 min，Schiff试剂避光孵育20 min，苏木素复染细胞核10 min；流动水冲洗后，经梯度乙醇脱水，中性树胶封片。采用Olympus BX53光学显微镜观察酸性黏蛋白分泌情况及杯状细胞分布特征。Western blotting检测小鼠肠道细胞质中紧密连接蛋白（Claudin-1、ZO-1）：取50 mg结肠黏膜组织，加入核质分离试剂盒配套的细胞质提取液（含1×蛋白酶抑制剂），冰浴条件下匀浆，按照试剂盒说明书操作完成核质成分分离后，于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，收集上清液（细胞质组分）。采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，取30 μg等量蛋白经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转印至聚偏氟乙烯膜上，膜经5%脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入ZO-1（1∶1000）、Claudin-1（1∶1000）及β-actin（1∶3000）一抗，4 ℃孵育过夜。Tris-盐酸缓冲盐溶液（含0.05%吐温20）洗膜后，加入HRP标记二抗（1∶3000）室温孵育1 h，电化学超敏发光液显影，ImageJ软件分析条带灰度值，目标蛋白表达量以β-actin为内参进行标准化处理。

1.2.6 NCM460细胞紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1损伤评估

将CON组、H₂O₂组、［1，3-DA（400）］组NCM460细胞按2×10⁵/孔的密度铺板接种至六孔板细胞爬片上，待细胞完全汇合后继续培养4 d，培养基每2 d更换1次。随后按下列流程开展后续处理：4%多聚甲醛固定30 min，用PBS缓冲液清洗3 遍，每遍5 min；0.2% Triton X-100 室温通透15 min，PBS再次清洗3 遍；5% BSA室温封闭30 min。弃除封闭液后，分别滴加鼠源ZO-1单克隆抗体（1∶200）与兔源Claudin-1多克隆抗体（1∶400），置于4 ℃湿盒内孵育过夜；PBS漂洗后，加入Alexa Fluor® 555标记山羊抗兔IgG二抗（1∶1000）、山羊抗小鼠IgG H&L（FITC）二抗（1∶1000）及4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（1 μg/mL），避光孵育1 h，最终通过共聚焦显微镜（Olympus FV3000）完成成像与分析。

1.2.7 小鼠肠道氧化应激标志物的测定

将小鼠结肠组织迅速置于预冷的无菌培养皿中，用预冷的PBS冲洗3 次清除残留血液及内容物，精密电子天平称取50~100 mg组织样本，参照各检测指标（GSH-PX/SOD/MDA/CAT）对应试剂盒说明书进行处理：将组织碎片转移至预冷聚丙烯匀浆管，按照各说明书要求加入试剂盒专用组织提取液，在冰浴条件下进行间歇式匀浆（每次持续30 s，间隔30 s冰浴冷却，重复3 次循环，转速8000~10 000 r/min）。匀浆液转移至预冷1.5 mL离心管中，于4 ℃条件下以12 000 r/min离心10 min，取上清液按照试剂盒说明测定组织中的GSH-PX、SOD、CAT、MDA的活性或含量。

1.2.8 NCM460细胞内ROS蓄积水平测定

取上述3 组细胞，弃培养基后，以10 μmol/L 2'，7'-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）探针避光（37 ℃）孵育20 min，无血清培养基洗涤3 次（5 min/次）。加入0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集细胞，PBS重悬后经40 μm细胞筛过滤。采用BD FACSCanto II流式细胞仪（激发波长488 nm，发射通道525 nm）检测细胞10 000 个/样本，FlowJo 10.8.1软件分析DCFH荧光强度。含细胞爬片的实验组处理同前文所述。

1.2.9 网络药理学及分子对接分析

通过网络药理学系统预测1，3-DA对溃疡性结肠炎（UC）的潜在作用靶点与调控通路，具体流程如下：药物靶点预测：通过PubChem数据库获取1，3-DA的标准化学结构及SMILES结构式，将其导入SwissTargetPrediction、SEA、TargetNet在线靶点预测平台，设定物种为“Homo sapiens”，以概率值>0.1为筛选阈值获取潜在作用靶点；经UniProt数据库对靶点基因名标准化校正，合并去重后构建药物靶点集。疾病靶点收集：以“ulcerative colitis”为关键词，在GeneCards、DisGeNET、OMIM数据库检索UC相关疾病靶点，合并去重后构建UC疾病靶点集。共同靶点筛选：采用Venny2.1.0在线工具对药物与疾病靶点集取交集，获得1，3-DA作用于UC的共同靶点。蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建：将共同靶点导入STRING 11.0数据库，设定物种为“Homo sapiens”，最低互作评分>0.700（高置信度），隐藏游离节点，构建PPI网络。通路富集分析：将共同靶点导入DAVID 6.8数据库进行京都基因与基因组百科全书信号通路富集分析（KEGG），设定物种为“Homo sapiens”，以P<0.05为显著性阈值筛选核心调控通路，采用微生信在线平台完成结果可视化。

采用分子对接验证1，3-DA与核心通路关键靶点的结合活性，具体流程如下：配体文件准备：从PubChem数据库获取1，3-DA的2D化学结构，通过Chem Office软件构建并优化其3D结构，保存mol2格式。受体文件准备：从RCSB PDB数据库筛选PI3Kδ、AKT1的高分辨率晶体结构作为对接受体，采用Pymol 2.6软件去除蛋白结构中的水分子、磷酸根等非必要组分，保存为PDB格式。对接前处理：使用AutoDock 1.5.6软件对受体蛋白进行加氢、电荷计算处理，对1，3-DA配体进行加氢、定义可旋转扭转键处理，根据受体蛋白活性口袋确定对接盒子坐标与参数。分子对接模拟：采用AutoDock Vina软件完成对接模拟，以结合自由能为核心指标，筛选1，3-DA与靶点蛋白结合的最优构象。结果可视化：采用Pymol 2.6与Discovery Studio 2019软件分析最优对接构象，绘制配体-受体相互作用的3D结构图与2D相互作用模式图。

1.2.10 体内外信号通路PI3K/Akt表达水平检测

取50 mg结肠黏膜组织，加入1 mL含1×蛋白酶抑制剂与1×磷酸酶抑制剂的放射免疫沉淀法裂解液，冰浴条件下匀浆处理，随后于4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，收集上清液。细胞经相应干预后，吸弃培养基，以2 mL/孔的PBS洗涤3次；加入预冷的放射免疫沉淀法裂解液，冰上裂解30 min，再于4 ℃、12 000 r/min高速离心10 min，收集上清液。上述组织及细胞样本的上清液用于Western blotting检测信号通路相关蛋白表达：采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，取30 μg等量蛋白经10 %十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转印至聚偏氟乙烯膜上后，将膜置于5%脱脂牛奶中，室温封闭1 h；随后分别加入兔源p-PI3K（1∶1000）、兔源PI3K（1∶1000）、鼠源p-Akt（1∶1000）、鼠源Akt（1∶1000）及鼠源内参β-actin（1∶3000）一抗，4 ℃孵育过夜。Tris-盐酸缓冲盐溶液（含0.05%吐温20）洗涤膜后，加入HRP标记二抗（1∶3000）室温孵育1 h；采用ECL超敏发光液显影，ImageJ软件分析条带灰度值，目标磷酸化蛋白的相对表达水平以磷酸化蛋白灰度值/对应总蛋白灰度值计算，总蛋白与紧密连接蛋白的相对表达水平以目标蛋白灰度值/内参β-actin灰度值计算。

1.3 统计学分析

采用SPSS27.0软件进行统计学分析。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，各干预组与模型组的两两比较采用Dunnett-t检验；不符合正态分布的资料采用非参数检验。P<0.05为差异具有统计学意义。动物实验样本量依据预实验结果确定。预实验结果显示，1，3-DA处理对DSS诱导的结肠缩短呈现明显改善效果，计算得其效应量（Cohen's d）大于1.8。为保证研究具备足够的统计效力，我们使用G*Power 3.1软件进行了先验样本量估算。设定参数为：检验类型（独立样本t检验，双尾），效应量d=1.8，α=0.05，检验效能（1-β）=0.8。计算得出每组所需最小样本量为8只。为应对潜在的个体差异、确保在多指标分析中的稳健性，并参考该领域动物实验的常规设计，将每组样本量确定为10只。最终实验结果中，主要指标显示出显著的组间差异（P<0.05），表明样本量设计能够有效支持本研究的结论。

2 结果

2.1 1，3-DA干预缓解DSS诱导的小鼠肠炎症状

经2.5% DSS诱导的结肠炎模型组小鼠表现出显著结肠炎病理特征：随着DSS干预的时间增长，模型组小鼠的体质量逐渐下降（P<0.001，图1B），与此同时模型组小鼠的DAI评分呈现升高的趋势（P<0.001，图1E）；而1，3-DA治疗组小鼠较模型组，体质量下降得到了缓解（P<0.001，图1B）、DAI明显降低（P<0.001，图1E），且1，3-DA治疗效果优于5-ASA干预组。进一步分析显示，与模型组相比，1，3-DA干预后明显地增加小鼠结肠长度（P<0.001，图1C、D）。

2.2 1，3-DA减轻DSS诱导的小鼠肠组织损伤

HE染色结果显示，DSS诱导的结肠炎模型组小鼠呈现出典型病理特征：肠黏膜区域存在明确的溃疡病灶，肠上皮连续性中断、溃疡处及周边组织内聚集大量炎症细胞浸润，同时局部黏膜固有层结构严重紊乱，正常结肠隐窝的形态与排列被破坏，而经1，3-DA干预后结肠组织损伤得到了明显改善，且组织病理学评分显著地降低（P<0.001，图2A、B）。AB-PAS染色进一步揭示，DSS组小鼠结肠杯状细胞数量减少，而其1，3-DA组中数量明显增多（P<0.001，图2C、D）。

2.3 1，3-DA抑制DSS小鼠结肠组织炎症介质的表达

免疫组化结果显示，经2.5%DSS诱导的结肠炎小鼠结肠组织中，促炎标志物IFN-γ和MPO在固有层及肠上皮细胞的阳性信号明显强于对照组；而1，3-DA治疗组阳性信号显著弱于造模组小鼠（P<0.001，图3A、B）。

2.4 1，3-DA通过上调紧密连接蛋白表达缓解DSS诱导小鼠肠道屏障功能障碍

免疫荧光染色显示：与CON组小鼠相比，DSS模型组结肠上皮细胞中Claudin-1和ZO-1的荧光强度降低，而经1，3-DA干预后得到明显恢复（图4A）。Western blotting进一步证实，与DSS组小鼠相比，1，3-DA治疗组小鼠的肠黏膜组织Claudin-1和ZO-1的蛋白表达量显著升高（P<0.001，图4B）。

2.5 1，3-DA抑制DSS诱导的小鼠肠黏膜组织中氧化应激水平

与CON组相比，DSS模型组小鼠结肠组织的氧化应激状态显著加剧：GSH-PX、SOD和CAT的活性显著降低，以及MDA水平则明显升高（P<0.001，图5A~D），而经1，3-DA干预后上述指标被明显地逆转（P<0.001，图5A~D）。

2.6 1，3-DA通过促进Claudin-1/ZO-1表达修复H₂O₂诱导的NCM460细胞紧密连接损伤

免疫荧光染色结果显示：H₂O₂组NCM460细胞中Claudin-1和ZO-1的荧光信号较对照组减弱，且呈现胞质内点状异常定位；而1，3-DA（400）组细胞的荧光信号强度增强，且紧密连接蛋白定位恢复（图6A）。Western blotting进一步定量分析证实：H₂O₂组细胞中Claudin-1和ZO-1蛋白表达量较对照组降低，而药物干预组细胞中Claudin-1和ZO-1蛋白表达量得到恢复（均P<0.001，图6B）。

2.7 1，3-DA抑制H₂O₂诱导的NCM460细胞活性氧蓄积

流式细胞术定量分析证实：H₂O₂组ROS阳性细胞比例达（75.04±2.51） %，较CON组（19.28±1.35） %升高（P<0.001），而经1，3-DA（400）浓度组干预后下调至（48.16±0.96） %（P<0.05，图7A、B）。DCFH-DA荧光探针检测进一步显示：H₂O₂组细胞内ROS荧光强度较对照组升高，呈现细胞内弥散性强荧光，而1，3-DA处理组细胞内ROS荧光强度降低（图7C）。

2.8 1，3-DA 网络药理学及分子对接分析

网络药理学分析结果显示，1，3-DA的潜在作用靶点与UC疾病相关靶点存在428个交集基因（图8A）。对交集靶点构建PPI网络，明确了1，3-DA作用于UC的核心蛋白互作关系（图8B）；KEGG通路富集分析提示，PI3K/Akt信号通路是1，3-DA调控UC的核心潜在通路之一（图8C）。分子对接结果进一步验证了1，3-DA与PI3K/Akt通路关键靶点的结合活性：1，3-DA与PI3Kδ、AKT1均能稳定结合，结合自由能分别为-8.9 kcal/mol与-10.0 kcal/mol（图8D~G）。与AKT1蛋白核心功能域的关键残基形成稳定结合。

2.9 1，3-DA通过调控PI3K/Akt通路改善结肠炎小鼠肠道氧化应激损伤

体内实验显示，与CON组相比，DSS组小鼠结肠组织细胞内p-PI3K和p-Akt蛋白含量较CON组上升；而1，3-DA与LY2干预后p-PI3K和p-Akt蛋白表达下降（P<0.001，图9A、B）。体外实验模型中，H₂O₂处理的NCM460细胞内p-PI3K及p-Akt较对照组表达上升；而其经1，3-DA预处理后明显下降（P<0.001，图9C、D）。体内实验检测小鼠结肠氧化应激指标显示：LY2干预可显著恢复DSS模型小鼠结肠组织GSH-PX、SOD、CAT活性，降低MDA水平，缓解氧化应激（P<0.001，图9E~H）。体外实验中采用PI3K激活剂740Y-P进行干预：免疫荧光和Western blotting结果显示1，3-DA+740Y-P组中紧密连接蛋白（Claudin-1和ZO-1）的表达低于1，3-DA（400）组（P<0.001，图9I~J）；流式细胞术及DCFH-DA荧光探针检测显示1，3-DA+740Y-P组ROS阳性率（69.18±1.31）%较1，3-DA（400）组（53.61±1.98）%相对提高了29.04%，且荧光强度更强（P<0.001，图9K~M）。

3 讨论

IBD的病理进程围绕炎症、氧化应激及屏障损伤等因素而进展，PI3K/Akt通路的异常过度激活，是推动氧化应激级联反应放大、加重肠黏膜损伤的重要调控环节^{［15， 26， 27］}。当前临床一线药物虽可一定程度控制肠道炎症，但对IBD伴随的氧化应激损伤、肠屏障长期修复作用有限，且长期应用存在药物耐受、不良反应累积等局限^［28］，因此发掘多靶点协同调控的天然活性成分成为IBD治疗研究热点。1，3-DA是菊科植物富含的天然酚酸，既往研究证实其具有抗炎、抗氧化活性^{［18， 19， 29］}，但其对IBD的保护效应及是否通过PI3K/Akt通路发挥作用尚未明确。本研究通过体内外模型证实，1，3-DA可通过抑制PI3K/Akt通路异常过度激活，发挥抗炎、抗氧化应激、修复肠上皮屏障的三重效应，有效改善DSS诱导的小鼠结肠炎与H₂O₂诱导的肠上皮细胞损伤，为IBD天然产物治疗提供了新的实验依据。本研究证实1，3-DA对结肠炎症状与肠上皮屏障具有双重保护作用，体内实验中，1，3-DA可显著缓解DSS诱导的小鼠体质量下降、结肠缩短、DAI评分升高，减轻黏膜炎症浸润与隐窝破坏，恢复杯状细胞数量与黏蛋白分泌；体外实验中，其可逆转H₂O₂诱导的肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1表达下调，恢复屏障功能。与结构类似物绿原酸（单咖啡酰奎宁酸）相比，1，3-DA的双咖啡酰基结构增加了酚羟基活性位点，抗氧化与细胞保护活性更优^{［30， 31］}，且可同步实现紧密连接机械屏障与黏液屏障的双重修复，弥补了绿原酸仅聚焦抗炎、对屏障保护研究不足的缺陷；与迷迭香酸直接抑制核因子κB通路的抗炎模式不同，1，3-DA通过调控PI3K/Akt通路间接实现抗炎与屏障修复的协同作用，更利于维持肠道生理稳态^{［29， 32］}。

在氧化应激调控方面，1，3-DA展现出清除ROS蓄积及增强内源性抗氧化能力的效应，其中对脂质过氧化终产物MDA的显著下调作用尤为关键。体内实验中，1，3-DA可显著提升DSS结肠炎小鼠结肠组织SOD、CAT、GSH-PX等抗氧化酶活性，同时大幅下调MDA含量，且该效应显著优于5-ASA与LY294002；体外实验中，其可将H₂O₂诱导的肠上皮细胞ROS阳性率从75.04%降至48.16%，有效抑制ROS蓄积。MDA是脂质过氧化链式反应的特异性终产物，其水平直接反映氧化损伤的级联放大程度^{［33， 34］}，在IBD病理进程中，MDA不仅是脂质过氧化的结果，还可通过蛋白交联损伤紧密连接蛋白、激活促炎通路，进一步放大“氧化应激-炎症-屏障损伤”的恶性循环^［35］。1，3-DA对MDA的显著下调，提示其可直接阻断脂质过氧化链式反应，从源头终止氧化损伤级联放大，这一特性使其相较于仅能单一提升抗氧化酶活性的咖啡酸、生物利用度极低的姜黄素，具有更显著的抗氧化优势^{［36， 37］}。机制研究证实，1，3-DA的肠道保护效应依赖于对PI3K/Akt通路异常过度激活的靶向抑制，其双咖啡酰基结构赋予了更优的靶点结合特异性。体内外实验均显示，1，3-DA可显著下调病理状态下升高的p-PI3K、p-Akt表达，而PI3K激活剂 740Y-P 可部分逆转其抗氧化与屏障保护效应，明确了通路调控的特异性。与同样靶向该通路的白藜芦醇相比，1，3-DA可通过多种作用力与PI3Kδ、AKT1核心功能域稳定结合，靶点特异性更强，且可同步调控炎症、氧化应激、肠屏障三大病理环节，弥补了白藜芦醇靶点特异性差、效应单一的缺陷^［38］；同时，1，3-DA仅靶向抑制通路的病理异常激活，而非化学抑制剂LY294002的非特异性完全抑制，更符合肠道生理调控需求。但本研究仍存在局限性：一是未明确1，3-DA的体内药代动力学特征，其口服生物利用度、肠道组织分布及代谢产物活性有待进一步验证；二是未探讨1，3-DA对肠道菌群结构及代谢产物的影响，无法明确其是否通过“菌群-肠轴”发挥协同作用，上述内容将在后续研究中完善。综上，本研究通过体内外实验证实，1，3-二咖啡酰奎宁酸可通过靶向抑制PI3K/Akt通路异常过度激活，发挥抗炎、抗氧化应激、修复肠上皮屏障的作用，有效改善实验性结肠炎与肠上皮细胞氧化损伤，为IBD治疗提供了新的天然候选分子与实验依据。

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