超声协同靶向纳米粒抑制乏氧肺癌细胞增殖、迁移及侵袭

Ultrasound-synergized targeted nanoparticles suppress proliferation, migration and invasion of hypoxic lung cancer cells in vitro

摘要

目的 针对肿瘤微环境构建一种能同时负载阿霉素（DOX）与过氧化氢酶（CAT）的AS1411适配体修饰的介孔聚多巴胺纳米颗粒（AS1411-D/C-MPDA），并探讨其联合超声对Lewis肺癌（LLC）细胞的协同治疗效果。 方法 通过一步组装法合成负载DOX和CAT并经AS1411适配体修饰的AS1411-D/C-MPDA，检测其物理特性；在细胞水平，将LLC细胞分为游离DOX组、DOX-MPDA组及AS1411-D/C-MPDA组及对应的超声组进行处理。超声参数设置为：频率1.0 MHz，强度1.0 W/cm²，持续时间3 min。通过CCK-8法检测细胞活性，流式细胞术（Annexin V-FITC/PI染色）分析细胞凋亡，划痕实验评估细胞迁移能力，以及Transwell实验评估细胞侵袭能力。 结果 成功制备AS1411-D/C-MPDA纳米材料，其呈大小均匀的球形颗粒，粒径为183.36±15.99 nm、包封率DOX（91.17±0.08）%，CAT（29.59±0.2）%，具有pH响应性，能裂解并促进药物释放，DOX释药率为（81.25±1.61）%，该纳米材料有较强的产氧能力，缓解了缺氧状态。AS1411修饰的纳米材料对LLC细胞的摄取显著增强。与游离DOX和DOX-MPDA联合超声相比，AS1411-D/C-MPDA联合超声能诱导LLC细胞产生更多的活性氧，从而诱导细胞凋亡，细胞活性明显降低、划痕愈合面积减小（0.097±0.010 mm²vs 0.278±0.001 mm²，P<0.01）及侵袭细胞数量减少（24.33±12.01个vs 352±4.36个，P<0.001）。 结论 AS1411-D/C-MPDA联合超声通过靶向递送抗癌药物，有望成为物理声学、药物化学、微环境调控协同治疗肺癌的新策略。

Abstract

Objective To construct AS1411 aptamer-modified mesoporous polydopamine (MPDA) nanoparticles co-loaded with doxorubicin (DOX) and catalase (AS1411-D/C-MPDA nanoparticles) targeting the tumor microenvironment and evaluate their efficacy in synergy with ultrasound for inhibiting Lewis lung carcinoma (LLC) cells. Methods AS1411-D/C-MPDA nanoparticles were synthesized using a one-step assembly method, and their physicochemical properties were characterized. Cultured LLC cells were treated with free DOX, DOX-loaded MPDA nanoparticles or AS1411-D/C-MPDA nanoparticles with or without ultrasound exposures (frequency 1.0 MHz and intensity 1.0 W/cm²) for 3 min. The changes in viability, apoptosis, and migration and invasion abilities of the cells were assessed using CCK-8 assay, flow cytometry (Annexin V-FITC/PI staining), wound healing assay, and Transwell assay, respectively. Results The prepared AS1411-D/C-MPDA nanomaterials showed a uniform spherical morphology, a mean particle size of 183.36±15.99 nm, and DOX and catalase encapsulation efficiencies of (91.17±0.08)% and (29.59±0.2)%, respectively. The nanoparticles demonstrated good pH responsiveness to enable disintegration for promoting drug release, with a cumulative DOX release rate of (81.25±1.61)%. The nanoparticles possessed strong oxygen-generating capacity to alleviate cell hypoxia. AS1411-modified nanoparticles showed significantly enhanced cellular uptake by LLC cells. Compared with free DOX and DOX-MPDA nanoparticles combined with ultrasound, AS1411-D/C-MPDA in synergy with ultrasound induced higher levels of ROS in LLC cells, resulted in a higher cell apoptosis rate, and more efficiently reduced cell viability and suppressed cell migration and invasion. Conclusion AS1411-D/C-MPDA nanoparticles combined with ultrasound allow targeted delivery of anticancer drugs and represent a promising strategy for synergistic treatment of lung cancer by integrating physical acoustics, pharmaceutical chemistry, and tumor microenvironment regulation.

Graphical abstract

关键词

肺癌 / 声动力疗法 / 多巴胺 / 纳米药物 / 主动靶向

Key words

lung cancer / sonodynamic therapy / mesoporous polydopamine / nanodrug / active targeting

肺癌的发病率和死亡率位居世界前列，对人类的生命安全造成极大的威胁 ^{［1， 2］}。目前，临床上常用的肺癌治疗方法如手术切除、放疗、化疗等^［3］ ，因其创伤大、严重的毒副作用及耐药性导致治疗的局限性^［4］。化疗药物如阿霉素（DOX）虽应用广泛，但缺乏肿瘤靶向性，易对正常组织产生损伤，且肿瘤内部对缺氧微环境会降低治疗疗效且会使肿瘤进行侵袭转移。纳米材料通过靶向药物递送在肿瘤部位富集以及药物的缓释能力，为改善化疗的局限性提供了新的方法^［5］。介孔聚多巴胺（MPDA）因其良好的生物安全性，多孔结构的高比表面积、pH响应特性和表面可修饰性，成为理想的纳米载药材料^［6］。近年来，声动力疗法（SDT）受到广泛关注。但由于SDT本身耗氧，会加剧肿瘤内部的缺氧，从而降低治疗疗效^{［7， 8］}。为解决上述治疗问题，有研究利用“核-卫星”纳米结构实现响应级联递送和乏氧调节能力的“核-卫星”纳米结构^［9］；还有研究激光响应性仿生聚多巴胺球增强肿瘤靶向性^［10］，均取得了一定的进展，但在多重协同以及精准靶向肿瘤部位方面有提升的空间。

本研究针对肺癌治疗中存在的药物递送效率低，缺氧环境加剧耐药及药物无法特异性识别并高效杀伤肺癌细胞等问题，创新性地制备连接AS1411适配体并载有化疗药物DOX和生物酶CAT的纳米粒（AS1411-D/C-MPDA），通过靶向小鼠Lewis肺癌细胞（LLC）、催化活性氧（ROS）生成，验证抑制LLC细胞增殖、迁移和侵袭效果。纳米药物与SDT结合，通过超声能量驱动纳米药物的靶向递送与可控释药，形成 “纳米载药-SDT” 协同抗癌策略^［11］。在超声辐照下，超声联合声敏剂DOX通过产生ROS杀伤肺癌细胞，同时过氧化氢酶（CAT）能催化肿瘤微环境（TME）中过量的H₂O₂产生O₂^［12］，缓解肿瘤内部缺氧状态提高治疗疗效。另外，基于核仁素在LLC细胞中的高表达，本研究选择AS1411作为靶向的适配体功能化纳米粒，AS1411的修饰能够增强纳米材料对肿瘤细胞的识别且富集在肿瘤部位，有效提升肿瘤部位的药物浓度，同时降低正常组织部位的药物浓度，从而在保证治疗效果的前提下极大地降低患者全身毒副作用。本研究旨在通过构建AS1411靶向的AS1411-D/C-MPDA纳米系统，在超声辐照下实现药物的高效靶向递送，并同步催化肿瘤微环境中的H₂O₂产生O₂以缓解缺氧；同时激发声动力效应产生ROS，从而特异性杀伤LLC细胞，最终形成一种集物理声学、药物化学与微环境调控于一体的协同抗肿瘤新策略。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

1.1.1 药品及试剂

AS1411适配体（上海生工生物工程股份有限公司）；盐酸多巴胺（上海易恩化学技术有限公司）；普朗尼克F127、二苯基异苯并呋喃（sigma-Aldrich）；间三甲苯（上海麦克林生化科技股份有限公司）；三羟甲基氨基甲烷、过氧化氢酶、Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；盐酸阿霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胎牛血清（南京森贝伽生物科技有限公司）；DMEM培养基、0.25%胰酶溶液（Gibco）；磷酸盐缓冲液（PBS）、4%多聚甲醛（Bio Sharp）；MES（pH=5）缓冲液（Thermo Scientific）；3%H₂O₂ （武汉博士德生物工程有限公司）；无血清细胞冻存液（苏州新赛美生物科技有限公司）；青霉素-链霉素溶液、活性氧试剂盒（DCFH-DA）、4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、Lyso-Tracker Green染料、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁生物有限公司）；Falcon细胞培养小室、Matrige/基质胶（Corning）；TM-100型医用超声耦合剂（天津成信医用辅助材料厂）。

1.1.2 仪器

磁力搅拌器（江苏荣华仪器公司），紫外分光光度计（日本岛津制作所），透射电子显微镜 （TEM，Hitachi），马尔文激光粒度仪 （DLS，Zetasizer），激光共聚焦显微镜（CLSM，Nikon），电子分析天平（Mettler ToleDo），多功能酶标仪、恒温混匀仪、恒温细胞培养箱（Thermo Scientifc），便携式溶解氧计（上海仪分科学仪器有限公司），超声声震仪（sonics），傅立叶红外光谱仪（Nicolet Instrument），光学倒置显微镜（OLYMPUS），低强度超声设备（重庆融海超声医学工程研究中心有限公司）。

1.2 细胞来源及培养

小鼠LLC细胞株购自上海富衡生物科技有限公司，人支气管上皮样细胞系16HBE细胞株由重庆医科大学肿瘤学及表观遗传学实验室提供。两种细胞均使用含10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基，置于5% CO₂、37 ℃恒温培养箱里培养。

1.3 方法

1.3.1 AS1411-D/C-MPDA的制备及表征

将普朗尼克F127加入到水和乙醇的混合溶液中，然后加入间三甲苯，于室温搅拌30 min。将Tris溶液加入上述反应体系，然后加入盐酸多巴胺继续搅拌24 h。将反应溶液以13 000 r/min离心10 min，用乙醇-丙酮混合有机溶剂重悬，水浴超声30 min，重复3次，离心后得到MPDA沉淀。

采用一步组装纳米颗粒制备方法制备AS1411-D/C-MPDA。首先将DOX与CAT的混合溶液加入MPDA溶液中，室温磁力搅拌过夜。随后，该反应液经多次离心（12 000 r/min，5 min）弃去上清，沉淀用去离子水洗涤3次，最终重悬得到DOX/CAT-MPDA纳米粒。FAM-AS1411-D/C-MPDA是将含5'6-FAM荧光修饰的AS1411适配体与DOX/CAT-MPDA纳米材料于室温避光孵育合成的。AS1411-D/C-MPDA流程见图1^［13］。

1.3.2 AS1411-D/C-MPDA的表征

TEM观察AS1411-D/C-MPDA在不同pH条件下的表观形貌。紫外分光光度计检测吸光度A_{233 nm}、A_{280 nm}。DLS检测 AS1411-D/C-MPDA的粒径及电位。

1.3.3 AS1411-D/C-MPDA的稳定性和pH响应性

为验证AS1411-D/C-MPDA 的稳定性，将AS1411-D/C-MPDA与含10% FBS的DMEM培养基混合，于37 ℃条件下孵育并在0、2、4、8、24、48、72、96、120 h取样。为验证AS1411-D/C-MPDA的pH响应性，将AS1411-D/C-MPDA用PBS（pH 5.5）和PBS（pH 7.4）溶液重悬，于0、2、4、8、24、48、72、96、120 h取样。对上述样品进行DLS检测。

1.3.4 AS1411-D/C-MPDA的释药

将制作好的AS1411-D/C-MPDA纳米粒离心后取上清，使用紫外分光光度计检测DOX的吸光度值A_{233 nm}、A_{480 nm}，以及CAT的吸光度值A_{280 nm}。然后，根据包封率公式：包封率（%）=（药物投药量-未包封的药物质量） /药物投药量×100%，载药率（%）=（药物投药量-未包封的药物质量）/纳米粒的质量×100%，计算DOX和CAT的包封率。鉴于MPDA具有较好的pH响应特性，探究了不同pH条件下AS1411-D/C-MPDA释放DOX的能力。在不同的时间点（0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h）吸取300 μL液体，用紫外分光光度计检测A_{233 nm}。DOX释放率计算公式如下：DOX释放率（%）=DOX释放量/DOX负载量×100%。

1.3.5 AS1411-D/C-MPDA的氧气产生能力

分别在3%的H₂O₂溶液中加入CAT、AS1411-D/C-MPDA、DOX和MPDA，同时以双蒸水为对照，通过便携式溶解氧仪检测不同样品溶液中氧气的产生量。

1.3.6 ROS产生能力评价

配置以下混合溶液：DPBF+去离子水（作为空白对照）；DPBF+DOX+H₂O₂；DPBF+AS1411-D/C-MPDA（pH 5.5）+H₂O₂其中H₂O₂溶液的终浓度均1.5%。各组分别使用频率为1 MHz的超声以1 W/cm²的声强辐照3 min。每3 min测定1次A_{420 nm}，将第x分钟的吸光度值定义为L_X。根据体系中DPBF的消耗来评价超声激发下各样品催化活性氧产生的能力，计算公式如下：DPBF消耗率（%）=（Lo-L_X）/Lo×100%。

1.3.7 AS1411-D/C-MPDA的靶向性验证

将LLC细胞以1×10⁵/孔的密度接种于共聚焦皿中孵育24 h，加入4 μg/mL FAM-AS1411-D/C-MPDA或DOX/CAT-MPDA悬液（本研究细胞实验部分所用药物均以无血清DMEM培养基配制，药物浓度以DOX计）。孵育3 h，用4%多聚甲醛固定，DAPI染液染色，每个步骤结束后用PBS洗涤3次。CLSM观察LLC细胞与FAM-AS1411-D/C-MPDA或DOX/CAT-MPDA的连接情况。

1.3.8 AS1411-D/C-MPDA的细胞摄取

将生长良好的LLC细胞以1×10⁵/孔的密度接种于CLSM皿中，置于37 ℃恒温、5% CO₂的细胞培养箱中孵育24 h。加入由DMEM培养基配制的AS1411-D/C-MPDA，共同孵育5 h后加入Lyso-Tracker Green染料继续孵育1 h，Hoechest 33342染色10 min，CLSM观察。

1.3.9 AS1411-D/C-MPDA的安全性验证

将生长良好的16HBE细胞以5×10⁴/孔的密度接种于96孔培养板中培养24 h，与不同浓度DOX或AS1411-D/C-MPDA溶液（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL，药物浓度以DOX计）共同孵育4 h。用PBS洗涤2~3次以去多余药物后，更换新的无血清DMEM培养基，分别继续培养于24、48、72 h后，使用CCK-8试剂检查16HBE细胞活力。

1.3.10 细胞毒性实验

将生长良好的LLC细胞以5×10⁴/孔的密度接种于96孔培养板中培养24 h。分为DOX组、DOX-MPDA组和AS1411-D/C-MPDA组，每组设3个复孔。用不同浓度的DOX、DOX-MPDA、AS1411-D/C-MPDA溶液（0.00、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μg/mL，药物浓度以DOX计）孵育4 h，PBS洗涤3次，并更换新的无血清DMEM培养基，培养24 h后用CCK-8试剂检测LLC细胞的活力。

1.3.11 流式细胞术检测细胞周期

将生长良好且处于对数生长期的LLC细胞接种于6孔板，所有细胞分为8组：Control组、DOX组、DOX-MPDA组、AS1411-D/C-MPDA组、US组、DOX+US组、DOX-MPDA+US组和AS1411-D/C-MPDA+US组。去除旧培养基后，按如下分组分别更换为相应物质的无血清DMEM培养基：Control组与US组含PBS的培养基，DOX组与DOX+US组含游离DOX的培养基，DOX-MPDA组与DOX-MPDA+US组含DOX-MPDA的培养基，AS1411-D/C-MPDA组与AS1411-D/C-MPDA+US组含AS1411-D/C-MPDA的培养基。AS1411-D/C-MPDA浓度以DOX计，DOX的终浓度为2 μg/mL。共同孵育4 h后，用PBS洗涤细胞3次以除去残留药物。更换新的无血清培养基后立即对标记为‘+US’的各组进行超声辐照（频率为1.0 MHz，强度1.0 W/cm²）辐照3 min后继续培养24 h。通过2.5%胰酶消化获取细胞，取1×10⁶个细胞以PBS清洗数次后加入4 ℃预冷的70%乙醇200 μL固定4 h，PBS清洗2次后加入RNase A（10 μg/mL）和PI（50 μg/mL）染料，置于室温孵育30 min，进行流式细胞术检测。

1.3.12 AS1411-D/C-MPDA联合超声诱导LLC细胞活死及凋亡检测

将处于对数生长期的LLC细胞以1×10⁶/孔的密度接种于共聚焦皿中，并置于37 ℃恒温、5% CO₂的细胞培养箱中孵育24 h。所有细胞分组及药物处理同1.3.11处理。用PBS洗涤1次后，向各组共聚焦皿中加入Calcein-AM/PI检测工作液，37 ℃避光孵育30 min。用PBS清洗后通过激光共聚焦显微镜（CLSM）观察不同细胞的凋亡情况。

同时，行流式细胞术实验，将处于对数生长期的LLC细胞以1×10⁶/孔的密度接种于6孔板中并置于37 ℃恒温、5% CO₂的细胞培养箱中孵育24 h。所有细胞分组及药物处理同1.3.11处理。用0.25%胰蛋白酶消化细胞3 min，收集细胞并以1000 r/min的速率离心5 min，去除上清液洗涤细胞后，用Assay Buffer重悬细胞，并调整细胞密度至1×10⁶/mL，制备成100 μL细胞悬液。离心上述细胞悬液后，加入1 mLCalcein-AM/PI检测工作液，重悬为单细胞悬液，37 ℃避光孵育30 min。用流式细胞仪检测不同组细胞的凋亡情况。

1.3.13 AS1411-D/C-MPDA在LLC细胞中产生ROS的能力

将处于对数生长期的LLC细胞以1×10⁵/孔的密度接种于共聚焦培养皿，并于37 ℃恒温、5% CO₂的细胞培养箱中孵育24 h。所有细胞分组及药物处理同1.3.11。向各组共聚焦皿中加入1 mL含DCFH-DA探针（终浓度为20 μmol/L）的无血清DMEM培养基，孵育30 min后，用PBS洗涤去除残留探针。随后，立即对设定的超声处理组进行超声辐照，并通过CLSM检测LLC细胞内ROS的生成水平。

1.3.14 划痕实验

将处于对数生长期的LLC细胞接种于6孔板并置于37 ℃恒温、5% CO₂的细胞培养箱中培养至细胞均匀铺满整个孔板底部，使用200 μL无菌枪头在6孔板底部竖直划出一条直线，用PBS洗去脱落细胞。所有细胞分组及药物处理同1.3.11。在划痕后的0 h和24 h，通过倒置显微镜对各实验组的划痕区域进行观察并拍摄图像。利用Image J软件分析计算划痕面积变化，以此评估AS1411-D/C-MPDA联合超声对LLC细胞迁移能力的影响。

1.3.15 Transwell小室实验

将4 ℃预冷的Matrigel基质胶与无血清DMEM培养基混合（1∶8）后加入上室凝固成型。取对数生长期的LLC细胞按照步骤1.3.11进行分组以及相应处理。处理完成后，上室加入300 μL浓度为5×10⁴ /mL的LLC细胞悬液。并在下室中加入800 μL含20% FBS的DMEM培养基，再将小室置于细胞培养箱继续培养24 h。用4 ℃预冷甲醇固定各实验组30 min，PBS洗涤3次，再用1%结晶紫染料进行染色10 min，PBS洗净后用棉签轻轻擦拭去除膜内侧的细胞，待小室阴干后，于显微镜下随机选取多个视野观察拍摄并计数穿过基质胶和膜的下表面的细胞数。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 9软件进行绘图与数据分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组数据之间比较使用单因素方差分析，若差异具有统计学意义，再使用Tukey's多重比较检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 制备的AS1411-D/C-MPDA的基本特性

TEM观察结果显示，该AS1411-D/C-MPDA纳米材料为结构均匀球形颗粒（图2A），在酸性pH5.5条件下MPDA会溶胀破裂（图2B）。通过紫外吸收光谱可见AS1411-D/C-MPDA与DOX、CAT有类似的特征吸收峰，DOX特征吸收峰位于230 nm、480 nm处，CAT的特征吸收峰位于280 nm处（图2C），其中AS1411-D/C-MPDA的DOX包封率为（91.17±0.08）%，CAT包封率为（29.59±0.2）%，DOX载药率为（3.48±0.05）%，CAT载药率为（1.13±0.02）% （图2C）。DLS分析结果显示，AS1411-D/C-MPDA的粒径为183.36±15.99 nm，Zeta电位为-16.62±0.21 mV。

2.2 AS1411-D/C-MPDA具有良好稳定性和pH响应性

用MES溶液（pH5.5）模拟肿瘤内部酸性环境，验证AS1411-D/C-MPDA的pH响应性，经MES处理后AS1411-D/C-MPDA的粒径随时间增大，而在pH7.4及10%FBS处理条件下AS1411-D/C-MPDA的粒径未见明显变化（图3）。

2.3 AS1411-D/C-MPDA的药物释放

AS1411-D/C-MPDA的DOX释放结果显示（图4A），AS1411-D/C-MPDA在中性条件下较为稳定，48 h累计释放率达（14.51±0.47）%，在酸性条件下，DOX能快速释放，48 h累计释放率达（81.25±1.61）%。

2.4 AS1411-D/C-MPDA的产氧能力

通过便携式溶氧仪检测不同溶液的氧气生成量显示，单纯的MPDA不能催化H₂O₂ 产生氧气，而游离的CAT及AS1411-D/C-MPDA能够在与3% H₂O₂溶液反应后，均能产生更多的氧气（图4B）。

2.5 AS1411-D/C-MPDA催化ROS生成能力

检测DPBF消耗反映ROS的产量结果显示（图4C），在无DOX作用时，DPBF缓慢消耗，15 min内消耗率仅为（2.52±2.15）%。在DOX存在的情况下，15 min内的DPBF的消耗率分别为（9.42±1.49）%，而AS1411-D/C-MPDA具有较强的催化ROS产生能力，15 min内DPBF消耗率为（43.33±0.10）%。

2.6 AS1411-D/C-MPDA的肿瘤靶向性能力

通过CLSM对AS1411-D/C-MPDA的肿瘤靶向性进行验证显示，AS1411-D/C-MPDA与16HBE细胞共孵育3 h后，16HBE细胞表面几乎无明显的红色及绿色荧光信号。LLC分别与FAM-AS1411-D/C-MPDA、DOX/CAT-MPDA共孵育3 h后（图5），FAM-AS1411-D/C-MPDA组 LLC细胞表面的红色与绿色荧光信号强度均高于DOX/CAT-MPDA组，含有AS1411适配体赋予AS1411-D/C-MPDA能特异性识别LLC细胞的能力。

2.7 AS1411-D/C-MPDA的细胞摄取能力

CLSM结果显示（图6），共培养5 h后，FAM-AS1411-D/C-MPDA（DOX红色荧光）与溶酶体（绿色荧光）呈高度共定位（黄色荧光），表明AS1411-D/C-MPDA通过AS1411适配体与LLC细胞特异性连接后，主要定位于溶酶体中。

2.8 AS1411-D/C-MPDA具有良好的生物相容性

CCK-8检测结果显示（图7），在72 h、浓度为8 μg/mL时，DOX处理后16HBE细胞的相对细胞活性仅为（2.69±0.92）%，显著低于经AS1411-D/C-MPDA处理组（16.02±0.05）%，差异有统计学意义（P<0.001）。

2.9 AS1411-D/C-MPDA能有效抑制LLC细胞增殖

CCK-8检测结果显示（图8A），当DOX终浓度为2 μg/mL时，经AS1411-D/C-MPDA处理过后的LLC细胞的相对细胞活为（57.04±1.52）%，与DOX差异有统计学意义（P<0.05）。当DOX终浓度为4 μg/mL时，经AS1411-D/C-MPDA处理过后的LLC细胞的相对细胞活为（27.73±0.45）%，与DOX（P<0.001）和DOX-MPDA（P<0.01）形成显著差异。当DOX终浓度为8 μg/mL时，经AS1411-D/C-MPDA处理过后的LLC细胞的相对细胞活为（10.96±0.12）%，与DOX（P<0.001）和DOX-MPDA（P<0.001）差异有统计学意义。

2.10 AS1411-D/C-MPDA联合超声能有效抑制LLC细胞增殖

流式检测结果显示（图8B），药物处理后处于G0/G1期细胞比例减少，而S期和G2/M期的LLC细胞比例增加，由此可见DOX以及超声均能抑制LLC细胞增殖从而使滞留于G2期的细胞比例增加。与Control组、AS1411-D/C-MPDA组及DOX-MPDA+US组相比，AS1411-D/C-MPDA+US组滞留于G2期LLC细胞的比例最高，为（60.5±2.60）%，其差异具有统计学意义（P<0.001）。

2.11 AS1411-D/C-MPDA联合超声诱导LLC细胞凋亡

CLSM检测AS1411-D/C-MPDA联合超声诱导LLC细胞凋亡的效果显示（图9A），对照组和US组的细胞大多呈绿色荧光（活细胞）为主，细胞活性较强。游离DOX组，DOX-MPDA和AS1411-D/C-MPDA组的红色荧光（死细胞）所占比例依次增高。经过超声辐照后，各实验组红色荧光进一步加强，而绿色荧光相应减弱。

流式细胞仪定量分析AS1411-D/C-MPDA联合超声诱导LLC细胞凋亡的结果与CLSM相符（图9B、C），其中AS1411-D/C-MPDA+US组的细胞凋亡率为（45.46±3.90）%，高于其他各处理组，与Control组和DOX-MPDA差异有统计学意义（P<0.001），与AS1411-D/C-MPDA组差异有统计学意义（P<0.05），AS1411-D/C-MPDA联合超声能有效促进LLC肺癌细胞凋亡。

2.12 AS1411-D/C-MPDA在细胞中产生ROS的能力

CLSM结果显示（图10），在对照组样品中几乎没有观察到绿色荧光信号，而在DOX、DOX-MPDA和AS1411-D/C-MPDA组的样品中则可观察到较弱的绿色荧光信号，可见DOX、DOX-MPDA和AS1411-D/C-MPDA均能促进ROS的生成。经过US辐照后的结果与DOX、DOX-MPDA和AS1411-D/C-MPDA组具有相同的趋势，且与之相比可观察到更强的荧光信号，证明超声辐照能有效促进ROS生成。

2.13 AS1411-D/C-MPDA联合超声抑制LLC细胞迁移

细胞划痕实验结果显示（图11），在用单纯药物处理24 h后，游离DOX组的划痕愈合面积为0.278±0.001 mm²，AS1411-D/C-MPDA组降低为0.223±0.082 mm²（P<0.001）。联合超声辐照后，各实验组细胞划痕愈合率进一步降低，其中AS1411-D/C-MPDA+US组的划痕愈合率最低，仅为0.097±0.010 mm²（P<0.001）。

2.14 AS1411-D/C-MPDA联合超声抑制LLC细胞侵袭能力

Transwell小室实验结果显示（图12），在用单纯药物处理24 h后，AS1411-D/C-MPDA处理组穿过Matrigel基质胶的LLC细胞数量减少，低于游离DOX组（P<0.001）。联合超声辐照后，各实验组穿过的LLC细胞数量明显减少，与游离DOX+US处理组相比，AS1411-D/C-MPDA+US处理组穿过Matrigel基质胶的LLC细胞数量明显减少（P<0.001）。

3 讨论

本研究构建了一种由AS1411适配体介导的、共负载化疗药物DOX与CAT的介孔聚多巴胺纳米材料（AS1411-D/C-MPDA）。该体系旨在联合超声技术，通过AS1411实现对LLC细胞的主动靶向，利用CAT催化分解肿瘤内源性过氧化氢产生氧气以缓解缺氧，从而增强声动力疗效，协同促进ROS生成与DOX的化疗效果，最终实现高效抑制肿瘤生长与转移的目标。本研究为发展一种集靶向化疗、微环境调控与物理治疗于一体的协同抗肿瘤新策略提供了有力依据。

本研究采用MPDA作为纳米载体，其具有高比表面积，为药物负载提供了巨大空间，易于实现DOX与CAT等高包封率负载^［14］。同时，MPDA表面丰富的官能团使其无需复杂的化学改性即可进行功能化修饰^［15］，这相较于传统载体更具优势。为解决DOX在临床应用中易引发心肌损伤和骨髓抑制等强副作用的问题。本研究构建AS1411-D/C-MPDA体系，具有良好的药物包封率，DOX 的包封率可达（91.17±0.08）%，具有良好的稳定性，可有效避免药物突释，从而有望显著降低其系统性毒性。

声动力疗法是一个耗氧的过程，而肿瘤环境是缺氧环境^［16］，治疗进一步加重肿瘤内部缺氧环境，降低治疗效果。本研究制备的AS1411-D/C-MPDA负载的CAT通过催化TME中过量的H₂O₂生成O₂，缓解肿瘤内部缺氧环境，提高治疗疗效。且AS1411-D/C-MPDA还具备pH响应性释药特性^［17］ ，在酸性TME（pH=5.5）下释放率>80%，进而加速DOX释放，而在生理情况下（pH=7.4）释放较慢，有效减少了DOX的全身毒性。通过安全性验证实验证明AS1411-D/C-MPDA对正常细胞的毒性较弱，具有良好的生物相容性^［18］。此外，AS1411适配体能与癌细胞表面过表达的核仁素特异性结合^［19］，增强纳米颗粒在LLC细胞中的摄取效率，同时降低了对正常16HBE细胞的毒性，体现了主动靶向的精准性。为验证AS1411修饰纳米材料的靶向性，本研究设置了非靶向组和靶向组。通过细胞摄取实验，AS1411-D/C-MDPA在LLC细胞中的富集效率显著高于DOX/CAT-MPDA，且与溶酶体共定位明确，证明AS1411介导的主动靶向有效促进了纳米粒的细胞内化功能。

药物化学治疗和声动力治疗的双重协同治疗是肿瘤综合治疗的发展方向，声动力疗法（SDT）是通过超声激活声敏剂，产生ROS杀伤病变细胞并实现对疾病的治疗^［20］。AS1411-D/C-MPDA负载的DOX不仅是化疗药物，更是一种声敏剂，通过插入DNA抑制肿瘤增殖，其联合超声处理后能够产生较多的ROS。超声辐照DOX-MPDA较DOX产生的ROS明显增多的原因是MPDA作为纳米材料的载体提高了药物的胞内递送效率。细胞摄取实验证实，AS1411-D/C-MPDA通过主动靶向，显著提高了LLC细胞对DOX的摄取量，故细胞内富集的药物浓度显著高于DOX组。又因为DOX是一种良好的声敏剂，在超声的激发下可产生ROS。因此，细胞内更多的DOX意味着在超声激发下可产生更多的ROS。ROS可以通过氧化脂质、损伤DNA、促使蛋白质断裂等多种途径诱导癌细胞凋亡^{［21， 22］}，显著提升凋亡率。流式细胞术结果显示AS1411-D/C-MPDA+US 组引发了显著的G2/M期阻滞和凋亡。除DNA损伤外，高水平的ROS可能通过氧化线粒体膜脂质，降低线粒体膜电位，从而诱导线粒体凋亡途径^［23］；同时可能激活=Caspase-3/-9等关键执行蛋白，导致不可逆的细胞凋亡^［24］。这种协同治疗有效克服了单一化疗的耐药性问题，与既往研究相比，进一步放大了抗肿瘤效果。

对肺癌转移病灶的抑制作用是不同治疗手段预后的重要指标，细胞划痕实验主要模拟了细胞集体迁移和伤口愈合的过程^［25］。结果表明，单纯化疗药物DOX虽能一定程度抑制迁移，但效果有限。而当DOX被MPDA载体负载后，抑制效果相比较强，这很可能归因于纳米载体增强了细胞对药物的内吞作用，提高了胞内药物浓度^［26］，最大的效应出现在AS1411-D/C-MPDA联合超声组，其划痕愈合率最低。其核心机制是超声触发的SDT效应。超声激活声敏剂DOX，产生大量ROS，如单线态氧（¹O₂）和羟基自由基（·OH）^［27］。此外，CAT的加入催化TME的H₂O₂产生O₂，缓解了肿瘤微环境的缺氧，由于氧气是产生ROS的底物，故可能进一步增强了SDT的效率，并与DOX的化疗作用产生协同，最终导致细胞迁移能力降低；Transwell实验则更进一步，专门用于评估细胞的定向迁移与侵袭能力。侵袭实验中的Matrigel基质胶模拟了体内的基底膜屏障，因此该结果更能说明细胞穿透细胞外基质向远处转移的恶性行为^［28］。

与纳米材料相关文献相比，本实验构建的AS1411-D/C-MPDA纳米系统通过多重协同效应提高治疗疗效。例如，有研究显示“核-卫星”纳米结构侧重于级联药物递送和乏氧调节，利用了激光响应性释放，而本研究通过利用声动力治疗的无创性特点，连接AS1411适配体介导主动靶向、DOX化学治疗、CAT驱动的缓解缺氧状态与MPDA的pH响应性释药，实现化疗、声动力治疗、微环境调控的多重协同治疗。同样，有研究利用DNA纳米花负载DOX并通过AS1411靶向肺癌细胞^［29］，但其侧重于基金沉默HIF-1α与化学治疗、声动力相结合。本研究直接通过CAT酶直接改善了肿瘤微环境的乏氧状态，为声动力治疗提供了底物。

本研究的结论主要基于体外细胞实验的研究，AS1411-D/C-MPDA 在体内长效血液循环特性、靶向富集效率等抗肿瘤效果尚需在动物模型中进行实验验证。此外，其诱导凋亡和抑制转移的分子通路（如对 PI3K/Akt、MAPK 等信号通路的影响）仍需要进一步深入探索^［30］。

综上所述，针对肺癌治疗面临的临床问题，本研究成功制备了一种基于MPDA的纳米材料，实现了SDT与抗癌药物的协同增效作用，可靶向抑制LLC细胞的增殖及侵袭并促进凋亡，有望为肺癌治疗提供新思路。

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