ZEB2通过CYLD/FASN轴重编程脂质代谢促进胶质母细胞瘤进展

ZEB2 promotes glioblastoma progression by reprogramming lipid metabolism through the CYLD/FASN axis

摘要

目的 系统评估ZEB2对胶质母细胞瘤代谢网络的调控特征及其潜在分子机制。 方法 在LN-229细胞及GBM007细胞中构建ZEB2敲低稳转株（shZEB2#1、shZEB2#2）及阴性对照（shNC），建立小鼠颅内移植瘤模型评估肿瘤生长与小鼠生存期。体外采用Nile Red染色与透射电镜观察并定量脂滴，开展脂质组学分析差异脂质类别构成，并以荧光漂白恢复（FRAP）检测膜流动性。机制方面，基于ZEB2敲低RNA测序（RNA-seq）差异基因，结合FASN免疫沉淀-质谱结果及BioGRID数据库中FASN互作蛋白信息（IgG对照）进行交集筛选获得候选分子并以Western blotting验证；采用启动子荧光素酶报告、ChIP-qPCR及启动子突变实验验证ZEB2对去泛素化酶（CYLD）的转录调控；通过 siCYLD、CYLD 回补、免疫共沉淀、蛋白降解通路干预及泛素化检测，评估 CYLD 对 FASN 蛋白稳定性及脂滴表型的调控作用。 结果 与shNC组相比，shZEB2组小鼠颅内肿瘤生长受抑制，生存期延长（P<0.05）。RNA-seq及通路富集分析提示差异基因富集于脂质代谢相关通路。shZEB2组细胞内脂滴相对面积分数降低（P<0.001）。ZEB2敲低组中饱和脂肪酸相关储存脂质减少，而含多不饱和脂肪酸链的磷脂分子增加。FRAP实验显示ZEB2敲低组膜荧光恢复率升高（P<0.0001），ZEB2敲低下调脂肪酸合成关键酶FASN，过表达FASN可逆转ZEB2敲低导致的脂滴减少。CYLD是潜在的关键中间分子；实验证实ZEB2可直接结合并激活CYLD启动子（P<0.0001）。敲低CYLD显著降低FASN蛋白水平，且过表达CYLD可逆转shZEB2引起的FASN下调及脂滴减少表型。CYLD 与 FASN 存在共定位并可形成蛋白复合物；MG132 可部分恢复 ZEB2 敲低背景下 FASN 蛋白水平，且 CYLD 过表达降低 FASN 泛素化水平，提示 CYLD 至少部分通过抑制泛素化相关降解维持 FASN 蛋白稳定性。 结论 ZEB2敲低可抑制GBM颅内肿瘤生长并延长生存，降低脂滴积累并伴随脂质谱重排及膜流动性增加。ZEB2-CYLD-FASN 轴通过连接转录调控、蛋白稳态与脂质合成重编程促进 GBM 进展。

Abstract

Objective To investigate the role of ZEB2 in lipid metabolic reprogramming of glioblastoma and its mechanism for promoting glioblastoma progression. Methods Mouse models bearing orthotopic intracranial xenografts derived from LN-229 and GBM007 cells with stable ZEB2 knockdown were used to assess tumor growth and mouse survival.. Lipid droplet accumulation, lipid composition, and membrane fluidity in the cells with ZEB2 knockdown were examined using Nile Red staining, transmission electron microscopy, untargeted lipidomics, and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). The candidate mediators were screened by integrating RNA sequencing, fatty acid synthase (FASN) immunoprecipitation-mass spectrometry, and BioGRID interaction data. Promoter luciferase assays, ChIP-qPCR, promoter mutagenesis, co-immunoprecipitation, protein degradation pathway inhibition, and ubiquitination assays were performed to investigate the regulatory role of the ZEB2-CYLD-FASN axis. Results ZEB2 knockdown significantly suppressed intracranial glioblastoma growth and prolonged mouse survival. Glioblastoma cells with ZEB2 silencing showed reduced lipid droplet accumulation, decreased saturated fatty acid-associated storage lipids, increased phospholipid species containing polyunsaturated fatty acyl chains, and enhanced membrane fluidity. Mechanistically, ZEB2 knockdown reduced FASN protein abundance, whereas FASN restoration reversed lipid droplet reduction induced by ZEB2 silencing. Multi-omics screening identified CYLD as a key intermediate. ZEB2 was capable of directly binding to and activating the CYLD promoter. CYLD knockdown decreased FASN protein levels, whereas CYLD restoration recovered FASN abundance and lipid droplet formation. CYLD was co-localized and interacted with FASN. MG132 partially restored FASN abundance under ZEB2 knockdown, and CYLD overexpression reduced FASN ubiquitination. Conclusion ZEB2 promotes glioblastoma lipid metabolic reprogramming and tumor progression by transcriptionally activating CYLD, which maintains FASN protein stability at least in part through ubiquitination-associated regulation.

Graphical abstract

关键词

胶质母细胞瘤 / 锌指E盒结合同源盒2 / 脂质代谢 / 脂肪酸合成酶 / 去泛素化酶

Key words

glioblastoma / zinc finger E-box binding homeobox 2 / lipid metabolism / fatty acid synthase / CYLD

胶质母细胞瘤（GBM）侵袭性强、复发率高^［1］。除遗传异质性外^［2］，越来越多研究表明，GBM细胞可通过代谢重编程在缺氧与营养受限等压力下维持生长与侵袭，并可以通过代谢产物维持自身的恶性表型^［3］。

转录因子ZEB2是胶质瘤进展相关的重要分子^［4］。我们课题组前期研究已经报道，ZEB2作为不良生物标志物，可通过调控细胞周期、凋亡及EMT相关过程促进胶质瘤细胞增殖、迁移与侵袭^［5］；随后进一步证实ZEB2可通过ZEB2/miR-637/HMGA1信号轴促进胶质瘤细胞迁移与侵袭，提示ZEB2在胶质瘤恶性表型中具有关键驱动作用^［6］。近年来，跨肿瘤研究亦提示ZEB2可能参与代谢应激适应：在乳腺癌中，ZEB2与脂代谢关键酶ACSL4形成正反馈环路，推动代谢重塑以支持转移相关能量需求^［7］；而在结直肠癌中，谷氨酰胺缺乏可诱导包括ZEB2在内的EMT转录因子上调并促进侵袭表型，提示ZEB2可能参与代谢重编程过程^［8］。

尽管已有证据提示ZEB2与代谢重编程存在关联^{［7， 8］}，但在GBM中，ZEB2主要关联哪一类代谢改变、以及其具体分子机制是什么，仍缺乏系统阐明。本研究旨在系统评估ZEB2对GBM代谢调控特征及其潜在分子机制，通过体内外模型结合组学筛选与关键节点的功能与机制验证，明确ZEB2相关代谢通路特征及其具体机制，从而为理解GBM恶性进展的代谢适应基础提供新的转录调控视角，并为代谢靶向干预及联合治疗策略提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

Nile Red 脂滴染料（Beyotime）；蛋白裂解液 RIPA（Beyotime）；BCA 蛋白定量试剂盒（Yeasen）；细胞培养基及胎牛血清（Gibco）；siRNA（CYLD）（RiboBio）；ZEB2/FASN 敲低与过表达相关载体及双荧光素酶报告载体（唯誉智合）；转染试剂 Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific）；染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒（Millipore）；Protein A/G磁珠（Thermo Fisher Scientific）；双荧光素酶检测试剂盒（Vazyme）。Western blotting 一抗：ZEB2（ABclonal，1∶400）、FASN（ABclonal，1∶1000）、CYLD（ABclonal，1∶400）、β-actin（CST，1∶1000）、α-Tubulin（CST，1∶1000）。免疫组化一抗：ZEB2（ABclonal，1∶100）。免疫荧光一抗：ZEB2（ABclonal，1∶50）、FASN（proteintech，1∶400），二抗为山羊抗兔/抗鼠 IgG（Abcam，1∶1000），含DAPI封片剂（abcam），MG132、3-MA（MCE）；抗Flag、抗HA、抗Myc抗体（均1∶1000）；Ub-myc、K48-myc、K63-myc、FASN-Flag、CYLD-HA及ZEB2-HA质粒由唯誉智合构建。其他试剂均按说明书操作。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和慢病毒转染

人胶质母细胞瘤细胞系 LN-229、T98G、U87 购自中科院细胞库。患者来源的原代胶质瘤细胞株GBM007从手术切除标本中建立，本实验已获得南方医科大学南方医院伦理委员会许可（伦理批号：NFEC-BPE-219），并依照1964年《赫尔辛基宣言》制定的伦理准则进行实验，标本来源于南方医院神经外科南方胶质瘤标本库，所有患者样本均取得书面知情同意。所有细胞均在含10% FBS及1%青链霉素的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。针对ZEB2的shRNA及阴性对照shNC克隆至慢病毒载体。细胞接种于6孔板，待融合度达40%~50%时加入慢病毒。感染24 h后更换新鲜培养基，48 h 后加入Puromycin（2 μg/mL）连续筛选7~10 d，通过Western blotting验证敲低效率后用于后续实验。对于回补实验，将FASN或CYLD过表达质粒（FASN-Flag/CYLD-Flag）及空载体使用Lipofectamine 3000转染至稳转株中，48 h后检测。

1.2.2 颅内移植瘤模型

5周龄雄性BALB/c裸鼠（研成生物）麻醉固定于立体定位仪。将1×10⁵携带shNC或shZEB2的GBM007或LN-229细胞重悬于4 μL PBS中，注射至右侧纹状体（坐标：前囟右侧2.0 mm，前0.5 mm，深3.0 mm）。记录小鼠每日生存状态，绘制Kaplan-Meier生存曲线。濒死小鼠处死灌注取脑，经福尔马林固定、石蜡包埋后进行H&E染色以观察肿瘤形态。本实验的设计与实施均受到南方医科大学南方医院动物管理伦理委员会的监督（伦理批号：IACUC-LAC-20250215-002）。

1.2.3 转录组测序与生物信息学分析

总 RNA 使用 Trizol 试剂提取，通过 NanoDrop 和 Agilent 2100 生物分析仪检测 RNA 的纯度与完整性。构建好的 cDNA 文库基于 Illumina NovaSeq 6000 平台进行测序（诺禾致源，北京）。原始测序数据（Raw reads）首先经过 fastp 软件 处理，去除接头序列（Adapter）、含 N 比例过高及低质量的 Reads，以获得高质量的 Clean reads。随后，使用 HISAT2 软件将 Clean reads 比对至人类参考基因组（GRCh38/hg38）。基因表达水平定量采用 featureCounts 软件计算每个基因的 Read Counts，差异表达分析在 R 语言环境中采用 DESeq2 包进行。为了控制假阳性率，P值通过Benjamini-Hochberg 方法进行多重检验校正（FDR/adjusted P-value）。差异表达基因（DEGs）的筛选阈值设定为 |log2FoldChange|≥2且FDR<0.05。GO功能注释及KEGG通路富集分析使用 clusterProfiler 包完成。此外，为了验证临床相关性，利用TCGA-GBM数据集分析了ZEB2与CYLD mRNA表达的Pearson相关性。为了筛选关键下游分子，将RNA-seq差异基因列表与 BioGRID 数据库中 FASN 的相互作用蛋白列表及本研究 FASN-IP 质谱结果取交集。

1.2.4 非靶向脂质组学分析

收集各组细胞样本（n=3），使用 PBS 清洗后，采用 BCA 蛋白定量试剂盒 测定样本总蛋白浓度，并以此进行等量归一化，确保各样本起始量一致。采用甲基叔丁基醚（MTBE）法提取细胞总脂质。向提取物中加入商业化脂质内标混合物后，使用配备 C18 色谱柱的 UHPLC-MS/MS 系统进行全谱数据采集。为监控仪器稳定性与批次效应，实验过程中每间隔5个样本插入1个由所有实验样本等量混合而成的质量控制（QC）样本。原始质谱数据导入 LipidSearch （v4.2） 软件进行峰识别、峰对齐及脂质鉴定。数据预处理包括：基于内标峰面积进行归一化；利用 QC 样本数据监控并校正批次内的信号漂移。差异脂质筛选采用多维统计分析：利用 OPLS-DA（正交偏最小二乘判别分析） 模型计算变量投影重要性（VIP），以最大化组间区分度；结合 Student's t-test 计算P值。差异脂质的筛选标准设定为 VIP>1.0 且P<0.05。最终数据按脂质类别及脂肪酸链饱和度进行分类汇总及热图可视化。

1.2.5 脂滴染色

细胞爬片经4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤后加入Nile Red工作液（1μg/mL）室温避光孵育20 min，DAPI复染细胞核。使用激光共聚焦显微镜（Leica）采集图像。使用ImageJ软件定量分析脂滴面积分数（脂滴面积/细胞面积）及单细胞脂滴荧光强度。

1.2.6 透射电镜

细胞经2.5%戊二醛及1%锇酸双重固定，梯度丙酮脱水，Epon 812树脂包埋。超薄切片（70 nm）经醋酸铀-柠檬酸铅双染后，在透射电子显微镜（Hitachi）下观察脂滴超微结构并拍照。

1.2.7 膜流动性检测

细胞接种于共聚焦专用皿，使用膜探针DiI标记细胞膜。在共聚焦显微镜FRAP模块下，选定细胞膜感兴趣区域（ROI）进行高功率激光漂白，并连续记录荧光恢复过程。荧光恢复率（Recovery rate）计算公式为：R=（F_End-F₀）/（F_Pre-F₀）×100%。

1.2.8 免疫印迹

细胞经RIPA裂解提取总蛋白，BCA定量后行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭后，孵育一抗（4 ℃过夜）及二抗（室温1 h），ECL化学发光显影。

1.2.9 免疫共沉淀、FASN-IP质谱及蛋白互作验证

采用含蛋白酶抑制剂的非变性裂解液温和裂解细胞。收集细胞裂解液，加入抗FASN抗体与 Protein A/G 磁珠于4 ℃孵育过夜。洗涤后进行磁珠上酶解。加入DTT还原及IAA烷基化，37 ℃酶解过夜。肽段经C18脱盐柱纯化、冷冻干燥后重溶于0.1%甲酸中。使用Q Exactive HF-X质谱仪结合Nano-LC液相系统进行检测。原始数据使用MaxQuant软件检索UniProt人类蛋白质数据库，筛选标准为FDR<1%，且仅保留至少包含2个唯一肽段的蛋白质作为FASN的潜在互作蛋白。

对于内源性免疫共沉淀实验，收集 LN-229、T98G 或GBM007细胞裂解液，加入抗FASN抗体、抗 CYLD 抗体或同型 IgG 对照抗体，于 4 ℃ 孵育过夜，随后加入 Protein A/G 磁珠继续孵育。充分洗涤后加入 SDS 上样缓冲液煮沸变性，通过 Western blotting 检测沉淀复合物中的FASN及CYLD。对于外源性免疫共沉淀实验，将 FASN-Flag、CYLD-HA 及相应空载体转染至 HEK-293T 细胞，转染 48 h 后收集细胞裂解液，使用抗 Flag 抗体进行免疫沉淀，并通过Western blotting 检测 HA、Flag 及相关蛋白表达。IgG或空载体作为阴性对照。

1.2.10 染色质免疫沉淀

按照试剂盒说明书操作。细胞经1%甲醛交联，甘氨酸终止，裂解后超声打断染色质。加入抗ZEB2抗体或正常IgG进行免疫沉淀。解交联并纯化DNA后，针对CYLD启动子预测结合位点设计引物进行qPCR分析。结果以%Input或Fold Enrichment表示。

ChIP-qPCR-BS-F：TGTGCGGTTCGGAGGCGGGG

ChIP-qPCR-BS-R：CACCTGCCCCGCCTCCGAA

1.2.11 双荧光素酶报告基因实验

构建包含CYLD启动子野生型（WT）或E-box突变型（MUT）序列的pGL3-Basic报告载体。将其与ZEB2过表达质粒及内参质粒（pRL-TK）共转染至293T或GBM细胞中。48 h后检测萤火虫及海肾荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性比值。

1.2.12 实时荧光定量PCR

使用Trizol提取总RNA，逆转录合成cDNA。使用SYBR Green试剂盒在实时荧光定量PCR仪上进行扩增。以GAPDH为内参，计算mRNA相对表达量。

1.2.13 免疫荧光染色

将对数生长期的细胞接种于预先铺有无菌盖玻片的24孔板中，待细胞融合度达50%~60%时终止培养。细胞经PBS清洗后，使用4%多聚甲醛室温固定15 min，随后加入0.3% Triton X-100透化液室温处理20 min以破膜。PBS洗涤3次后，使用5%BSA室温封闭1 h以阻断非特异性结合。吸去封闭液，分别加入兔抗ZEB2抗体（1∶50）及鼠抗FASN抗体（1∶400），于4度湿盒中孵育过夜。次日复温后，加入对应种属的Alexa Fluor 488及Alexa Fluor 594标记的荧光二抗（1∶1000），室温避光孵育1 h。最后使用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片。使用激光共聚焦显微镜（Leica）在相同激发参数下采集图像。使用ImageJ软件对感兴趣区域（ROI）的平均荧光强度（MFI）进行定量分析，并评估ZEB2与FASN的共定位情况。CYLD 与 FASN 共定位实验中分别加入抗 CYLD 抗体及抗 FASN 抗体，其余步骤同上。

1.2.14 FASN截短体构建及结合区域分析

为初步定位 CYLD 与 FASN 的潜在结合区域，构建带有 Flag 标签的 FASN 全长及截短体表达质粒。FASN 全长记为 WT，截短体分别包括A段（1~436 aa）、B段（437~992 aa）、C 段（993~1151 aa）、D 段（1152~1704 aa）及 E 段（1705~2391 aa）。将 FASN 全长或各截短体质粒分别与 CYLD-HA质粒共转染至 HEK-293T 细胞。转染 48 h 后收集细胞裂解液，使用抗Flag抗体进行免疫沉淀，并通过Western blotting检测HA信号以评估 CYLD 与不同FASN片段的结合情况。总细胞裂解液作为输入对照，用于检测各质粒表达水平。

1.2.15 蛋白降解通路干预实验

将构建好的 LN-229 shNC 或 shZEB2 稳转细胞接种于6 孔板，待细胞融合度达 50%~60% 时进行药物处理。自噬抑制组加入3-MA（5 mmol/L）处理24 h；蛋白酶体抑制组加入 MG132（10 μmol/L）处理6 h；对照组加入等体积 DMSO。处理结束后收集细胞总蛋白，按照免疫印迹实验方法检测 FASN、ZEB2及Tubulin 表达水平。

1.2.16 泛素化检测实验

为检测ZEB2或CYLD对 FASN 泛素化水平的影响，将FASN-Flag、Ub-myc及 ZEB2-HA或CYLD-HA质粒按实验分组共转染至 HEK-293T细胞。转染48 h后收集细胞，并采用含蛋白酶抑制剂的非变性裂解液裂解。使用抗 Flag 抗体免疫沉淀FASN-Flag，充分洗涤后加入SDS上样缓冲液煮沸变性，通过Western blotting使用抗Myc抗体检测 FASN 的泛素化水平，同时检测 Flag、ZEB2、CYLD 及 Tubulin 作为表达和上样对照。为进一步分析泛素链类型，将K48-myc或K63-myc泛素质粒与FASN-Flag 及 CYLD-HA共转染至HEK-293T细胞，并按上述方法进行免疫沉淀及Western blotting检测。

1.2.17 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计作图。两组间比较采用Student's t-test，多组间比较采用One-way ANOVA并进行Tukey事后检验。生存分析采用Log-rank检验。相关性分析采用Pearson相关系数。所有实验均独立重复至少3次，数据以均数±标准差表示。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 ZEB2敲低抑制GBM的进展并影响脂质代谢。

裸鼠原位移植瘤模型显示，与shNC组比较，shZEB2#1与shZEB2#2组肿瘤负荷降低，其中shZEB2#2组下降更为明显（P<0.05，图1A、B）。生存分析显示，LN-229与GBM007原位模型中，shZEB2组小鼠生存期均较shNC组延长（log-rank检验，P<0.05，图1C）。对shNC与shZEB2的LN-229细胞进行RNA-seq，差异基因富集分析提示，ZEB2敲低相关差异基因主要富集于信号转导、脂质代谢等生物学过程/通路（图1D、E）。

2.2 ZEB2敲低减少GBM细胞脂滴积累

Nile Red染色显示，与shNC组比较，LN-229与GBM007细胞中shZEB2#1及shZEB2#2组脂滴荧光信号明显减弱（图2A）。相对脂滴面积分数量化结果显示，shZEB2#1与shZEB2#2组相对脂滴面积分数较shNC组降低（均P<0.0001，图2B、C）。透射电镜进一步观察到，与shNC组比较，shZEB2组细胞内脂滴结构减少（图2D），其脂滴面积分数定量在LN-229与GBM007中均下降（P<0.0001、P<0.001，图2E、F）。

2.3 ZEB2敲低重塑脂质谱并增加细胞膜流动性

非靶向脂质组学分析显示，与 shNC 组比较，shZEB2 组中 TG、SAFA-TG及TG16：0 等饱和脂肪酸相关储存脂质类别减少，而 PUFA-PC、PUFA-LCFA-PC、PUFA-LCFA-DG、PC 18：2、PE 18：3 和 PC 18：3 等 PUFA 相关磷脂或不饱和脂质类别增加（图3A）。FRAP检测显示，shZEB2#1与shZEB2#2组漂白后荧光恢复速率较shNC组加快，荧光恢复率升高（P<0.0001，图3B、C）。

2.4 ZEB2调控FASN表达进而介导脂滴形成

Western blotting结果显示，在LN-229与GBM007细胞中敲低ZEB2（shZEB2#1、shZEB2#2）均可显著下调FASN蛋白水平（图4A）；在U87细胞中过表达ZEB2（ZEB2-HA）则可上调FASN蛋白表达（图4B）。免疫荧光结果显示，LN-229细胞中shZEB2组FASN荧光信号明显降低（图4C），其相对整合荧光强度定量下降（P<0.0001，图4D）。功能验证方面，shFASN组Nile Red脂滴荧光明显减弱；在shZEB2背景下回补FASN（shZEB2+FASNoe）可显著恢复LN-229与GBM007细胞的脂滴荧光信号（图4E），其相对脂滴面积分数较shZEB2+Vector组升高，并与shNC组差异无统计学意义（P>0.05，图4F、G）。此外，CPTAC队列（n=93）分析显示FASN的RNA与蛋白表达相关性有限且差异未达统计学意义（r=0.174，P=0.101，图4H）。

2.5 ZEB2转录激活CYLD并参与FASN调控

RNA-seq 差异基因与 FASN 互作信息（BioGRID）及FASN-IP相关蛋白取交集，获得候选分子CYLD等（图5A）。TCGA-GBM 数据库分析显示，ZEB2 与 CYLD mRNA 表达呈正相关（r=0.33，P=2.2×10^-5），而 FASN与CYLD相关性不显著（P=0.88，图5B）。qRT-PCR结果显示，与shNC组比较，shZEB2组CYLD mRNA水平下降，而 FASN mRNA水平未见明显同步下降（图5C）。Western blotting显示，与 shNC 组比较，LN-229 与 GBM007 细胞中 shZEB2 组 CYLD 蛋白表达下调（图5D）。双荧光素酶报告实验显示，ZEB2 过表达可显著增强 CYLD 启动子活性（P<0.0001），而结合位点突变后该增强作用减弱（P<0.0001，图5E、F）。ChIP-qPCR 结果显示，ZEB2 在 CYLD 启动子区域存在显著富集（P<0.0001，图5G）。功能上，敲低 CYLD 可下调GBM007与LN-229细胞中FASN蛋白表达（图5H）；在 shZEB2 背景下回补 CYLD 可伴随 FASN 蛋白回升（图5I）。在 shFASN 背景下回补 FASN 时可观察到 CYLD 蛋白水平伴随上升。

2.6 CYLD 与 FASN 相互作用并影响 FASN 泛素化水平

免疫荧光结果显示，在LN-229、T98G 及 GBM007 细胞中，CYLD 与 FASN 信号主要分布于胞质区域，Merge 图及局部放大图可见二者存在共定位信号（图6A）。内源性免疫共沉淀结果显示，在GBM007与 T98G 细胞中，抗 FASN 抗体沉淀产物中可检测到 CYLD，抗 CYLD 抗体沉淀产物中亦可检测到 FASN，而 IgG 对照未见明显特异性条带（图6B）。为进一步观察 CYLD 与 FASN 的结合区域，构建了 FASN 全长及截短体质粒，包括 WT、A（1~436 aa）、B（437~992 aa）、C（993~1151 aa）、D（1152~1704 aa）及 E（1705~2391 aa）（图6C）。外源性免疫共沉淀结果显示，CYLD 可与全长 FASN 及部分 FASN 截短片段共同沉淀（图6D）。结合 FASN 蛋白结构示意图，提示CYLD与FASN的相互作用可能具有一定区域选择性（图6E）。蛋白降解通路干预实验显示，在 shZEB2 背景下 FASN 蛋白水平下降；与 DMSO 组相比，MG132 处理后 FASN 蛋白水平部分恢复，而 3-MA 处理后恢复不明显（图6F）。泛素化检测结果显示，ZEB2 过表达可降低 FASN 的泛素化信号；CYLD 过表达亦可降低 FASN 泛素化水平（图6G）。进一步检测不同泛素链类型显示，CYLD 过表达后 FASN相关K48及K63泛素化信号发生改变（图6G）。

3 讨论

GBM细胞长期处于缺氧、营养受限及治疗应激的生态位中^［9］，越来越多证据表明其恶性进展除遗传异质性外，还依赖代谢重编程提供的物质与能量支持^［3，10］。脂质代谢在其中尤为关键^［11］：一方面为细胞膜生物合成与信号脂质提供原料^［12］，另一方面通过LD储存与动员脂质以缓冲氧化与营养压力，从而增强肿瘤细胞生存与侵袭能力^［13］。本研究发现ZEB2敲低可抑制颅内肿瘤生长并延长生存，同时显著降低LD积累，并伴随脂质谱结构性重排及膜流动性升高。提出并验证了“ZEB2-CYLD-FASN”这一连接转录调控与脂质合成机制轴，为GBM脂质代谢适应提供了新的上游解释框架。

ZEB2作为EMT相关转录因子，既往在多肿瘤中被证明与侵袭、干性维持及治疗抵抗相关^{［5， 14］}，亦有研究提示其参与代谢应激适应^［7］，但其在GBM中是否以及如何驱动特定代谢通路仍缺乏系统阐释。本研究RNA-seq结果显示，ZEB2敲低后差异基因显著富集于脂质代谢相关通路；同时在细胞系与患者来源细胞中均可复现LD下降表型，提示ZEB2可能作为GBM脂质代谢网络的上游调控节点，这一点与以往多数从单一代谢酶或LD生成环节解释GBM代谢适应的研究形成互补：我们强调的是一个更上游、可统筹多条脂质通路的转录程序入口，从而有望解释不同模型与患者之间脂质代谢表型差异的来源。

同时，非靶向脂质组学显示，ZEB2 敲低后 GBM 细胞的脂质组成发生方向性重塑：以TG、SAFA-TG及 TG16∶0为代表的饱和脂肪酸相关储存脂质减少，而 PUFA-PC、PUFA-LCFA-PC、PC 18∶2、PE 18∶3 和 PC 18∶3 等含多不饱和脂肪酸链的脂质分子种增加。该变化与脂滴积累减少相一致，提示 ZEB2 敲低削弱了细胞对中性脂质的储存能力；同时，含多不饱和脂肪酸链的脂质分子增加，也提示膜脂酰基链组成发生改变。膜流动性由磷脂头基组成、脂肪酸链长度与不饱和程度、胆固醇含量以及不同膜脂分子间相互作用等多种因素共同塑造^［15］。在本研究中，SAFA 相关脂质下降、PUFA 相关分子种增加与 FRAP 荧光恢复率升高呈现出一致方向，提示 ZEB2 敲低后细胞膜脂环境可能向低饱和度、高动态性的状态转变。膜脂环境变化可影响脂筏相关受体复合体组装、膜蛋白内吞与回收、迁移黏附等膜相关过程^［16-18］，从而参与 GBM 细胞恶性表型调控。值得注意的是，PUFA 相关脂质增加在提高膜动态性的同时，也可能增强脂质过氧化敏感性，并改变细胞对治疗应激的耐受阈值^{［19，20］}。这些结果提示，ZEB2 相关脂质重塑可能涉及脂肪酸合成、去饱和、链延长及磷脂重塑等多个环节，SCD、FADS、ELOVL 及 LPCAT 等脂质代谢酶可能参与其中，其具体贡献仍有待进一步明确。因此，ZEB2 相关脂质重塑可能不仅反映脂滴储存变化，也为膜脂组成、受体信号和应激响应之间的关联提供了新的解释方向^［21］。

GBM细胞在缺氧与营养波动下可同时依赖外源摄取与内源合成维持脂质供给，FASN是内源新生脂肪酸合成的关键酶^［22］，已被广泛报道与多肿瘤的生长优势、治疗抵抗及不良预后相关^［23］。FASN驱动的从头合成可为TG合成与LD形成提供底物^［24］，并为膜磷脂更新提供脂肪酸来源^［25］。本研究通过敲低/过表达与挽救实验证实：FASN是ZEB2调控LD形成的重要下游效应分子，回补FASN可显著逆转ZEB2敲低导致的脂滴减少，提示ZEB2–FASN轴可能是连接ZEB2与GBM脂质表型的重要桥梁。

代谢关键酶的表达并不必然与mRNA线性对应^［26］，蛋白稳态调控在肿瘤代谢网络中越来越受到关注，多项研究提示FASN的蛋白水平与多种泛素化调控途径相关^{［27， 28］}。与此一致的是，我们对CPTAC GBM队列的分析发现FASN的RNA与蛋白丰度相关性较弱，提示其蛋白表达可能存在显著的转录后调控层级。基于上述背景，我们采用RNA-seq差异基因与FASN互作/蛋白组学信息的交集策略进行筛选，从而在机制上寻找能够连接ZEB2转录程序与FASN蛋白及脂质表型的中间节点。

在此策略下，我们锁定CYLD作为关键候选，并证明ZEB2可直接结合并激活CYLD启动子；敲低CYLD可降低FASN蛋白；在shZEB2背景下回补CYLD可伴随FASN回升并部分恢复脂滴表型。CYLD经典上为去泛素化酶^［29］，参与NF-κB等信号调控且呈情境依赖作用^［30］。本研究进一步显示，CYLD 与 FASN 在 GBM 细胞中存在共定位并可形成蛋白复合物；MG132 可部分恢复 shZEB2 背景下的 FASN 蛋白水平，而 CYLD 过表达可降低 FASN 泛素化信号。结合TCGA-GBM 中 CYLD 与 FASN mRNA 相关性不显著的结果，这些数据支持 CYLD 主要在蛋白稳态层面参与 FASN 调控。总体上，本研究提出 ZEB2 可转录激活 CYLD，CYLD 进一步通过影响 FASN 泛素化相关降解维持 FASN 蛋白水平，从而参与 GBM 脂质代谢重编程，此外，FASN 回补后 CYLD 蛋白水平升高仍属于初步观察，更可能与脂质合成状态改变后的适应性反馈有关，其具体机制仍需进一步研究。

从转化意义看，转录因子本身通常较难直接成药^［31］，而其下游代谢节点具备更高的干预可行性。FASN抑制剂及脂质代谢干预在多肿瘤中已有探索，并被认为可能与放化疗或靶向治疗产生协同^{［32， 33］}。但不同肿瘤亚型中疗效存在差异，提示其代谢依赖性具有显著异质性^［34］，单纯泛化式脂质代谢抑制未必获得稳定获益^［35］。本研究提示，当GBM存在ZEB2高表达驱动的脂质合成与脂滴积累时，靶向FASN或干预CYLD-FASN相关通路可能成为削弱脂质代谢适应、抑制肿瘤进展的潜在策略。为后续开展生物标志物指导的代谢干预与联合治疗提供了患者分层依据与可检验的研究假说。

综上所述，本研究从机制层面揭示了ZEB2在GBM脂质代谢重编程中的重要作用。然而，本研究仍有局限：其一，需要在患者临床样本中进一步验证ZEB2/CYLD/FASN与LD表型及预后、治疗反应的关系；其二，本研究进一步显示 CYLD 可与 FASN 相互作用，并影响 FASN 的泛素化修饰及蛋白稳定性，但 CYLD 维持 FASN 蛋白水平的精确分子细节仍有待阐明。尤其是该过程是否依赖 CYLD 的去泛素化酶活性、主要涉及何种泛素链修饰，以及 FASN 上哪些关键位点参与调控，仍需在后续研究中通过酶活缺失突变、蛋白半衰期检测和泛素化位点突变等方式进一步验证。总体而言，本研究强调了ZEB2在GBM代谢重编程中的调控潜力，为GBM恶性进展的代谢适应机制提供了新的解释与潜在干预靶点。

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