温阳化浊通络方通过调控Sema3A/Nrp1通路促进系统性硬化病真皮微血管内皮细胞血管生成

Wenyang Huazhuo Tongluo Formula promotes angiogenesis in systemic sclerosis dermal microvascular endothelial cells by regulating the Sema3A/Nrp1 pathway

摘要

目的 探讨温阳化浊通络方（WHT）对系统性硬化病（SSc）真皮微血管内皮细胞血管生成的促进作用及潜在机制。 方法 Wistar大鼠分别灌胃15、30、60 g/kg温阳化浊通络方及生理盐水制备低、中、高浓度含药血清和空白血清。体外培养人真皮微血管内皮细胞（HDMEC），经SSc患者血清处理建立SSc细胞模型，分为对照组、模型组、温阳化浊通络方低、中、高剂量组和EGCG组（Sema3A抑制剂），CCK-8检测细胞增殖，划痕检测细胞迁移，Matrigel体外成管实验检测血管生成，qRT-PCR及Western blotting检测Sema3A、Nrp1、VEGFA、CD31、α-SMA mRNA和蛋白表达水平。 结果 与对照组相比，模型组细胞增殖率和迁移率下降，α-SMA、Sema3A、VEGFA蛋白和mRNA表达水平增加，CD31及Nrp1蛋白和mRNA表达水平降低，血管生成受到抑制（P<0.05）；与模型组相比，低、中、高剂量含药血清组及EGCG组均可提高细胞存活率和迁移率，降低α-SMA、Sema3A、VEGFA蛋白和mRNA表达水平，促进CD31及Nrp1蛋白和mRNA表达水平，增强血管生成（P<0.05）。 结论 温阳化浊通络方可能通过调节Sema3A/Nrp1信号通路促进SSc HDMEC细胞增殖、迁移和血管生成。

Abstract

Objective To investigate the effect of Wenyang Huazhuo Tongluo Formula (WHT) for promoting angiogenesis in systemic sclerosis (SSc) dermal microvascular endothelial cells and its possible mechanism. Methods Wistar rats were gavaged with 15, 30, or 60 g/kg WHT and normal saline for 7 consecutive days to prepare low-, medium-, or high-concentration WHT-medicated sera and blank serum, respectively. Human dermal microvascular endothelial cells (HDMECs) in routine culture were treated with the sera from SSc patients to establish an SSc cell model. The cells were treated with the blank serum, low-, medium-, or high-concentration WHT-medicated sera, or blank serum combined with EGCG (a Sema3A inhibitor). The changes in cell proliferation, migration and angiogenesis were assessed using CCK-8 assay, wound-healing assay and Matrigel tube formation assay, and the mRNA and protein expressions of Sema3A, Nrp1, VEGFA, CD31 and α-SMA were analyzed using qRT-PCR and Western blotting. Results HDMECs treated with the serum from SSc patients exhibited significantly reduced cell proliferation and migration rates, increased α-SMA, Sema3A and VEGFA protein and mRNA expression levels, decreased CD31 and Nrp1 protein and mRNA expression levels, and suppressed angiogenesis. In SSc serum-induced cells, treatments with low-, medium-, or high-concentration WHT-medicated sera or EGCG all significantly improved cell survival and migration rates, reduced α-SMA, Sema3A and VEGFA protein and mRNA expression levels, enhanced CD31 and Nrp1 protein and mRNA expressions, and promoted angiogenesis of the cells. Conclusion WHT promotes angiogenesis of SSc sera-induced HDMECs by modulating the Sema3A/Nrp1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

系统性硬化病 / 温阳化浊通络方 / Sema3A/Nrp1 / 血管生成

Key words

systemic sclerosis / Wenyang Huazhuo Tongluo Formula / Sema3A/Nrp1 / angiogenesis

系统性硬化病（SSc）是一种以血管病变、自身免疫异常和皮肤及内脏的纤维化为特征的自身免疫性结缔组织疾病，其血管病变主要包括雷诺现象和肺动脉高压^［1］。SSc发病机制复杂，其血管病变的起点被认为是微血管系统（特别是小动脉和毛细血管）损伤导致的内皮细胞激活^{［2， 3］}。血管损伤后，机体的正常反应是启动修复机制，即血管生成。然而，在SSc中，微血管损伤活化的血管内皮细胞能够促进血管内皮细胞生长因子（VEGF）等促血管生成因子与抑血管生成因子失衡，导致血管生成异常^［4］。因此，早期修复SSc血管内皮损伤和恢复血管内皮的功能，有可能阻断和延缓SSc血管病变的发展^［5］。研究表明，信号素家族蛋白3A（Sema3A）及其受体神经纤毛蛋白-1（Nrp1）参与了免疫调节、细胞迁移和血管生成等多种生物过程，该通路的变化介导的血管生成参与了SSc等自身免疫性疾病血管系统的重塑，Sema3A/Nrp1轴有望成为SSc等疾病治疗的新靶点^{［6， 7］}。

前期研究基于SSc的病因病机，本课题组提出肺脾肾-皮毛相关理论，以黄芪桂枝五物汤等为基础创制温阳化浊通络方，其可通过改善SSc血管损伤发挥治疗作用^［8］。研究发现温阳化浊通络方能够降低SSc患者甲襞血管管攀形态、血液流态等，抑制肺微血管内皮细胞HIF-1α/Foxm1/smad3通路介导的EndoMT及小鼠肺内皮细胞HIF-1α/BNIP3/PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬减轻SSc肺微血管损伤^［9-12］，还能通过调节SSc小鼠皮肤组织Sema3A/Nrp1通路降低VEGFA的表达，改善SSc皮肤微血管损伤^［13］。但温阳化浊通络方调节Sema3A/Nrp1通路改善SSc皮肤微血管生成的作用机制还不清楚，因此，本研究通过建立SSc皮肤微血管体外模型，观察温阳化浊通络方对SSc血管生成的影响，探讨其治疗SSc的作用机制，为SSc及血管损伤相关疾病的防治提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞

SPF级7~8周龄Wistar雌性大鼠60只，体质量为220~250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司（SCXK （京） 2016-0011），饲养于南阳理工学院医学实验动物中心（SCXK （豫） 2020-0013），恒湿（50±10）%和恒温（23±2）℃，昼夜交替光照，自由饮水和摄食。所有动物实验操作和饲养均遵循实验动物福利及伦理要求，本研究通过南阳理工学院伦理委员会批准（伦理批号：南理工动伦审［2020］005号）。人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2 药物与试剂

温阳化浊通络组方药材黄芪、党参、桂枝、淫羊藿、积雪草、白芥子等购自河南省张仲景大药房。温阳化浊通络组方药材加10倍量水浸泡煎煮2次，收集合并2次煎煮液，浓缩得到相当于原生药2.8 g/mL的水提物。CCK-8试剂盒（GlpBio）；Matrigel基质胶（BD），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、ECL化学发光试剂盒（Thermo Fisher）；SYBR Green qPCR试剂盒（Roche）；UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒（上海生工生物）；Sema3A、VEGFA、CD31、α‑SMA兔多抗（Affinity），Nrp1鼠单抗（Santa Cruz），GAPDH鼠单抗（ABclonal），HRP标记羊抗兔、羊抗鼠二抗（KPL）；Sema3A抑制剂EGCG（MedChemExpress）。

1.1.3 仪器

NanoDrop 2000型核酸蛋白浓度分析仪、ABI ViiA7型实时荧光定量PCR仪（Thermo Fisher）；Ti-S倒置荧光显微镜（Nikon）；Mini-PROTEAN 3型蛋白电泳仪、Gel Doc XR+型凝胶成像分析系统（BIO-RAD）；GloMax 20/20 型发光检测仪（Promega）。

1.2 方法

1.2.1 温阳化浊通络方含药血清制备^［14］

60只Wistar大鼠随机分为空白组、温阳化浊通络方低、中、高剂量组，每组各15只，按人-大鼠体质量剂量折算后低、中、高剂量分别为成人临床等效剂量的1、2、4倍，各组分别按15、30、60 g /kg剂量每天灌胃给药，空白组灌胃20 mL/kg生理盐水，连续7 d，各组于末次灌胃给药后30 min，采血分离血清，过滤除菌，分装于无菌EP管200 μL/管置-80 ℃冰箱（冻融≤2次）保存备用。

1.2.2 细胞培养及分组处理

人真皮微血管内皮细胞（HDMEC），用内皮细胞完全培养基培养于37 ℃、5% CO₂环境下，待细胞融合度达90%左右传代，按实验目的加入不同的培养板。根据文献报道，利用含10% SSc患者血清［来源于5例就诊前1周无用药史的符合2013年美国风湿病学会（ACR）/欧洲风湿病联盟（EULAR）SSc诊断标准的女性患者，年龄43.6±11.1岁，病程4.6±2.1年］的细胞培养基处理HDMEC 24 h，构建SSc HDMEC模型^［15］。将细胞分为对照组（Control）、模型组（Model）、温阳化浊通络方含药血清低（WHT-L）、中（WHT-M）、高（WHT-H）剂量组和EGCG组，分别加入10%体积的空白血清、空白血清、温阳化浊通络方低、中、高浓度含药血清和空白血清+EGCG（10 μmol/L），继续培养48 h。

1.2.3 含药血清对HDMEC增殖的影响

接种 2×10⁴细胞到96孔板，按1.2.2分组及处理细胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，酶标仪检测吸光度值A_{450 nm}，计算细胞增殖率，细胞增殖率（%）=（A_实验组-A_空白孔）/（A_对照组-A_空白孔）。

1.2.4 含药血清对HDMEC迁移的影响

接种2×10⁵细胞到6孔板，按1.2.2建立SSc HDMEC模型及分组，待细胞铺满孔底达到90%以上，用无菌200 μL吸头在孔底划痕，吸弃培养基，PBS冲洗后换新鲜无血清培养基，分别加入10% 体积空白、低、中、高剂量含药血清和10 μmol/L EGCG，在0 h和24 h于4×10倍显微镜下观察细胞并拍照，采用Image J软件分析，比较各组划痕愈合面积计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h划痕面积-培养24 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。

1.2.5 含药血清对HDMEC血管生成的影响

提前取预冷基质胶50 μL/孔铺设于96孔板中，37 ℃静置2 h。消化收集各组经1.2.2分组及处理后的细胞，调整细胞密度为2×10⁵ /mL，取100 μL小心加入基质胶包被的96孔板中，继续培养4 h，使用显微镜观察并拍照记录随机视野中的完整血管腔环样结构，使用ImageJ软件对视野内的小管形成数量及长度进行测量。

1.2.6 含药血清对Sema3A、Nrp1、VEGFA、CD31、

α-SMA mRNA表达的影响 将1×10⁵细胞接种于12孔板，按1.2.2分组及处理细胞。收获细胞，按照试剂盒步骤提取细胞总RNA，测定RNA浓度，以1 μg总RNA作为模板反转录cDNA，按照SYBR Green说明书进行RT-qPCR反应检测Sema3A、Nrp1、VEGFA、CD31、α-SMA mRNA表达，引物见表1。按照ABI ViiA7 Real-Time PCR推荐条件扩增，以GAPDH作为内参，采用2^{- ΔΔCt}法计算基因的相对表达水平。

1.2.7 含药血清对 Sema3A、Nrp1、VEGFA、CD31、

α-SMA蛋白表达的影响 将2×10⁵细胞接种于6孔板，按1.2.2分组及处理细胞。收获细胞，加入100 µL蛋白裂解液裂解蛋白，BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白浓度；配置10 %聚丙烯酰胺凝胶，取40 μg待测蛋白进行电泳；转移至PVDF膜；5%牛血清白蛋白封闭；分别加入Sema3A（1∶1000）、Nrp1（1∶1000）、VEGFA（1∶1000）、CD31（1∶1000）、α-SMA（1∶1000）一抗孵育漂洗；分别加入对应HRP标记兔、鼠二抗（1∶10 000），室温孵育漂洗；ECL化学发光试剂曝光并拍照，使用Image J软件进行灰度分析，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值 /GAPDH蛋白条带灰度值。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 9软件进行数据分析处理，所有数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，满足正态分布且方差齐时，两组间比较采用LSD-t检验，方差不齐或不服从正态分布的用Dunnetts T₃检验，所有实验均独立重复3次，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 温阳化浊通络方含药血清对HDMEC增殖的影响

与对照组相比，模型组HDMEC细胞增殖受到抑制（P<0.01）；与模型组相比，随着含药血清浓度的增加，HDMEC细胞的增殖率也随之升高，温阳化浊通络方含药血清低、中、高剂量组及EGCG组升高HDMEC细胞的增殖率（P<0.05），促进细胞增殖（图1）。

2.2 温阳化浊通络方含药血清对HDMEC迁移的影响

与对照组相比，模型组HDMEC细胞24 h迁移率降低（P<0.01）；与模型组相比，温阳化浊通络方含药血清低、中、高剂量组促进细胞迁移率（P<0.05），EGCG组迁移率显著升高（P<0.01，图2）。

2.3 温阳化浊通络方含药血清促进HDMEC血管生成

与对照组相比，模型组HDMEC细胞小管形成数量及长度均显著降低（P<0.01）；与模型组相比，低、中、高剂量含药血清组细胞小管形成数量及长度均升高（P<0.05），EGCG组细胞小管形成数量及长度显著升高（P<0.01，图3）。

2.4 温阳化浊通络方含药血清对CD31、α-SMA蛋白表达影响

与对照组相比，模型组HDMEC细胞CD31蛋白表达下降（P<0.05），α-SMA蛋白表达增加（P<0.05）；与模型组相比，WHT低、中、高剂量组CD31蛋白表达增强（P<0.05），α-SMA蛋白表达减弱，WHT中、高剂量组差异具有显著性（P<0.05），EGCG组CD31蛋白表达显著升高（P<0.01）、α-SMA蛋白表达下降（P<0.01，图4）。

2.5 温阳化浊通络方含药血清对 Sema3A、Nrp1、VEGFA、CD31、α-SMA mRNA表达影响

与对照组相比，模型组HDMEC细胞CD31、Nrp1 mRNA表达水平降低（P<0.01），α-SMA、Sema3A、VEGFA mRNA表达水平升高（P<0.01）；与模型组相比，WHT低、中、高剂量含药血清组CD31、Nrp1 mRNA表达水平上升（P<0.01），α‑SMA、Sema3A、VEGFA mRNA表达水平降低（P<0.05），EGCG组CD31、Nrp1 mRNA表达水平显著升高（P<0.01），α-SMA、Sema3A、VEGFA mRNA表达水平显著下降（P<0.01，图5）。

2.6 温阳化浊通络方含药血清对Sema3A、Nrp1、VEGFA蛋白表达影响

与对照组相比，模型组HDMEC细胞Sema3A、VEGFA蛋白表达增加（P<0.05），Nrp1蛋白表达下降（P<0.05）；与模型组相比，WHT低、中、高剂量组Sema3A、VEGFA蛋白表达降低，WHT高剂量组Sema3A蛋白差异具有显著性（P<0.05），WHT中、高剂量组VEGFA蛋白差异具有显著性（P<0.05），Nrp1蛋白表达增强，WHT高剂量组Nrp1蛋白差异具有显著性（P<0.05），EGCG组Sema3A、VEGFA蛋白表达下降（P<0.01），Nrp1蛋白表达显著升高（P<0.01，图6）。

3 讨论

组织受到损伤时，会释放一系列的促血管生成信号（尤其是VEGF），激活内皮细胞内的复杂信号通路，分泌蛋白酶降解基底膜和细胞外基质，内皮细胞增殖和迁移形成新的管腔^［16］。SSc早期阶段的皮肤存在血管损伤和重塑，内皮细胞血管生成信号转导通路的异常是导致SSc患者血管生成紊乱的重要因素，而皮肤微血管内皮细胞的增殖和迁移能力在皮肤血管损伤后的血管生成过程中发挥关键作用^［17］。CD31作为血管内皮细胞特异性标志物，其表达水平及定位直接反映血管生成及血管内皮屏障完整性，血管受损时，CD31相关的信号通路被激活，促进内皮细胞的修复和屏障功能的恢复^［18］。α-SMA是肌成纤维细胞的标志性蛋白，正常内皮细胞不表达α-SMA，内皮细胞受到病理刺激，失去其特异性标志物CD31，获得间质细胞特征如α-SMA，发生内皮-间质转化，内皮细胞转化为具有收缩和分泌功能的肌成纤维样细胞，引起内皮屏障功能障碍，导致血管壁增厚、管腔狭窄，加重血管病变^{［19， 20］}。SSc患者皮肤及博来霉素诱导的SSc小鼠模型的真皮微血管中检测到同时表达α-SMA与CD31的内皮细胞，分离自SSc患者HDMEC表现出纺锤状形态且同时表达内皮细胞和肌成纤维细胞标志物，并具备收缩能力；当H-MVEC暴露于SSc患者血清时，可呈现肌成纤维细胞样形态并获得收缩表型，下调CD31表达及上调α-SMA表达^［21-23］。多项研究表明，SSc患者来源的血清可显著下调HDMEC细胞CD31表达，抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成^{［15， 24， 25］}。因此，为了在体外模拟SSc病理状态的血管损伤，本研究通过使用SSc患者血清处理HDMEC细胞建立SSc-HDMEC细胞模型，结果显示SSc-HDMEC的增殖、迁移和血管生成受到显著抑制，CD31下调表达，α-SMA上调表达，表明SSc-HDMEC细胞模型成功模拟SSc内皮细胞功能异常。温阳化浊通络方处理后显著促进SSc-HDMEC细胞的增殖、迁移和血管生成，促进CD31表达，抑制α-SMA表达，提示温阳化浊通络方可能通过改善内皮细胞功能、抑制内皮-间质转化来促进血管生成，缓解SSc血管病变。

Sema3A/Nrp1途径的异常调节与SSc血管病变密切相关，Sema3A/Nrp1信号轴介导的血管生成可能是SSc治疗的潜在靶点。Sema3A通过与VEGFA的共受体Nrp1竞争结合从而抑制内皮细胞增殖和迁移，起到抗血管生成作用^{［26， 27］}。研究表明Sema3A在SSc患者血清中的表达有较大差异。Olewiczgawlik等^［28］发现SSc患者血清中高表达Sema3A，其可能与新生血管生成导致的SSc血管生成紊乱有关。然而，Romano等^［24］的研究表明，SSc患者血清Sema3A水平略微低于健康对照，但差异并不显著，SSc患者皮肤组织Sema3A水平略微高于健康对照，差异同样不显著。Kayaalp等^［29］发现SSc患者血清Sema3A水平显著低于健康对照，具有主要血管病变表现的SSc患者Sema3A水平显著低于不具有主要血管病变表现的SSc患者。本研究发现模型组HDMEC高表达Sema3A，与上述研究结果（血清或组织）不太一致，可能与本研究采用的细胞模型、SSc疾病异质性及检测方法的不同等有关，提示Sema3A在SSc发病过程中可能存在复杂的调控机制，或许涉及局部微环境与全身系统的动态平衡失调，Sema3A在SSc中的作用需进一步研究。Nrp1通过与VEGFA相互作用，调控内皮细胞的迁移和促进血管生成，参与胚胎发育、血管生成、肿瘤形成等过程^{［30， 31］}。Nrp1的胚胎缺失会导致严重的血管缺陷和胚胎致死，成年小鼠Nrp1缺陷表现出对Sema3A的反应减弱，降低VEGFA诱导的血管生成^［32］。SSc患者血清、皮肤、内皮细胞低表达Nrp1，血清Nrp1水平降低与甲襞微循环异常的严重程度和缺血性手指溃疡的存在呈正相关，内皮细胞沉默Nrp1后血管生成受损^{［24， 33， 34］}。SSc患者血清、皮肤均存在慢性且不受控制的VEGFA及其受体过度表达，但SSc患者皮肤小血管的数目却是减少的，缺乏有效的血管生成，这可能与VEGFA诱导的血管生成失衡或血管结构异常有关^［35］。本研究结果显示，模型组HDMEC细胞中Sema3A和VEGFA表达水平均显著升高，而Nrp1表达水平显著降低，这提示Sema3A的高表达可能通过竞争性结合Nrp1，减弱Nrp1与VEGFA的相互作用，从而加剧了对内皮细胞增殖、迁移及血管生成的抑制效应。而温阳化浊通络方含药血清干预后，能够显著降低Sema3A和VEGFA表达，同时升高Nrp1表达，这表明温阳化浊通络方可能通过抑制Sema3A的表达，减少其与Nrp1的竞争性结合，恢复Nrp1对正常血管生成信号的转导功能，同时抑制过度激活的VEGFA信号，从而协同促进受损内皮细胞的增殖、迁移和血管生成能力的恢复。

综上所述，温阳化浊通络方含药血清能够促进SSc HDMEC细胞增殖、迁移和血管生成，降低Sema3A、VEGFA、α-SMA表达，增加Nrp1和CD31表达，提示温阳化浊通络方促进SSc血管生成的作用机制可能与调节Sema3A/Nrp1信号通路改变CD31表达有关。本研究尚未通过经典的拯救实验验证温阳化浊通络方直接或间接调控Sema3A/Nrp1通路促进血管生成的因果关系；此外，血管内皮细胞介导的血管生成还受到多种信号通路的调控，同时血管损伤后发生的血管重塑有多种类型细胞的参与且机制复杂，但在本研究中均未涉及，因此下一步研究将通过信号通路激动剂、抑制剂或基因编辑技术特异性干预Sema3A/Nrp1通路，观察温阳化浊通络方调控血管生成的因果关系及温阳化浊通络方在血管损伤后如何调节血管内皮细胞行为及与其它类型细胞的交互作用。

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