NDUFA13与CRIP1调控慢阻肺B细胞损伤并具备潜在诊断价值

Overexpressing NDUFA13 and CRIP1 improves B cell injury and lung Lesions in COPD mouse models

摘要

目的 基于生物信息学方法筛选慢性阻塞性肺疾病（COPD）中与B细胞相关的生物标志物，并探究其诊断和治疗价值。 方法 基于基因表达综合数据库（GEO），通过差异表达分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、受试者工作特征曲线（ROC）分析及孟德尔随机化（MR）研究，鉴定COPD中B细胞相关生物标志物，构建诊断列线图并进行富集分析，运用伪时间分析和细胞通讯分析探索B细胞在COPD中的潜在作用。将20只ICR小鼠分为对照组与COPD组，每组10只，采用脂多糖（LPS）联合香烟烟雾诱导法构建COPD小鼠模型并验证生物标志物表达；其中COPD组经三溴乙醇麻醉后，于第1、14天气管滴注含20 μg LPS的30 μL生理盐水，直立静置15 s，其余时间每日置于密闭烟箱内进行香烟烟雾熏吸造模，测量相关指标。 结果 鉴定出两种COPD保护因子NDUFA13［优势比（OR）=0.2598，95%置信区间（CI）：0.2048~0.3297，P<0.0001］和CRIP1（OR=0.2690，95% CI：0.1460~0.4970，P<0.0001）作为生物标志物。这两种基因在COPD样本中均显著下调（P<0.05），且均参与氧化磷酸化通路；在COPD诊断中表现出良好效能，基于二者构建的诊断列线图的曲线下面积（AUC）为0.79。在单细胞水平上，B细胞表现出异质性；在COPD环境中，B细胞在发育初始及终末阶段的密度均升高（P<0.05）。在COPD背景下，B细胞与其他细胞（尤其是肺泡细胞）之间的相互作用及受体-配体配对显著增强（P<0.05）。基础实验结果显示，生物标志物在COPD样本的转录组和蛋白水平均下调（P<0.05），与公共数据库中的表达趋势一致。 结论 本研究证实NDUFA13和CRIP1可作为COPD中与B细胞相关的生物标志物，表明二者具备诊断潜力及降低COPD风险的能力。

Abstract

Objective To identify B cell-associated biomarkers in chronic obstructive pulmonary disease (COPD) using bioinformatics and explore their diagnostic and therapeutic potential. Methods Based on the GEO database, differential expression analysis, WGCNA, scRNA-seq, ROC curve analysis, and Mendelian randomization analysis were performed to screen B cell-related biomarkers. Twenty ICR mice were divided equally into control and COPD groups, and COPD model was established using lipopolysaccharide (LPS) combined with cigarette smoke exposure to verify biomarker expression. Cultured murine B lymphoma CH12.LX cells were stimulated with 1 μg/mL LPS and transfected with plasmids overexpressing CRIP1 or NDUFA13 or with a negative control plasmid, and the changes in protein expressions of NDUFB8, MTCO1, ATP5A and ACTB were examined with Western blotting. CCK-8 assay and flow cytometry were used to analyze the viability and apoptosis of murine lung epithelial cells co-cultured with the treated CH12.LX cells, respectively. Results Two protective factors, namely NDUFA13 (OR=0.2598) and CRIP1 (OR=0.2690; P<0.0001), were identified as the key B cell-associated biomarkers in COPD. In the mouse models of COPD, the expressions of NDUFA13 and CRIP1 were significantly downregulated in the lung tissues at both the transcriptional and protein levels. In CH12.LX cells, stimulation with LPS significantly lowered the protein expressions of NDUFA13, CRIP1, NDUFB8, MTCO1 and ATP5A. Overexpression of CRIP1 or NDUFA13 effectively inhibited LPS-induced inflammatory responses and oxidative stress in CH12.LX cells, and promoted the viability and suppressed apoptosis of lung epithelial cells co-cultured with CH12.LX cells. Conclusion NDUFA13 and CRIP1 are B cell-associated protective biomarkers in COPD with potential diagnostic values for COPD.

Graphical abstract

关键词

慢性阻塞性肺疾病 / B细胞 / 转录组学 / 单细胞RNA测序 / 孟德尔随机化 / 生物标志物

Key words

chronic obstructive pulmonary disease / B cell / transcriptomics / single-cell RNA sequencing / Mendelian randomization / biomarkers

慢性阻塞性肺疾病（COPD）以气流受限和肺部慢性炎症反应为特征，且部分可逆^［1］。临床上，COPD患者常表现出持续性呼吸困难、慢性咳嗽及咳痰增多，严重影响生活质量，并对全球公共卫生资源造成显著压力^{［2， 3］}。《中国成人肺部健康研究》显示，中国40岁以上人群COPD患病率为13.7%，患病人数约1亿^［3］。研究预测，至2030年，COPD将成为全球第三大死因，2060年后每年死亡人数预计超过540万^{［2， 4］}。目前，COPD的疾病管理主要为药物治疗、氧气治疗及肺康复，以延缓疾病进程、改善生活质量。但鉴于其复杂的病理生理学过程，尚缺乏高特异性的治疗方案^［1］。因此，鉴定新型诊断生物标志物并深入探索COPD的发病机制具有重要的临床和公共卫生意义。

作为人体免疫系统的关键组成部分，B细胞在识别和清除外来病原体中发挥核心作用。B细胞可分化为产生特异性抗原抗体的浆细胞^［5］，并通过抗原呈递激活T细胞以增强免疫反应^［6］，还能通过分泌多种细胞因子和趋化因子调节炎症和免疫反应的强度及类型^［7］。在涉及自身免疫成分的COPD中，B细胞可能由于自身免疫失调错误攻击正常肺组织，导致组织炎症和损伤^{［8， 9］}。COPD患者的肺部环境可诱导B细胞持续发展为促炎表型，在气道和肺组织中积聚，并通过产生炎症介质和自身抗体加剧局部慢性炎症^［9］。此外，B细胞异常活动与COPD的进展及急性加重密切相关。在COPD严重阶段，肺淋巴滤泡中的B细胞数量和体积显著增加，患者血液和肺样本中可检测到B细胞产物^［10］。B细胞浸润程度及其在小气道中的分布与COPD严重程度显著相关^［11］。总体而言，B细胞通过促进炎症反应及潜在自身免疫过程，在COPD的发生和加重中发挥关键作用。因此，鉴定COPD中的B细胞相关的生物标志物可为开发靶向B细胞治疗提供理论依据，有望为COPD患者带来新的治疗选择。

尽管已有研究证实B细胞参与COPD的慢性炎症与疾病进展，但当前研究仍存在不足：多数研究仅聚焦B细胞的表型与功能描述，尚缺乏基于大样本转录组与单细胞数据的系统性标志物筛选；且多为观察性关联分析，对标志物与COPD之间的潜在因果关联缺乏遗传层面的系统验证。基于此，本研究利用公共数据库中的转录组和单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，系统鉴定COPD中B细胞相关的生物标志物。借助全基因组关联研究（GWAS）数据，结合孟德尔随机化（MR）分析，从遗传角度评估候选标志物与COPD发生发展的潜在因果关联，并进一步探讨其诊断价值与多维分子机制。

1 材料和方法

1.1 数据来源

从基因表达综合数据库（GEO）获取COPD转录组数据集和scRNA-seq数据集。GSE57148数据集（GPL11154平台）作为训练队列，包含98例COPD患者和91例肺功能正常个体的肺组织样本。GSE38974数据集（GPL4133平台）作为验证队列，选取23例COPD患者和9例正常的肺组织mRNA样本。从GSE227691数据集（GPL18573平台）选取8例轻中度COPD肺组织样本及4例非COPD肺组织样本，用于细胞水平分析。

1.2 差异表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）

在训练队列GSE57148中，借助limma包（v3.54.0）^［12］在COPD与对照样本间筛选差异表达基因（DEGs1）（P<0.05，|log₂（FC）|>0.5）。

基于训练队列数据，运用WGCNA包（v1.72.1）^［13］构建基因共表达网络，将COPD状态作为性状特征纳入分析。首先通过层次聚类分析检测并剔除异常样本；继而确定最优软阈值（β），使无标度拟合指数（R²）接近0.85且平均连通性趋近于零，以满足无标度网络构建要求。通过动态树切割算法识别基因模块，生成模块树状图可视化聚类关系，并计算各模块特征基因（ME）与COPD的相关性，最终将与COPD绝对相关性最强的模块确定为关键模块。

1.3 单细胞RNA测序分析

使用Seurat软件包对scRNA-seq数据集GSE22769进行质控（QC）：剔除基因数<200或>4000、线粒体基因占比>20%的细胞，以及表达细胞数<3的基因。批次效应校正采用Seurat的锚点整合方法。数据经归一化后，基于方差稳定转换（VST）方法筛选前2000个高变异基因。主成分分析后，选取显著主成分，基于邻域图（FindNeighbors）和鲁汶聚类算法（FindClusters，resolution=0.2）进行细胞分群，结合UMAP降维可视化。利用CellMarker数据库，根据已知标记基因表达对各细胞簇进行注释，准确鉴定B细胞群体。在注释的B细胞群内，使用FindMarkers函数鉴定COPD与对照样本间的DEGs2（avg_|log₂FC|>0.5，校正后P值<0.05）。

1.4 COPD中B细胞相关生物标志物的筛选

将转录组分析得到的DEGs1、scRNA-seq分析得到的B细胞相关DEGs2及WGCNA鉴定的关键模块基因取交集，筛选出COPD中B细胞相关的DEGs。采用pROC软件包（v1.18.0）^［14］在训练队列和验证队列中分别绘制受试者工作特征（ROC）曲线，通过计算曲线下面积（AUC）量化诊断效能。随后，在两队列中利用Wilcoxon秩和检验分析其表达水平。符合下面标准的基因被确定为COPD的候选B细胞相关生物标志物：（1）在训练队列和验证队列中AUC值均>0.7；（2）在两队列中表达差异趋势一致且具有统计学显著性（P<0.05）。

1.5 MR分析

MR分析基于三项假设：工具变量（IVs）与暴露强相关、独立于混杂因素、仅通过暴露影响结局。从IEU OpenGWAS数据库获取基因的表达数量性状位点（eQTL）及COPD的GWAS数据（含186，957例欧洲血统个体的16，380，363个单核苷酸多态性（SNPs），其中234例病例、186，723例对照）。采用TwoSampleMR包（v0.5.6）^［15］筛选SNPs（P<5×10⁻⁵），并通过参数r²=0.01、kb=10排除连锁不平衡SNPs。计算F统计量验证IVs可靠性后，使用harmonise_data函数校准等位基因和效应量，剔除与结局显著相关的SNPs。采用五种方法（MR-Egger^［16］、加权中位数^［17］、逆方差加权（IVW）^［18］、简单模式、加权模式^［19］）进行MR分析，以IVW法为主。通过异质性检验（Cochran's Q）^［20］、水平多效性检验（MR-Egger截距）^［21］及留一法（LOO）^［22］进行敏感性分析，将通过检验且IVW P<0.05的生物标志物确定为COPD的B细胞相关生物标志物。基于“c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt”基因集，运用clusterProfiler包对生物标志物进行基因集富集分析（GSEA），筛选显著富集通路（P<0.05）。

1.6 B细胞发育轨迹与细胞通讯分析

使用monocle包（v 2.26.0）^［23］对已注释的B细胞进行拟时序轨迹分析，揭示其发育分化过程及生物标志物表达动态。使用CellChat包（v 1.6.1）^［24］分析注释的主要细胞类型在对照与COPD条件下的配体-受体相互作用网络，比较相互作用强度和模式的差异。

1.7 COPD小鼠模型构建与生物标志物验证

1.7.1 COPD小鼠模型构建及苏木精-伊红（HE）染色

所有动物实验经湖北中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批号：42010200009740）。本研究选取20只6~8周龄、体质量（30±3.5）g的健康雄性ICR小鼠，饲养于SPF级实验环境。随机分为COPD组和对照组，每组10只。所有小鼠饲养于温度（22±3）℃、相对湿度50%~70%的笼中，自由摄食饮水。适应性喂养7 d后开始实验。通过脂多糖（LPS）与香烟烟雾诱导构建COPD模型^［25-27］。三溴乙醇麻醉后，于第1天和第14天经气管滴注20 μg LPS的30 μL生理盐水至ICR小鼠咽喉，保持直立15 s。第2~13天及第15~30天，每日将小鼠置于密闭箱（70 cm×60 cm×60 cm），暴露于15支持续燃烧香烟的烟雾中。吸烟15 min后打开箱盖，散烟5 min，重复上述步骤3次。实验结束后，将小鼠转移至正常环境喂养30 d。建模完成24 h后麻醉小鼠，检测肺功能，取肺组织。将小鼠左上肺组织置于4%多聚甲醛中后固定，梯度脱水、包埋，冰冻切片，HE染色，光学显微镜下观察病理变化并评分。

1.7.2 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA，逆转录合成cDNA，使用Phusion聚合酶（NEB）进行PCR扩增。扩增的DNA片段在7.5%丙烯酰胺凝胶上电泳，用ImageJ软件对凝胶条带定量，并使用GraphPad Prism 6进行统计分析。引物序列（中国上海生工生物）见表1。

1.7.3 蛋白质免疫印迹（Western blotting）

用RIPA裂解液提取总蛋白，SDS-PAGE电泳分离，转膜，5%脱脂牛奶封闭1.5 h，一抗CRIP1（Proteintech，1∶5000）、NDUFA13（Proteintech，1∶2000）（4 ℃过夜）和二抗（Proteintech，1∶50 000）孵育，ECL显影，用多功能成像系统（Bio-Rad Laboratories）捕获信号，Image LabV 6.1软件计算蛋白条带灰度值。

1.7.4 免疫组织化学

石蜡切片经脱蜡、水化与抗原修复处理，自然冷却后以PBS（PH7.4）洗涤；随后置于3%浓度的H₂O₂溶液中避光孵育，结束后采用PBS（PH 7.4）洗涤3次，室温条件下用3%的BSA（Servicebio）封闭30 s。山羊来源的一抗用兔血清（Servicebio）封闭，其他来源的一抗用BS封闭。4 ℃孵育一抗CRIP1（Proteintech，1∶500）、NDUFA13（Proteintech，1∶200）过夜后，PBS洗涤3次，稍干，滴加对应种属的二抗（HRP标记）（Proteintech，1∶800）覆盖组织圈，室温孵育50 min。随后用DAB（Servicebio）显色，显微镜下控制显色时间，阳性显色为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。苏木精复染约3 min后，玻片脱水，在光学显微镜下进行结果判读。

1.8 B细胞中过表达NDUFA13和CRIP1及模型干预

1.8.1 过表达NDUFA13和CRIP1

以CH12.LX鼠源性B淋巴瘤细胞构建体外B细胞模型，分别建立CRIP1和NDUFA13过表达体系。实验设置为4组：Control组、Model组、Model+oe-Control组以及Model+oe-CRIP1或Model+oe-NDUFA13组。其中，oe-Control组转染或转导空载体，oe-CRIP1和oe-NDUFA13组分别转染或转导CRIP1、NDUFA13过表达载体。待目的基因表达稳定后，参考既往研究^［28］对B细胞进行COPD相关刺激处理。将生长状态良好的B细胞接种于培养板中，待细胞密度达到实验要求后，更换为含15% CSE和1 μg/mL LPS的完全培养基进行刺激。

1.8.2 Western blotting检测

采用RIPA裂解液提取各组B细胞总蛋白，离心后收集上清并测定蛋白浓度。取等量蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜，使用5%脱脂牛奶室温封闭。随后加入CRIP1（Proteintech，1∶5000）、NDUFA13（Proteintech，1∶2000）、NDUFB8（Proteintech，1∶2000）、MTCO1（Abcam， 1∶2000）、ATP5A（Proteintech，1∶5000）和ACTB（Abcam，1∶20 000）等一抗，于4 ℃孵育过夜。次日经TBST洗膜后加入相应HRP标记二抗（Proteintech，1∶50 000）孵育，采用ECL化学发光法显影。蛋白条带灰度值使用ImageJ进行定量分析，并以ACTB作为内参进行归一化。

1.8.3 ATP含量检测

采用ATP检测试剂盒检测各组细胞内ATP水平。各组细胞经相应处理后收集并裂解，按照试剂盒说明书加入ATP检测试剂，使用酶标仪检测发光或吸光信号。ATP水平根据细胞蛋白浓度或细胞数量进行校正，并以Control组为基准进行相对定量，结果表示为relative ATP level。

1.8.4 细胞炎症因子检测

B细胞炎症因子水平采用ELISA检测。各组B细胞经相应处理后，收集细胞培养上清，按照试剂盒说明书检测促炎因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和抗炎因子白细胞介素-10（IL-10）的含量。

1.8.5 线粒体ROS水平检测

B细胞线粒体ROS水平采用MitoSOX荧光探针结合流式细胞术检测。各组B细胞经处理后收集，加入MitoSOX工作液避光孵育，随后用PBS洗涤并重悬。采用流式细胞仪检测MitoSOX荧光强度，并以相对荧光强度表示各组B细胞线粒体氧化应激水平。

1.8.6 B细胞对小鼠肺上皮细胞的影响评估

将小鼠肺上皮细胞接种于Transwell非接触共培养体系下室，将不同处理后的B细胞接种于上室，使两类细胞在不直接接触的条件下通过可溶性因子进行相互作用。共培养结束后，收集下室肺上皮细胞进行细胞活力和凋亡检测。肺上皮细胞活力采用CCK-8法检测，结果以Control组为基准进行相对定量；肺上皮细胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测，以早期和晚期凋亡细胞比例综合评价肺上皮细胞凋亡水平。

1.9 统计学分析

采用R软件（v 4.2.2）进行生物信息学分析。基础实验均设置3个生物学重复和3个技术重复，数据以均值±标准差表示。组间差异采用t检验分析，多组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）处理。方差正态性通过Shapiro-Wilk检验验证。所有统计分析均使用GraphPad Prism软件完成，P<0.05视为具有统计学意义。本研究动物实验样本量基于预实验结果，以肺功能指标FEV0.1/FVC作为主要结局指标进行估算。采用G*Power 3.1软件，设定双侧检验α=0.05，检验效能1-β=0.80，根据预实验COPD组与对照组FEV0.1/FVC的均值差及标准差，计算得效应量Cohen's d=1.8，所需每组样本量为7只。考虑到实验过程中可能出现造模失败、动物死亡或意外脱落等情况，每组最终纳入10只小鼠，以保证足够的统计效能与实验可靠性。

2 结果

2.1 DEGs1的筛选及COPD相关关键模块基因的鉴定

在训练队列中进行差异表达分析，共发现350个DEGs1，其中COPD样本中185个基因上调，165个基因下调（P<0.05，图1A、B）。将COPD作为特征在训练队列中构建共表达网络，聚类分析确认样本分组稳健，无异常值，可全部纳入后续研究（图1C）。验证网络的无标度拓扑结构，确定最优秀软阈值（β）为9（图1D）。划分基因模块并在树状图中描绘其关系（图1E），MEbrown模块与COPD相关性最高（cor=0.57，P<0.0001），包含2214个关键模块基因（图1F）。

2.2 六种高特异性细胞类型的注释

聚类分析鉴定出11个不同的细胞簇（图2A）。基于已知标记基因的表达对这些簇进行注释，揭示存在6种细胞类型：上皮细胞、B细胞、巨噬细胞、肺泡细胞、中性粒细胞和T细胞（图2B，2C）。进一步对B细胞群中COPD与对照样本进行差异表达分析，鉴定出1，529个DEGs2，其中1，475个基因在COPD中上调，54个基因下调（图2D）。

2.3 COPD候选B细胞相关生物标志物的筛选

分析鉴定出COPD中的8个B细胞相关DEGs：SAMHD1、GOLIM4、HIPK2、CRIP1、S100A6、RPL35、ISG15和NDUFA13（图3A）。进行ROC分析评估这8个B细胞相关DEGs的诊断潜力，在训练队列中，所有8个基因的AUC值均高于0.7，显示出其预测性能（图3B）。但在验证队列中，3个基因（HIPK2、S100A6、ISG15）未达到所需阈值（图3C）。在训练队列中，所有8个基因在COPD与对照样本间均表现出显著差异表达（P<0.0001，图3D），而在验证队列中，HIPK2、S100A6和ISG15无显著差异（图3E），其余5个基因在两个数据集中保持一致的表达趋势（P<0.05）。因此，SAMHD1、GOLIM4、CRIP1、RPL35和NDUFA13被鉴定为COPD的候选B细胞相关生物标志物，其中SAMHD1和GOLIM4在COPD中上调，CRIP1、RPL35和NDUFA13下调。

2.4 鉴定与COPD存在因果关系的B细胞相关生物标志物NDUFA13和CRIP1

在IVs选择过程中，RPL35未满足纳入标准被排除。对剩余4个暴露因子，鉴定出230个F统计量大于10的SNPs作为IVs。排除与COPD显著相关的SNPs后，分别剩余44、16、94和67个SNPs与NDUFA13、CRIP1、GOLIM4和SAMHD1相关。IVW算法结果明确显示COPD与NDUFA13和CRIP1之间存在显著因果关系。具体而言，NDUFA13［优势比（OR）=0.2598，95%置信区间（CI）：0.2048~0.3297，P<0.0001］和CRIP1（OR=0.2690，95% CI：0.1460~0.4970，P<0.0001）被鉴定为COPD的潜在保护因子（表2）。散点图可视化显示COPD风险增加与NDUFA13和CRIP1呈负相关（图4A）。森林图确认IVW模型的显著效应，NDUFA13和CRIP1的效应量小于零（图4B）。漏斗图显示符合孟德尔第二定律随机分配，无漏斗图不对称（图4C）。Cochran's Q检验显示NDUFA13和CRIP1样本内无异质性（P>0.05）。水平多效性检验显示NDUFA13和CRIP1无混杂偏倚证据（P>0.05）。此外，LOO分析显示去除每个SNP不会显著改变剩余SNPs对NDUFA13和CRIP1的效应（图4D）。综上，基于显著的因果关系，NDUFA13和CRIP1被选为COPD的B细胞相关生物标志物。

2.5 NDUFA13和CRIP1在COPD进展中的功能表征

通过GSEA探索发现与COPD进展相关的显著富集通路，受NDUFA13和CRIP1影响。值得注意的是，两种生物标志物富集的前5条通路为“核糖体”、“氧化磷酸化”、“帕金森病”、“亨廷顿病”和“阿尔茨海默病”（图5A、B）。其中，氧化磷酸化与COPD显著相关。

2.6 探索B细胞的发育轨迹与通讯网络

细胞轨迹分析清晰勾勒B细胞发育成熟路径，于发育中期出现分支并分化为两类亚型，整个过程可划分为三个阶段，直观体现B细胞异质性（图6A、B）。相较于正常状态，COPD 微环境下B细胞在发育起始与终末阶段的细胞密度均显著上升（图6C）。标志物表达谱显示，CRIP1与NDUFA13在B细胞发育首尾阶段均呈高表达，且CRIP1表达水平持续高于 NDUFA13（图6D）。在进一步分析中，通过定量评估先前注释的6种细胞类型间的通讯网络，检查对照和COPD条件下的细胞间相互作用。与对照相比，COPD环境中这些相互作用的数量和强度显著增强，尤其是B细胞与肺泡细胞和上皮细胞之间（图6E、F）。进一步分析不同样本的配体-受体相互作用，数据显示COPD环境中B细胞的配体发射和接收均呈增加趋势，尤其是B细胞与肺泡细胞之间，记录到最高数量的配体-受体配对（图6G、H）。

续图6

2.7 在COPD小鼠模型中验证生物标志物的表达

与对照组相比，COPD小鼠肺组织病理分析显示肺泡间隙炎症细胞浸润（图7A），肺泡腔水肿（红色箭头）和支气管壁塌陷（绿色箭头）（图7B），部分肺泡明显出血和结构损伤（图7C）。免疫组织化学分析结果显示，与对照组相比，模型组CRIP1和NDUFA13下调（P<0.05，图7D~F）。RT-PCR显示，模型组CRIP1和NDUFA13表达下调（P<0.05，图7G），与Western blotting结果一致（P<0.05，图7H）。

2.8 过表达CRIP1和NDUFA13改善模型诱导的B细胞氧化磷酸化损伤

与Control组相比，Model组B细胞中CRIP1和NDUFA13蛋白表达均明显下降；Model+oe-Control组与Model组相比无明显差异；而在Model+oe-CRIP1或Model+oe-NDUFA13组中，相应靶蛋白表达显著升高，说明CRIP1和NDUFA13过表达体系构建成功（P<0.05，图8A、B、H、I）。进一步检测氧化磷酸化相关蛋白发现，Model组中NDUFB8、MTCO1和ATP5A的表达均明显降低；与Model组相比，Model + oe-Control组上述蛋白表达未见明显恢复，而CRIP1或NDUFA13过表达后，NDUFB8、MTCO1和ATP5A蛋白水平均显著升高（P<0.05，图8C~F、J~M）。与蛋白表达结果一致，ATP含量检测显示，Model组ATP水平明显下降，空载体干预未能改善这一变化，而过表达CRIP1或NDUFA13均可显著提高细胞ATP水平（P<0.05，图8G、N）。

2.9 CRIP1和NDUFA13过表达抑制B细胞炎症及氧化应激，并减轻其对肺上皮细胞的损伤

Model+oe-Control组与Model组相比无明显差异。CRIP1过表达后，B细胞中IL-6和TNF-α水平明显下降，而IL-10水平显著升高（P<0.05，图9A~C）。类似地，NDUFA13过表达也显著降低模型诱导的IL-6和TNF-α分泌，并恢复IL-10表达水平（P<0.05，图9F~H）。MitoSOX流式检测结果显示，Model组B细胞MitoSOX荧光强度较Control组明显升高，Model+oe-Control组与Model组相比未见明显下降。而在CRIP1或NDUFA13过表达后，MitoSOX荧光强度均明显降低（P<0.05，图9D、E、I、J）。细胞活力检测结果显示，与Control组B细胞共培养相比，Model组B细胞显著降低肺上皮细胞活力；Model+oe-Control组未能改善该变化，而与过表达CRIP1或NDUFA13的B细胞共培养后，肺上皮细胞活力明显恢复（P<0.05，图9K、L）。进一步采用Annexin V-FITC/PI流式检测肺上皮细胞凋亡，结果显示，Model组B细胞共培养后肺上皮细胞凋亡比例显著升高，空载体处理未能降低凋亡水平；而CRIP1或NDUFA13过表达的B细胞显著减少肺上皮细胞凋亡（P<0.05，图9M~O）。

3 讨论

本研究最核心的发现是，通过严格的生信筛选及MR因果推断，锁定NDUFA13和CRIP1为COPD的关键保护因子。在诊断效能方面，NDUFA13和CRIP1在独立训练集和验证集中均表现出色，且表达水平在COPD患者肺组织中显著下调。深入的功能表征揭示了NDUFA13和CRIP1显著富集于“氧化磷酸化”通路。NDUFA13是线粒体复合物I（NADH脱氢酶）的亚基，直接参与电子传递链和ATP生成。其下调可能导致复合物I功能障碍^［29］，加剧COPD中已存在的线粒体氧化磷酸化异常和氧化应激。CRIP1（富含半胱氨酸蛋白1）属于LIM/双锌指蛋白家族，既往研究提示其参与炎症反应和纤维化过程^［30］。本研究发现其在COPD中下调，其具体作用机制尚需进一步探究。两者在“氧化磷酸化”通路中的富集，强烈提示其表达下调可能通过损害细胞能量代谢和加剧氧化损伤，共同参与COPD的病理生理进程^{［31， 32］}。

单细胞分辨率的研究为理解B细胞在COPD中的作用及生物标志物的功能定位提供了新视角。scRNA-seq分析成功注释了肺组织中的主要细胞类型，并聚焦B细胞群体。拟时序轨迹分析揭示了COPD肺组织中B细胞发育的异质性，其初始和终末阶段细胞密度显著升高，与既往报道的COPD肺内B细胞数量增加及滤泡形成现象相符^［10］。值得注意的是，NDUFA13和CRIP1在B细胞发育轨迹的初始和终末阶段均呈现高表达，提示其表达水平与B细胞的成熟状态或特定功能亚群密切相关。进一步利用CellChat进行的细胞通讯分析显示，在COPD微环境下，B细胞与其他细胞类型（尤其是肺泡细胞）间的配体-受体相互作用显著增强^{［33， 34］}。这种增强的细胞间通讯，特别是B细胞活跃的信号收发，可能驱动了局部炎症网络的异常激活，参与COPD的慢性炎症维持和组织损伤。

研究成功构建的LPS与烟雾诱导COPD小鼠模型表现出典型的肺部病理改变即炎症浸润、肺泡腔水肿、支气管壁塌陷。在该模型中，NDUFA13和CRIP1在转录水平和蛋白水平均一致下调，与人类组织中的生信分析结果高度吻合，印证了二者在COPD发生发展中的重要性。通过体外实验我们发现，COPD相关刺激导致B细胞中NDUFA13和CRIP1表达下降，进而伴随氧化磷酸化受损、ATP生成不足、线粒体ROS积累及促炎因子释放增加；异常活化的B细胞又可通过非接触性细胞通讯方式损伤肺上皮细胞，表现为肺上皮细胞活力下降和凋亡增加。恢复NDUFA13或CRIP1表达能够在一定程度上逆转上述变化，提示二者可能通过维持B细胞免疫代谢稳态，减轻B细胞介导的肺上皮损伤。这些结果使NDUFA13和CRIP1从“候选生物标志物”进一步上升为具有功能意义的调控分子，为其作为COPD中B细胞相关干预靶点提供了更有力的实验依据。

综上所述，本研究成功鉴定并验证了NDUFA13和CRIP1作为COPD中具有保护作用的B细胞相关生物标志物。二者在COPD中显著下调，具备良好的诊断价值，其表达降低与疾病风险增加存在因果关联。功能上，二者共同参与氧化磷酸化通路，其下调可能加剧COPD的线粒体功能障碍和氧化应激。单细胞分析揭示了COPD中B细胞的异质性、发育轨迹改变及增强的细胞间通讯（尤其与肺泡细胞），且生物标志物的表达模式与B细胞特定发育阶段紧密关联。动物与细胞模型验证进一步巩固了研究发现的可靠性。

然而，本研究存在一定局限性，首先，使用的数据源自公共数据库，存在一定异质性，且未能充分校正年龄、性别、吸烟状态等关键混杂因素的潜在影响；其次，本研究鉴定的生物标志物表达水平尚未在临床样本中进行实验验证，仍需在更大规模的独立队列中进一步证实。此外，本研究MR分析所用结局GWAS数据集虽为欧洲人群，可减少人群异质性偏倚，但病例数量偏少，可能影响统计效能与结果稳健性，后续仍需更大样本量数据进一步验证。。总之，未来研究计划通过更精确的动物和细胞实验进一步验证这些B细胞相关生物标志物的作用和机制，并评估其临床意义；并探索利用这些发现，以经济有效的方式增强当前COPD治疗策略的潜力。

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