旋覆花中酚酸类化合物的降脂活性研究

Hypolipidemic activity of phenolic acids from Inula japonica Thunb.

摘要

目的 分离与鉴定旋覆花甲醇提取部位中的酚酸类化学成分，并评估其对代谢相关脂肪性肝病的降脂活性。 方法 运用硅胶、十八烷基硅烷键合硅胶柱及半制备高效液相色谱技术对旋覆花甲醇提取物进行分离纯化；通过理化性质与波谱数据分析鉴定化合物结构；采用游离脂肪酸（FFA）诱导的AML12细胞脂质沉积模型，对所得化合物进行降脂活性初筛；对活性化合物进一步通过油红O、尼罗红、BODIPY染色观察脂质变化，并检测活性氧和线粒体膜电位水平评估细胞功能。 结果 从旋覆花中分离得到11个酚酸类化合物，分别为二氢红花菜豆酸（1）、原儿茶醛（2）、绿原酸（3）、隐绿原酸（4）、1，3-O-二咖啡酰基奎宁酸（5）、2，3-二羧基-67-二羟基-1-（3'，4'-二羟基）苯基-1，2-二氢萘-10-甲酸甲酯（6）、咖啡酸（7）、原儿茶酸（8）、3-羧基-6，7-二羟基-1-（3'，4'-二羟基苯-萘（9）、对羟基苯甲酸（10）、4-羟基苯乙酸（11）。其中，化合物1和9为首次从旋覆花属中分离，化合物6为首次从该植物中分离。活性筛选表明，化合物6和9在FFA模型中表现出降脂活性，且能显著降低细胞内总胆固醇、总甘油三酯、谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平（P<0.05），有效减少脂质积累，并调节氧化应激与线粒体功能。 结论 旋覆花富含结构多样的酚酸类成分，其中化合物6和化合物9通过抑制脂质蓄积、改善氧化应激及线粒体功能障碍发挥降脂活性，可作为缓解代谢相关脂肪性肝病的潜在先导化合物。

Abstract

Objective To isolate and identify phenolic acid constituents from methanol extract of Inula japonica Thunb. and evaluate their lipid-lowering activity in vitro. Methods The methanol extract of Inula japonica Thunb. was purified using silica gel, ODS, and semi-preparative HPLC. The compound structures were determined using physicochemical and spectroscopic analyses, and their hypolipidemic activities were assessed in an AML12 cell model of free fatty acids (FFA)-induced lipid deposition. The active compounds were further assessed for their effects on lipid deposition, reactive oxygen species (ROS) production and mitochondrial membrane potential (MMP) of the cell model. Results A total of 11 phenolic acid compounds were isolated from Inula japonica Thunb., namely dihydrocaffeic acid (1), protocatechualdehyde (2), chlorogenic acid (3), cryptochlorogenic acid (4), 1,3-O-dicaffeoylquinic acid (5), 2,3-dicarboxy-6,7-hydroxy-l-(3',4'-dihydroxy)-phenyl -1,2-dihydronaphthalene-10-methyl ester (6), caffeic acid (7), protocatechuic acid (8), 3-carboxy-6,7-dihydroxy-1-(3',4'-dihydroxyphenyl)-naphthalene (9), p-hydroxybenzoic acid (10), and 4-hydroxyphenylacetic acid (11). Among them, compounds 1 and 9 were isolated for the first time from the genus Inula, and compound 6 was isolated for the first time from this plant. Compounds 6 and 9 showed lipid-lowering effects in FFA-induced AML12 cells, significantly lowered cellular levels of total cholesterol, triglyceride, alanine aminotransferase, and aspartate aminotransferase, reduced lipid accumulation, and alleviated oxidative stress and mitochondrial function. Conclusion Inula japonica Thunb. contains diverse phenolic acids, and among them compounds 6 and 9 show hypolipidemic activities via inhibiting lipid accumulation and improving oxidative stress and mitochondrial function and can potentially serve as lead compounds for treatment of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease.

Graphical abstract

关键词

旋覆花 / 酚酸类化合物 / 降脂活性 / 代谢相关脂肪性肝病

Key words

Inula japonica Thunb / phenolic acids / hypolipidemic activity / metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease

代谢相关脂肪性肝病（MASLD），前称非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），是全球常见的肝脏疾病之一，全球患病率超过25%，其与肥胖相关的肝脏异位脂肪堆积密切相关^［1］，是一种以脂质代谢紊乱为特征的代谢性疾病^［2］。因此，减轻肝细胞内的脂质积累成为治疗MASLD的一种可行策略。

在近年来MASLD的全球患病率持续攀升的背景下，胰岛素抵抗、血脂异常及高血压等被认定为主要风险因素^{［3， 4］}。由于MASLD发病机制的复杂性，临床药物研发受到严重阻碍。尽管2024年3月，美国食品药品监督管理局批准Resmetirom用于治疗代谢相关脂肪性肝炎（MASH）^［5］，但其潜在不良反应仍需警惕，而饮食调节和运动生活方式干预仍是治疗MASLD的首选^［6］。因此，临床上对预防和治疗MASLD药物的需求依然巨大，寻找安全有效的药物是全球公共卫生服务亟需面对的问题。

天然产物因结构多样性、多靶点协同及副作用低等优势，在MASLD治疗中展现出巨大潜力，已成为候选药物的重要来源^{［7， 8］}。近年来，膳食多酚在防治代谢相关脂肪肝病中引起广泛关注^{［9， 10］}。作为膳食多酚的重要组成部分，酚酸类化合物已被证实可通过抑制氧化应激、抗炎及减少脂质沉积，有效缓解MASLD^［11］。

《金匮要略·五藏风寒积聚病脉证并治》记载：“肝着，其人常欲蹈其胸上，先未苦时，但欲饮热，旋覆花汤主之。””中医理论认为，肝失疏泄，肝脉郁滞，会引发胸胁痞闷不舒甚或胀痛、刺痛等症，旋覆花汤作为治疗“肝着”的经典方剂，具有行气活血、疏肝通络的功效^［12］，其中旋覆花作为君药，在疏肝行气方面发挥着关键作用，这也表明旋覆花在治疗MASLD方面存在一定的经典理论支撑。

旋覆花表现出抗炎、抗氧化、降脂、抗糖尿病及肝保护等多种药理活性^{［13， 14］}。从当前旋覆花化学成分的研究现状来看，现有研究工作大多聚焦于萜类成分的分离鉴定及活性筛选，而对旋覆花中非萜类成分的研究关注度相对不足，相关研究报道较为零散，尚未形成系统的研究体系，这在一定程度上限制了对旋覆花药用价值的全面挖掘。值得注意的是，酚酸类、黄酮类化合物作为旋覆花中含量仅次于萜类的两类主要活性成分，其药用价值同样不可忽视。现代药理研究表明，这类非萜类成分同样具备显著的抗氧化、抗衰老、抗炎、抗菌等药理活性^［15-17］，在调节机体代谢、保护组织器官、增强机体免疫力等方面发挥着重要作用，与萜类成分协同构成了旋覆花药用功效的物质基础。基于上述研究现状与不足，为进一步完善旋覆花的化学成分研究体系，丰富其药用物质基础，填补当前非萜类成分研究的空白，同时为本属植物的资源开发、质量控制及临床应用提供更全面、可靠的科学依据，本研究聚焦旋覆花中非萜类化学成分中的酚酸类成分，开展分离纯化与结构鉴定工作，并挖掘其中可防治MASLD的酚酸类活性化合物。

为探究旋覆花中酚酸类成分与其降脂活性之间的关联，本研究系统分离纯化了旋覆花甲醇提取物的化学成分，并鉴定和评估其中11种酚酸类化合物在改善肝细胞脂肪变性方面的潜在活性。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物来源

旋覆花购自广东一方制药有限公司，产地为山东枣庄。由南方医科大学中医药学院晁志教授鉴定为菊科植物旋覆花Inula japonica Thunb.的干燥头状花序，样品标本存放于南方医科大学中医药学院广东省中药制剂重点实验室。

1.1.2 主要试剂

柱层析硅胶200-300目（青岛海洋化工有限公司）；SBC MCI GEL 反相填料F型（成都植标化纯生物技术有限公司）；ODS反相填料（青岛海粟新材料科技有限公司）；色谱柱（分析柱，SHIMADZU 200×4.6 mm 5 μm C18）；色谱柱（半制备柱，依利特10.0 nm×250 mm 5 μm）；DMEM/F12培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；1×PBS缓冲液（兰杰柯科技有限公司）；油酸BSA水溶液、棕榈酸BSA水溶液（广州沛瑜生物科技有限公司）；Cell Counting Kit-8（GLPBIO）；甘油三酯（TG）测试盒、总胆固醇（T-CHO）测试盒、谷丙转氨酶（ALT/GPT）测试盒、谷草转氨酶（AST/GPT）测试盒（南京建成生物工程研究所）；ITS Media Supplement、地塞米松、活性氧检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）（上海碧云天生物技术股份有限公司）；油红O染料（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；尼罗红染料、BODIPY染料（MedChemexpress）。

1.1.3 主要实验仪器

600兆核磁共振波谱仪（Bruker）；高效液相色谱仪（HPLC仪，Shimadzu）；旋转蒸发仪（BUCHI）；万分之一电子天平（METTLER TOLEDO）；真空离心浓缩仪CV20（北京吉艾姆仪器有限公司）；离心机（Eppendorf）；手提式紫外分析仪（杭州齐威仪器有限公司）；超净工作台、酶标仪、细胞培养箱（Thermo）；倒置荧光显微镜（Olympus Corporation）。

1.2 研究方法

1.2.1 提取分离

旋覆花干燥头状花序用75%乙醇加热回流提取3次，合并提取液，过滤除去药渣，减压浓缩得粗提物浸膏。浸膏用乙酸乙酯萃取，减压浓缩乙酸乙酯层浸膏，再经硅胶柱色谱、ODS及半制备HPLC等色谱技术分离纯化，最终得到化合物单体。

1.2.2 结构鉴定

化合物单体结构鉴定采用理化性质与波谱数据相结合的方法：先通过外观、溶解性及特征显色反应等理化指标初步判定其化学类别，再利用紫外、核磁共振及质谱等波谱技术分析官能团与骨架信息，并参考相关文献中同类化合物的波谱数据进行比对验证，从而准确确定其分子结构。

1.2.3 细胞培养及造模

小鼠正常肝细胞AML12购自武汉普诺赛生命科技有限公司。细胞在37 ℃、5% CO₂条件下，使用添加了2.5%胎牛血清、1% ITS、1%青霉素-链霉素溶液（100×）及40 ng/mL地塞米松的DMEM/F12培养基进行培养。采用游离脂肪酸（FFA）300 μmol/L（油酸∶棕榈酸=2∶1）处理细胞，建立体外MASLD模型。

1.2.4 细胞活力测定

采用CCK-8法检测0~100 μmol/L浓度范围内各化合物对AML12细胞的毒性，以细胞存活率>90%为筛选标准。评估化合物对AML12细胞活力的影响。将对数生长期的AML12细胞以3×10³/孔密度接种于96孔板，培养24 h后，将倍比浓度（0~100 μmol/L）的化合物1-11干预细胞24 h，加入10 μL CCK-8溶液继续孵育1 h，测定吸光度A_{450 nm}。

1.2.5 生化指标测量

将处于对数生长期的AML12细胞按3×10⁵/孔的密度接种于6孔板中。经24 h培养使细胞充分贴壁后，设置如下分组进行干预：空白组用0.1% DMSO处理，模型组用300 μmol/L FFA诱导建模；干预组在造模基础上，加入化合物1-11进行干预。在37 ℃培养箱下干预24 h后，收集细胞，弃去培养基，用0.1% Triton X-100裂解后离心取上清，参照试剂盒说明书测定总胆固醇（TC）、TG、ALT和谷草转氨酶（AST）指标：TC、TG检测：各孔加入样品裂解液后，分别加入对应工作液，37 ℃孵育10 min，检测吸光度A_{500 nm}。ALT、AST检测：各孔加入样品裂解液后，先加入基质液37 ℃孵育30 min，再加显色剂孵育20 min，最后加入终止液室温放置15 min，检测吸光度A_{505 nm}。

1.2.6 油红O染色

将对数生长期的AML12细胞以2×10⁵/孔密度接种于6孔板，培养24 h使细胞贴壁。随后造模，干预组分别加入梯度浓度的化合物6和化合物9进行干预。经37 ℃培养箱培养24 h后，弃去培养基，加入4%多聚甲醛固定24 h，PBS 漂洗2次。接着加入100%丙二醛处理3 min，再以0.5%油红O染色，37 ℃避光孵育30 min。用85%丙二醛分化15 s，PBS漂洗2次，最后在显微镜下观察并拍照记录。

1.2.7 尼罗红染色

将对数生长期的AML12细胞以3×10³/孔密度接种于96孔板，培养24 h使细胞贴壁。随后造模，干预组分别梯度浓度的化合物6和化合物9进行干预。37 ℃培养24 h后，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，加入400 μmol/L尼罗红工作液和5 μmol/L DAPI工作液，避光条件下孵育30 min。再次用PBS漂洗2次，于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.8 BODIPY染色

将对数生长期的AML12细胞以3×10³/孔密度接种于96孔板，培养24 h使细胞贴壁。随后造模，干预组分别加入梯度浓度的化合物6和化合物9进行干预。37 ℃培养24 h后，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，加入5 μmol/L BODIPY工作液和5 μmol/L DAPI工作液，避光条件下孵育30 min。再次用PBS漂洗2次，于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.9 活性氧（ROS）水平检测

将对数生长期的AML12细胞以3×10³/孔密度接种于96孔板，培养24 h使细胞贴壁。随后造模，干预组分别加入梯度浓度的化合物6和化合物9进行干预。37 ℃培养24 h后，每孔加50 μL ROS 染色工作液，37 ℃避光孵育20 min。弃去染色液，培养基润洗3次，每孔加入50 μL新鲜培养基，检测吸光度A_{350/461 nm}和A_{488/525 nm}。

1.2.10 线粒体膜电位（MMP）水平检测

将对数生长期的AML12细胞以3×10³/孔密度接种于96孔板，培养24 h使细胞贴壁。随后造模，实验组分别加入梯度浓度的化合物6和化合物9进行干预。37 ℃培24 h后，用PBS润洗1次，每孔加入50 μL培养基，再补加50 μL JC-1染色工作液，37 ℃避光孵育20 min。孵育结束后弃去染色液，用JC-1染色缓冲液洗2次，每孔加入50 μL培养基，检测吸光度A_{490/530 nm}和A_{525/590 nm}。

1.2.11 统计学分析

使用GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 化合物1-11提取分离流程

从旋覆花中提取分离，共获得了11个酚酸类化合物，具体流程如下。取旋覆花干燥头装花序10 kg，采用75%乙醇加热回流提取3次，合并提取液，除渣后减压浓缩，得到1508 g旋覆花粗提物浸膏。浸膏经乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯部位350 g。将乙酸乙酯层部位经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（1∶0~0∶1）梯度洗脱，得到3个流分（Fr）（Fr.1~Fr.3）。因酚酸类化合物主要富集于极性较大的Fr.3，对其进一步分离纯化，最终获得11个酚酸类化合物。

Fr.3（199.0 g）经MCI柱色谱分离，甲醇-水（30∶70~100∶0）梯度洗脱，得到6个流分（Fr.3.1~Fr.3.6）。Fr.3.1（14.4 g）经ODS柱色谱分离，甲醇-水（15∶85~100∶0）梯度洗脱，得到3个流份（Fr.3.1.1~Fr.3.1.4）。Fr.3.1.2（1.4 g）经半制备HPLC（33%甲醇）分离得到6个流分（Fr.3.1.2.1~Fr.3.1.2.6）。其中，Fr.3.1.2.2（19.0 mg）再经半制备HPLC（30%甲醇）纯化得到化合物8（t_R=12.1 min，8.2 mg）。Fr.3.1.2.3（80.8 mg）经半制备HPLC（26%甲醇）纯化得到化合物2（t_R=18.8 min，2.2 mg）、化合物3（t_R=24.6 min，13.5 mg）以及化合物4（t_R=27.2 min，10.1 mg）。Fr.3.1.2.4（19.8 mg）再经半制备HPLC（32%甲醇）纯化得到化合物5（t_R=17.9 min，9.6 mg）。Fr.3.1.2.5（142.3 mg）经半制备HPLC（48%甲醇）纯化得到化合物6（t_R=6.9 min，5.8 mg）、化合物7（t_R=8.5 min，79.2 mg）。Fr.3.1.2.6（39.0 mg）经半制备HPLC（38%甲醇）纯化得到化合物1（t_R=16.1 min，14.4 mg）。Fr.3.1.3（362.5 mg）经半制备HPLC（54%甲醇）分离得到2个流分（Fr.3.1.3.1~Fr.3.1.3.2）。Fr.3.1.3.1（26.8 mg）再经半制备HPLC（50%甲醇）纯化得到化合物9（tR=13.2 min，10.7 mg）。Fr.3.1.1（10.2 g）经凝胶柱色谱（100 %）洗脱得到4个流分（Fr.3.1.1.1~Fr.3.1.1.4）。Fr.3.1.1.1（3.7 g）经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（40∶1~0∶100）梯度洗脱，得到6个流分（Fr.3.1.1.1.1~Fr.3.1.1.1.6）。Fr.3.1.1.1.4（290.9 mg）经半制备HPLC（16%甲醇）纯化得到化合物11（t_R=30.1 min，3.6 mg）。Fr.3.1.1.2（3.7 g）经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷-甲醇（30∶1~0∶100）梯度洗脱，得到4个流分（Fr.3.1.1.2.1~Fr.3.1.1.2.4）。Fr.3.1.1.2.2（36.9 mg）经半制备HPLC（12%甲醇）纯化得到化合物10（t_R=34.5 min，19.8 mg）。

2.2 化合物1-11结构鉴定

通过理化性质与波谱数据结合，本研究从旋覆花中分离鉴定出11个酚酸类化合物，其化学结构如下（图1）。

化合物1，黑色无定形粉末，分子式为C₁₅H₂₂O₅。¹H NMR （600 MHz， DMSO-d₆） δ 7.86 （d，J=15.8 Hz，1H， H-4），6.42 （d，J-15.8 Hz，1H，H-5），5.68 （s， 1H， H-2），3.95-3.84 （m，1H，H-9），3.62 （d，J=2.1 Hz， 1H，H-12α），3.55 （d，J =7.2 Hz，1H，H-12β），2.00 （s，H-15，3H），1.92-1.79 （m，1H， H-8α），1.74-1.66 （m， 1H，H-10α），1.64-1.57 （m，1H，H-8β），1.55-1.50 （m，1H，H-10β），0.99 （s，3H，H-14），0.79 （s，3H，H-13）； ¹³C NMR （151 MHz， DMSO-d₆） δ 166.95 （C-1），149.16 （C-3），135.02 （C-5），129.43 （C-4）， 118.20 （C-2），85.73 （C-7），81.50 （C-6），75.30 （C-12），63.85 （C-9），48.06 （C-11），45.47 （C-8），43.90 （C-10），20.82 （C-15），19.54 （C-14），16.12 （C-13）。对比文献数据^［18］，化合物1被鉴定为二氢红花菜豆酸。

化合物2，黄色无定形粉末，分子式为C₇H₆O₃。¹H NMR （600 MHz， Methanol-d₄） δ 9.69 （s，1H，H-7），7.31 （d，J=2.5 Hz，1H， H-2），7.30 （d，J=2.5 Hz，1H，H-6），6.91 （d，J =8.0 Hz，1H，H-5）；¹³C NMR （151 MHz， Methanol-d₄） δ 193.05 （C-7），153.75 （C-4），147.21 （C-3），130.84 （C-1），126.40 （C-6），116.24 （C-2），115.34 （C-5）。对比文献数据^［19］，化合物2被鉴定为原儿茶醛。

化合物3，淡黄色粉末，分子式为C₁₆H₁₈O₉。1H NMR （600 MHz， Methanol-d₄） δ 7.56 （d， J=15.9 Hz， 1H，H-3'），7.05 （s，1H， H-5'），6.95 （d， J=2.1 Hz，1H，H-9'），6.78 （d，J=8.2 Hz，1H， H-8'），6.26 （d，J=15.9 Hz， 1H， H-2'），5.34 （td，J=9.1，4.1 Hz，1H，H-5），4.20-4.12 （m，1H， H-3），3.73 （dd，J=8.5，3.1 Hz，1H， H-4），2.25- 2.15 （m，2H，H-2），2.12-2.02 （m，2H，H-6）；¹³C NMR （151 MHz，Methanol-d₄） δ 177.14 （C-7），168.67 （C-1'），149.55 （C-7'），147.07 （C-3'），146.78 （C-6'）， 127.78 （C-4'），122.97 （C-9'），116.46 （C-8'），115.25 （C-2'），115.18 （C-5'），76.20 （C-1），73.50 （C-4），71.97 （C-5），71.34 （C-3），38.83 （C-6），38.21 （C-2）。对比文献数据^［20］，化合物3被鉴定为绿原酸。

化合物4，黄色粉末，分子式为C₁₆H₁₈O₉。¹H NMR （600 MHz，Methanol-d₄） δ 7.64（d，J=15.9 Hz，1H，H-3'），7.07 （d，J=2.0 Hz，1H，H-5'），6.96 （dd，J=8.2，2.0 Hz， 1H，H-9'），6.78 （d，J=8.1 Hz，1H，H-8'），6.37 （d，J=15.9 Hz， 1H，H-2'），4.81 （dd，J=9.3，3.0 Hz， 1H，H-4）， 4.32-4.26 （m，2H， H-3，5），2.25-2.13 （m，2H，H-6）， 2.09-1.97 （m， 2H， H-2）；¹³C NMR （151 MHz， Methanol-d₄） δ 169.00 （C-7），163.26 （C-1'），149.55 （C-7'），147.12 （C-6'），146.80 （C-3'），127.86 （C-4'）， 122.96 （C-9'），116.48 （C-8'），115.36 （C-2'），115.15 （C-5'），79.25 （C-1），76.61 （C-5），69.62 （C-4），65.58 （C-3），42.66 （C-2），38.47 （C-6）。对比文献数据^［21］，化合物4被鉴定为隐绿原酸。

化合物5，淡黄色粉末，分子式为C₂₅H₂₄O₁₂。¹H NMR （600 MHz， Methanol-d₄） δ 7.49 （d，J=10.2 Hz， 1H， H-3'），7.47 （d，J=10.1 Hz，1H， H-3''），6.93 （d，J= 2.1 Hz，1H， H-5'），6.82 （d，J=2.1 Hz，1H，H-5''），6.75 （dd，J=8.2，2.1 Hz，1H，H-9'）， 6.64 （d，J=8.2 Hz，1H， H-8'）， 6.60 （dd，J=8.2，2.1 Hz，1H， H-9''）， 6.52 （d，J= 8.2 Hz，1H， H-8''），6.19 （d，J=15.9 Hz，1H， H-2'），6.12 （d， J = 15.9 Hz， 1H， H-2''）， 5.39-5.36 （m， 1H，H-3），4.25 -4.20 （m， 1H， H-5），3.65-3.61 （m， 1H，H-4），2.91- 2.87 （m， 1H， H-2α）， 2.55-2.49 （m， 1H， H-2β）， 2.34- 2.28 （m， 1H， H-6α）， 1.88 -1.82 （m， 1H， H-6β）； ¹³C NMR （151 MHz， Methanol-d₄） δ 174.65 （C-7）， 168.83 （C-1'）， 167.81 （C-1''）， 149.65 （C-7'）， 149.26 （C-7''）， 147.69 （C-6'）， 147.14 （C-6''）， 146.72 （C-3'）， 146.48 （C-3''）， 127.47 （C-4'）， 127.42 （C-4''）， 122.92 （C-9'）， 122.01 （C-9''）， 116.58 （C-8'）， 116.55 （C-8''）， 116.08 （C-5'）， 115.42 （C-5''）， 115.37 （C-2'）， 115.13 （C-2''）， 81.15 （C-1）， 75.27 （C-4）， 72.96 （C-5）， 67.82 （C-3）， 41.29 （C-6）， 32.95 （C-2）。对比文献数据^［22］，化合物5被鉴定为1，3-O-二咖啡酰基奎宁酸。

化合物6，黄棕色无定形粉末，分子式为C₁₉H₁₆O₈。¹H NMR （600 MHz， Methanol-d₄） δ 7.57 （s， 1H， H-4）， 6.81 （s， 1H， H-6）， 6.63 （d， J=8.2 Hz， 1H， H-5'）， 6.50 （s， 1H， H-9）， 6.44 （d， J=2.2 Hz， 1H， H-2'），6.39 （d， J=2.2 Hz， 1H， H-6'），4.35 （d， J=4.0 Hz，1H， H-1）， 3.85 （d，J=4.0 Hz， 1H， H-2），3.59 （s， 3H， H-13）； 13C NMR （151 MHz， Methanol-d₄） δ 175.37 （C-12）， 170.41 （C-11），149.00 （C-8），146.11 （C-7），145.61 （C-3'），145.07 （C-2'），139.66 （C-4），135.87 （C-13）， 131.28 （C-10），125.05 （C-5），123.36 （C-3），120.06 （C-5'），117.09 （C-9），117.00 （C-6），116.22 （C-4'），115.86 （C-1'）， 52.71 （C-6'）， 49.85 （C-2）， 47.19 （C-1）。对比文献数据^［23］，化合物6被鉴定为2，3-二羧基- 67-二羟基-1-（3'，4'-二羟基）苯基-1，2-二氢萘-10-甲酸甲酯。

化合物7，白色粉末，分子式为C₉H₈O₄。¹H NMR （600 MHz， Methanol-d₄） δ 7.53 （d， J=15.9 Hz，1H，H-3），7.04 （d， J=2.1 Hz， 1H， H-5），6.93 （dd， J=8.2， 2.1 Hz， 1H， H-9）， 6.78 （d，J=8.2 Hz，1H， H-8），6.22 （d，J=15.8 Hz，1H，H-2）； ¹³C NMR （151 MHz， Methanol-d₄） δ 171.04 （C-1）， 149.43 （C-7），147.04 （C-3），146.77 （C-6），127.78 （C-4），122.85 （C-9），116.47 （C-5）， 115.50 （C-2），115.07 （C-8）。对比文献数据^［24］，化合物7被鉴定为咖啡酸。

化合物8，淡黄色粉末，分子式为C₇H₆O₄。¹H NMR （600 MHz， Methanol-d₄） δ 7.44 （s， 1H， H-2），7.43 （s， 1H， H-6），6.80 （d， J=8.1 Hz， 1H， H-5）； ¹³C NMR （151 MHz， Methanol-d₄） δ 170.23 （C-7），151.52 （C-4），146.04 （C-3），123.88 （C-1），123.08 （C-6），117.70 （C-5），115.75 （C-2）。对比文献数据^［25］，化合物8被鉴定为原儿茶酸。

化合物9，褐色粉末，分子式为C₁₇H₁₂O₆。¹H NMR （600 MHz， Methanol-d₄） δ 8.27 （d，J=1.7 Hz， 1H， H-4），7.66 （d，J=1.7 Hz， 1H， H-2），7.29 （s，1H， H-9）， 7.26 （s， 1H， H-6）， 6.91-6.88 （m， 2H， H-2'， 5'）， 6.78 （dd， J=8.0，2.1 Hz， 1H， H-6'）； ¹³C NMR （151 MHz， Methanol-d₄） δ 170.94 （C-11），149.99 （C-8），148.20 （C-7），146.16 （C-4'），145.86 （C-3'），140.00 （C-1）， 133.97 （C-1'），131.69 （C-10），130.39 （C-5），129.23 （C-4），126.06 （C-3），124.65 （C-2），122.33 （C-6'），118.02 （C-2'），116.33 （C-5'），112.22 （C-6），109.38 （C-9）。对比文献数据^［26］，化合物9被鉴定为3-羧基-6，7-二羟基-1-（3 '，4 '-二羟基苯）-萘。

化合物10，淡黄色无定形粉末，分子式为C₇H₆O₃。¹H NMR （600 MHz， Methanol-d₄） δ 7.88 （d，J=8.5 Hz，2H，H-2，6），6.81 （d， J = 8.5 Hz， 2H， H-3， 5）； ¹³C NMR （151 MHz， Methanol-d₄） δ 170.21 （C-7），163.30 （C-4）， 132.98 （C-3， 5），122.87 （C-1），116.01 （C-2， 6）。对比文献数据^［27］，化合物10被鉴定为对羟基苯甲酸。

化合物11，褐色粉末，分子式为C₈H₈O₃。¹H NMR （600 MHz， Methanol-d₄） δ 7.09 （d，J=8.0 Hz，2H，H-2， 6），6.72 （d， J=8.0 Hz， 2H， H-3， 5）， 3.48 （s， 2H， H-7）； ¹³C NMR （151 MHz， Methanol-d₄） δ 176.68 （C-8），157.38 （C-4），131.31 （C-2，6），127.06 （C-1）， 116.18 （C-3， 5），41.43 （C-7）。对比文献数据^［28］，化合物11被鉴定为4-羟基苯乙酸。

2.3 化合物1-11对FFA诱导的AML12细胞MASLD模型生化指标的影响

为明确化合物1-11的最大安全浓度，本研究采用CCK8法检测0~100 μmol/L浓度范围内各化合物对AML12细胞的毒性，以细胞存活率>90%为筛选标准。结果显示，化合物6为6.25 μmol/L，化合物1、2的最大安全浓度为12.5 μmol/L；化合物4为25 μmol/L；化合物7、9为50 μmol/L；化合物3、8、10、11可达100 μmol/L（图2）。

FFA诱导的AML12细胞模型，其TC、TG、ALT、AST水平显著升高，而化合物1、5、6、7、9、11能降低AML12细胞中的TC含量（图3A，P<0.05）；化合物6、7、9能降低AML12细胞中的TG含量（图3B，P<0.05）；化合物6、9、11能降低AML12细胞中的ALT含量（图3C，P<0.05）；化合物6、9能降低AML12细胞中的AST含量（图3D，P<0.01）。综合分析表明，化合物6、9的降脂效果优于其他化合物，因而被选定为后续深入研究的候选化合物，以进一步探讨其在改善肝脂质代谢紊乱中的作用。

2.4 化合物6和化合物9改善FFA诱导的AML12细胞MASLD模型生化指标的影响

以梯度浓度的化合物6（1.5、3、6 μmol/L）和化合物9（12.5、25、50 μmol/L）干预FFA诱导的AML12细胞。结果显示，FFA刺激可显著升高AML12细胞内TC、TG、ALT、AST水平（P<0.001或P<0.0001），化合物6和化合物9均能降低FFA诱导的AML12细胞的TC、TG、AST、ALT水平，且呈剂量依赖性，高浓度干预组的改善效果最为显著（P<0.01，图4）。

2.5 化合物6和化合物9改善FFA诱导的AML12细胞MASLD模型脂滴积累的影响

模型组脂滴大小和面积显著高于对照组（P< 0.0001），表明FFA成功诱导细胞脂质积累，经化合物6和化合物9处理后，细胞内脂质堆积明显减少，且具有剂量依赖性，高浓度干预组的改善效果最为显著（P<0.001，图5），该结果与生化指标检测结果吻合。

2.6 化合物6和化合物9 缓解FFA诱导的AML12细胞MASLD模型ROS和MMP的影响

FFA刺激显著升高细胞内ROS水平（P<0.0001）并诱导MMP去极化（P<0.0001），经梯度浓度化合物6和化合物9干预后，ROS生成呈剂量依赖性下降，高浓度干预组的改善效果最为显著（P<0.001），MMP水平有所恢复，且呈剂量依赖性，高浓度干预组的改善效果最为显著（P<0.05，图6）。

3 讨论

大量研究已证实中药单体在MASLD防治方面具有巨大潜力，其中酚酸类化合物作为一类重要活性成分，受到广泛关注。多项研究表明，酚酸类化合物能通过多种机制显著改善MASLD^{［29， 30］}。根据一项横断面研究，与膳食酚酸摄入量较低的参与者相比，摄入量较高者患MASLD的风险更低^［9］，提示膳食酚酸可能对MASLD具有防治作用。本研究中分离出的11个酚酸类化合物对FFA诱导的AML12细胞生化指标的初筛结果表明，大部分酚酸类化合物都具备一定的降脂活性，而化合物6和化合物9的降脂活性较为显著。在本研究中，化合物6和化合物9均能剂量依赖性地降低FFA诱导的AML12细胞中相关生化指标TC、TG、ALT、AST含量，且能显著改善FFA诱导的AML12细胞脂滴的异常堆积。油红O 染色作为经典的中性脂质染色方法，可特异性标记细胞内甘油三酯、胆固醇酯等脂滴成分，而尼罗红染色及BODIPY荧光定量则可同时覆盖中性脂质与极性脂质的检测，三者结果一致，进一步增强了本研究结论的可靠性。

基于初步构效关系分析发现，在旋覆花分离得到的11个酚酸类化合物中，化合物6和9在降脂活性方面表现出显著优势。值得注意的是，这两个化合物在结构上均含有萘环骨架，而非传统酚酸类化合物中常见的单苯环结构，表明萘环可能是其发挥降脂活性的关键药效团，这一推测为后续针对性的结构修饰和降脂药物开发提供了重要参考。

本研究结果显示，化合物6与9可剂量依赖性地降低FFA诱导的AML12细胞内ROS水平，并缓解MMP去极化，提示其对氧化应激及线粒体功能具有调控作用。氧化应激与线粒体功能紊乱已被广泛认为是推动MASLD由单纯性脂肪肝向NASH发展的重要驱动力^［31］。氧化应激源于ROS的产生与积累之间的失衡，干扰了细胞抗氧化系统，两者失衡且抗氧化系统无法去除积累的ROS时，便会导致MASLD的发生发展^［32］。酚酸作为植物中广泛分布的次级代谢物，因其结构中含有的羟基等官能团，具有显著的抗氧化活性，能够有效清除自由基，减轻氧化损伤^［33］。本研究结果表明，化合物6与9能剂量依赖性地降低ROS水平，缓解MMP去极化。由此推测，这两种化合物的降脂作用与其维持线粒体功能稳态、减轻氧化损伤的能力密切相关。

本研究首次揭示旋覆花中部分酚酸类活性成分可调节肝脂质代谢与氧化应激，但仍存在一定局限性。MASLD是一种系统性代谢疾病，体外细胞实验难以完全模拟体内复杂环境。本研究中化合物6和化合物9为首次从旋覆花中分离纯化得到，因产量较低，无法满足动物模型实验需求，仅在体外验证其降脂及改善线粒体功能作用，未开展体内药效学研究。后续可优化提取与分离纯化工艺以提高化合物得率，为体内实验提供物质基础，并进一步明确其分子靶点与作用机制，为MASLD治疗策略奠定更为坚实的实验基础。

酚酸类化合物表现出显著的生物活性，但其吸收效率和生物利用度仍相对较低，限制了其生理功能的发挥^［34］。例如，它们不易直接被胃肠道吸收，容易降解和代谢失活^{［35， 36］}。所以，提升其生物利用度是实现有效作用的关键前提，也是当前酚酸类化合物向临床药物转化面临的主要挑战之一。

综上所述，本研究从旋覆花中分离鉴定出11种酚酸类化合物，并通过FFA诱导的AML12细胞MASLD模型筛选出化合物6与化合物9在降脂活性方面表现出最优潜力，且可能是通过抑制氧化应激并改善线粒体功能，进而发挥其降脂作用，为治疗MASLD提供了潜在的药物候选。未来研究可进一步聚焦于这两个化合物的分子靶点验证、体内药效评价及结构优化，以推动其向临床应用转化。

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