电针血清通过激活PI3K/Akt信号通路改善OGD/R模型HT22神经元突触可塑性

Serum from rats with electroacupuncture activates the PI3K/Akt signaling pathway to improve synaptic plasticity in HT22 neurons with oxygen and glucose deprivation

摘要

目的 探讨电针血清对 OGD/R 损伤HT22神经元的保护作用，并初步探索 PI3K/Akt 信号通路在其中的可能参与机制。 方法 通过公共数据库进行生物信息学分析，筛选卒中相关差异通路；在此基础上采用线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注（MCAO/R）大鼠模型，制备电针“神庭”“百会”穴血清及模型血清。体外培养HT22神经元并建立OGD/R模型后，分为对照组、模型组、电针血清组、PI3K抑制剂组（LY294002，20 μmol/L）及电针血清+PI3K抑制剂组。采用CCK-8检测细胞活力，TUNEL染色评估细胞凋亡，尼氏染色观察神经元结构变化；Western blotting检测PI3K、Akt总蛋白及其磷酸化水平（p-PI3K、p-Akt），并检测其下游相关蛋白p-mTOR/mTOR及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达变化，同时检测突触可塑性相关蛋白NMDAR1、PSD-95的表达；RT-qPCR法检测PI3K、Akt、NMDAR1、PSD-95的mRNA表达水平。 结果 与对照组相比，模型组HT22神经元活力下降、凋亡增加、尼氏体数量减少且染色变浅（P<0.05）。电针血清干预可提高细胞存活率、降低凋亡并改善神经元形态（P<0.05）；PI3K抑制剂LY294002则进一步加重神经元损伤。与电针血清组相比，电针血清+PI3K抑制剂组的保护作用有所减弱；但与单独抑制剂组相比，其细胞状态仍得到改善（P<0.05）。在分子水平上，与对照组相比，模型组HT22神经元中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR比值均降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表达亦明显下调（P<0.05）；同时，突触可塑性相关蛋白NMDAR1和PSD-95的表达亦降低（P<0.05）。电针血清能上调这些蛋白的表达，而LY294002则呈现抑制作用。电针血清+PI3K抑制剂组的蛋白表达水平介于电针血清组与抑制剂组之间。RT-qPCR检测显示，PI3K、Akt、NMDAR1及PSD-95的mRNA表达变化趋势与其相应蛋白水平一致。 结论 电针“神庭”“百会”穴血清对OGD/R所致HT22神经元损伤具有一定的保护作用，其效应可能与 PI3K/Akt 信号通路的激活及其下游相关分子的参与，并伴随突触可塑性相关分子的上调有关。

Abstract

Objective To investigate the protective effects of sera from rats receiving electroacupuncture (EA) against oxygen and glucose deprivation/reoxygenation (OGD/R) injury in HT22 neurons and explore the involvement of the PI3K/Akt signaling pathway in this protective mechanism. Methods Bioinformatics analysis was performed using public databases to identify stroke-related pathways. A rat model of middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) were treated with EA at "Shenting" and "Baihui" to prepare EA rat serum. HT22 neurons were subjected to OGD/R and treated with MCAO rat serum, EA rat serum, LY294002, or EA rat serum combined with LY294002. The changes in cell viability, apoptosis, and neuronal morphology were assessed using CCK-8 assay, TUNEL staining, and Nissl staining. Western blotting was used to detect PI3K/Akt phosphorylation and the expressions of the downstream proteins (p-mTOR/mTOR and Bcl-2) and synaptic proteins (NMDAR1 and PSD-95); the mRNA expressions of PI3K, Akt, NMDAR1, and PSD-95 were detected using RT-qPCR. Results HT22 neurons with OGD/R injury treated with MCAO rat serum showed significantly decreased cell viability, increased apoptosis, and impaired neuronal morphology, which were obviously improved following treatment with EA rat serum but aggravated after LY294002 treatment. The protective effect of EA rat serum was significantly attenuated by application of LY294002. HT22 neurons treated with MCAO rat serum showed decreased p-PI3K/PI3K, p-Akt/Akt, and p-mTOR/mTOR ratios with lowered expressions of Bcl-2, NMDAR1 and PSD-95, which were obviously upregulated by EA rat serum treatment but reduced after LY294002 treatment. The cells with the combined treatment showed intermediate expression levels of these molecules at both the mRNA and protein levels. Conclusion Serum from rats receiving EA at "Shenting" and "Baihui" shows a protective effect against OGD/R injury in HT22 neurons, mediated possibly by activation of the PI3K/Akt signaling pathway and its downstream effectors and upregulation of synaptic plasticity-related molecules.

Graphical abstract

关键词

卒中后认知障碍 / 电针血清 / PI3K/Akt / 突触可塑性 / HT22神经元

Key words

post-stroke cognitive impairment / electroacupuncture serum / PI3K/Akt / synaptic plasticity / HT22 neurons

卒中后认知障碍（PSCI）是卒中后从轻度认知损害至痴呆的一系列综合征^［1］。流行病学研究显示，约60%的卒中幸存者在1年内发生认知障碍^［2］，我国首次缺血性卒中患者的发生率高达78.7%^［3］。研究其病理机制并寻求有效干预手段具有重要意义。海马是学习和记忆的核心脑区，对缺血缺氧高度敏感，其损伤被认为是PSCI发生发展的关键环节^［4］。突触可塑性是学习和记忆的细胞学基础，突触结构完整性和信号传递效率直接决定认知水平^{［5， 6］}。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路在神经元存活和突触可塑性调控中具有核心作用，可通过促进Akt磷酸化驱动神经元生长及突触重塑^{［7， 8］}。已有研究证实，该通路在神经退行性疾病及相关认知障碍中发挥关键作用^［9-11］。

电针作为中医“通督醒神”疗法的重要手段，在改善卒中后认知障碍方面显示出良好疗效^{［12， 13］}。然而，目前多数研究仍停留于动物行为学或组织学水平，缺乏从分子通路层面对电针作用机制的直接验证。针刺效应的体内复杂性使其分子机制研究受到一定限制。近年来兴起的“针刺血清”方法为针刺机制研究提供了可行的体外验证途径，但关于其在PSCI及突触可塑性调控中的研究仍较为缺乏^［14］。前期实验表明，电针“神庭”“百会”可改善卒中大鼠认知功能，并伴随海马PI3K/Akt通路上调^［15］。基于此，本研究结合生物信息学分析与细胞实验验证，在大鼠海马HT22细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型中探讨电针血清对神经元损伤及突触可塑性的影响，并分析其作用是否与 PI3K/Akt 信号通路的激活相关，旨在为电针改善 PSCI 的潜在分子机制提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞和实验动物

HT22细胞株由武汉普诺赛公司提供。本研究共选用30只SPF级雄性SD大鼠［180~200 g，生产许可证号：SCXK（鲁）2022-0006］，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。实验动物饲养于河南中医药大学实验动物中心SPF级屏障环境中（许可证：SYXK（豫）-2021-0015）。实验操作均严格遵循国际伦理准则，并经河南中医药大学动物伦理委员会审查批准（伦理批号： IACUC-202307049）。

1.2 主要试剂和仪器

FBS胎牛血清（上海吉泰，SFP500）；DMEM无糖/含糖培养基、胰蛋白酶消化液、二甲基亚砜、尼氏染色试剂盒、高效RIPA裂解液、ECL化学发光液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝，D6540/12100、T1300、D8371、2306001、RO010、PE0010、PC0020）；LY294002（Selleck，S1105）；CCK-8试剂盒（日本同仁化学研究所，CK04）；TUNEL染色试剂盒（武汉伊莱瑞特，AK13595）；PAGE凝胶快速制备试剂盒、三色预染蛋白Marke（上海雅酶，PG212、WJ103）；PI3K抗体、HRP标记山羊抗兔二抗、HRP标记山羊抗鼠二抗（武汉三鹰，60225-1-Ig、SA00001-2、SA00001-1）；p-PI3K抗体（GeneTex，GTX132597）；Akt抗体、p-Akt抗体、mTOR抗体、p-mTOR抗体（CST，9272S、4060S、7C10、D9C2）；Bcl-2抗体（immunoway，T0470）NMDAR1抗体（Abcam，Ab174377）；PSD-95抗体（GeneTex，GTX133091）；RNA提取液、逆转录试剂盒（武汉赛维尔，G3013、G3320-05）；三气细胞培养箱（Sanyo）；超净工作台（苏州安泰）；荧光显微镜、倒置生物显微镜（NiKo）；恒温水浴锅（常州国华）；酶标仪（Thermo）；低温高速离心机（上海卢湘仪）；脱色摇床（Scilogex）；凝胶成像系统、电泳仪、快速半干转印仪（Bio-Rad）；细胞计数仪（上海睿钰）；金属浴锅（北京大龙兴创）。

1.3 KEGG通路富集分析与可视化

差异表达基因的筛选基于GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的数据集GSE202391。采用R语言DESeq2软件包对数据进行标准化与差异分析，筛选标准设定为|log₂FC|≥2且校正后P值（P.adjust）<0.05。将获得的差异基因列表导入微生信平台（https：//www.bioinformatics.com.cn）进行KEGG通路富集分析，以错误发现率（FDR）<0.05为显著性阈值，并绘制通路富集气泡图以直观展示结果。

1.4 电针血清的制备

大鼠适应性饲养1周后随机分为模型组（n=15）与电针组（n=15）。参照线栓法建立MCAO/R模型。造模成功后，电针组给予“神庭”“百会”穴电针干预（0.25 mm×13 mm针，15°斜刺2 mm，疏密波1~20 Hz，1 mA，30 min/次，1次/d，连续14 d），模型组仅予固定。干预结束后，3%戊巴比妥钠麻醉，经腹主动脉取血，室温静置30~60 min，4 ℃、2500 r/min离心15 min，取血清。各组血清分别混匀，56 ℃水浴灭活30 min，经0.22 µm滤膜除菌，分装-80 ℃保存。实验前以完全DMEM稀释至10%浓度用于细胞培养。

1.5 细胞培养

将-80 ℃冻存的HT22细胞复苏后于37 ℃、5%CO₂常规培养，每2~3 d更换新鲜完全培养基（DMEM含10%FBS）。细胞生长至80%~90%融合时进行传代：弃培养基，PBS洗涤后加入胰酶消化，镜下见细胞变圆后终止消化，离心重悬并按1∶3~1∶4比例分瓶继续培养。

1.6 OGD/R模型的建立

采用OGD/R方法模拟体外缺血再灌注损伤。造模时，将细胞培养基更换为无糖DMEM，置于三气培养箱（1%O₂、94%N₂、5%CO₂，37 ℃）孵育4 h。造模结束后，更换为相应完全培养基，转入常规条件（37 ℃、5%CO₂）继续培养24 h完成复氧。PI3K抑制剂与电针血清+PI3K抑制剂组在造模前24 h加入LY294002（20 μmol/L）进行处理。

1.7 细胞分组及干预方法

对照组：不进行OGD/R处理，常规培养于含10%模型血清的高糖DMEM培养基。模型组：OGD处理4 h，复氧阶段培养于含10%模型血清的高糖DMEM培养基。电针血清组：OGD处理4 h，复氧阶段培养于含10%电针血清的高糖DMEM培养基。PI3K抑制剂组：造模前24 h加入LY294002（20 μmol/L）预处理，OGD处理4 h后复氧阶段培养于含10%模型血清的高糖DMEM培养基。电针血清+PI3K抑制剂组：造模前24 h加入LY294002（20 μmol/L）预处理，OGD处理4 h后复氧阶段培养于含10%电针血清的高糖DMEM培养基。

1.8 CCK-8检测PI3K抑制剂LY294002最佳作用浓度

将HT22细胞接种于96孔板，培养24 h至贴壁后，分别给予不同浓度LY294002（1、5、10、20、50、100 μmol/L）处理24 h。随后更换为无糖DMEM，在缺氧条件下孵育4 h，各孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h，测定吸光度A_{450 nm}。细胞抑制率计算公式为：抑制率（%）=［（A_对照组-A_实验组）/（A_对照组-A_空白组）］×100%。

1.9 CCK-8检测HT22神经元活性

各组细胞按前述方法干预处理后，加入10 μL/孔CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h，测定吸光度A_{450 nm}。细胞存活率计算公式为：存活率（%）=［（A_实验组-A_空白组）/（A_对照组-A_空白组）］×100%。

1.10 尼氏染色

HT22细胞细胞经4%多聚甲醛固定后，依据尼氏染色试剂盒说明书进行操作：细胞经亚甲蓝染色10 min后分化，钼酸铵溶液作用3~5 min，经蒸馏水洗涤，光学显微镜下观察尼氏体形态并采集图像。

1.11 TUNEL染色

HT22细胞经4%多聚甲醛固定及0.2%~0.5% TritonX-100通透处理后，按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤进行操作：细胞在TdT酶反应液中37 ℃孵育1 h，DAPI复染细胞核后，于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.12 RT-qPCR

采用TRIzol法提取各组HT22细胞总RNA，利用NanoDrop分光光度计检测其浓度及纯度。按照试剂盒说明，将RNA逆转录为cDNA，作为后续扩增模板。实时荧光定量PCR采用SYBR Green混合体系，内参基因为GAPDH。引物由赛维尔生物科技有限公司设计合成（表1）。扩增程序包括预变性、变性、退火和延伸等步骤，共循环40次。相对表达量采用2^-ΔΔCt法进行计算。

1.13 Western blotting检测

细胞处理结束后，用预冷PBS清洗，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（RIPA∶抑制剂=100∶1），冰上裂解30 min。收集裂解液，4 ℃离心取上清。采用BCA法测定蛋白浓度。等量蛋白经SDS-PAGE分离并转膜至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。膜分别与一抗（GAPDH 1∶5000，PI3K 1∶1000，p-PI3K 1∶3000，Akt 1∶1000，p-Akt 1∶2000，mTOR 1∶1000，p-mTOR 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，NMDAR1 1∶5000，PSD-95 1∶3000）于4 ℃孵育过夜。次日TBST洗膜后，与HRP标记二抗（1∶10000）室温孵育1 h，ECL显影。条带灰度值用ImageJ软件分析，结果以目的蛋白/GAPDH比值表示相对表达量。

1.14 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，数据满足正态分布且方差齐性时，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法检验；不满足正态分布及方差齐性时，组间比价采用非参数秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生物信息学分析鉴定PI3K-Akt信号通路在卒中中的关键作用

对GEO数据集GSE202391（假手术组与脑缺血再灌注组海马组织）进行分析，差异表达基因筛选结果显示，共鉴定出956个显著差异基因（P.adjust<0.05，|logFC|≥2）。KEGG富集分析显示，这些基因显著富集于PI3K-Akt信号通路（FDR<0.05）（图1）。

2.2 PI3K抑制剂LY294002最佳作用浓度的确定

CCK-8法检测结果显示，LY294002可浓度依赖性地抑制神经元活性。其中20 μmol/L浓度下的抑制率为（48.62±1.89）%，接近半数抑制浓度（IC₅₀）。考虑到较高浓度（50、100 μmol/L）可能引起非特异性细胞毒性，后续实验选用20 μmol/L作为工作浓度（图2）。

2.3 电针血清通过PI3K/Akt信号通路缓解OGD/R诱导的HT22神经元活性下降

基于前期实验结果，本研究采用保护效应最佳的10%浓度电针血清进行干预。CCK-8检测结果显示，模型组HT22神经元存活率较对照组降低（P<0.05），OGD/R模型构建成功。与模型组相比，电针血清组HT22神经元存活率升高（P<0.05）。在PI3K抑制剂LY294002干预下，HT22神经元存活率较模型组进一步下降（P<0.05）。与单独抑制剂组比较，电针血清+PI3K抑制剂组存活率升高（P<0.05），但较电针血清组降低（P<0.05，图3）。

2.4 电针血清通过激活PI3K/Akt信号通路抑制神经元凋亡

TUNEL染色结果显示，模型组神经元凋亡率较对照组升高（P<0.05）。与模型组相比，电针血清组凋亡率下降（P<0.05）。PI3K抑制剂组HT22神经元凋亡率较模型组进一步增加（P<0.05）；与电针血清组相比，电针血清+PI3K抑制剂组凋亡率增加（P<0.05），但与单独抑制剂组相比，其凋亡率仍明显降低（P<0.05，图4）。

2.5 电针血清通过PI3K/Akt信号通路改善神经元形态结构

尼氏染色结果显示，对照组HT22神经元数量多，边界清楚，核仁清晰明显，尼氏体丰富且染色深。与对照组相比，模型组HT22神经元数量明显减少，间隙增大，尼氏体数量减少且染色变浅。电针血清组较模型组HT22神经元数量增加，间隙缩小，尼氏体增多，染色加深。PI3K抑制剂组较模型组HT22神经元数量进一步减少，间隙明显扩大，尼氏体数量减少。与电针血清组相比，电针血清+PI3K抑制剂组HT22神经元数量减少、间隙增大、尼氏体减少颜色浅，整体表现介于电针血清组和抑制剂组之间（图5）。

2.6 电针血清激活PI3K/Akt信号通路

Western blotting结果显示，模型组HT22神经元中p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt比值较对照组降低（P<0.05）。与模型组比较，电针血清组上述比值升高（P<0.05），而PI3K抑制剂组进一步降低（P<0.05）。与电针血清组比较，电针血清+PI3K抑制剂组p-PI3K/PI3K与p-Akt/Akt比值下降（P<0.05），但较单独抑制剂组仍明显升高（P<0.05，图6）。

RT-qPCR结果显示，PI3K与Akt mRNA表达的变化趋势与蛋白磷酸化水平基本一致：模型组较对照组显著降低（P<0.05）；电针血清组较模型组显著升高（P<0.05）；抑制剂组较模型组进一步降低（P<0.05）；电针血清+LY294002组较电针血清组显著降低（P<0.05），但仍高于抑制剂组（P<0.05，图7）。

检测PI3K/Akt下游相关蛋白的表达结果显示，与对照组比较，模型组HT22神经元中p-mTOR/mTOR比值及Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.05）；与模型组相比，电针血清组升高（P<0.05）；PI3K抑制剂组则进一步降低（P<0.05）；与电针血清组比较，电针血清+PI3K抑制剂组上述指标明显下降（P<0.05），但仍高于单独抑制剂组（P<0.05，图8）。

2.7 电针血清通过PI3K/Akt通路上调突触相关蛋白的表达

Western blotting结果显示，模型组HT22神经元中NMDAR1和PSD-95蛋白相对表达水平较对照组降低（P<0.05）。与模型组比较，电针血清组NMDAR1和PSD-95表达升高（P<0.05），而PI3K抑制剂组进一步降低（P<0.05）。与电针血清组比较，电针血清+PI3K抑制剂组NMDAR1和PSD-95蛋白水平下降（P<0.05），但仍高于单独抑制剂组（P<0.05，图9）。

RT-qPCR结果显示，NMDAR1和PSD-95 mRNA的表达趋势与蛋白水平基本一致：模型组较对照组降低（P<0.05）；电针血清组较模型组升高（P<0.05）；抑制剂组进一步降低（P<0.05）；电针血清+LY294002组较电针血清组下降（P<0.05），但仍高于抑制剂组（P<0.05，图10）。

3 讨论

PSCI在传统医学中属“健忘”、“呆病”范畴，其病位在脑，基本病机为气血虚衰、髓海失养、神明不用，临床多以补益气血、填精益髓、醒神开窍为主要治则^［16］。督脉为“阳脉之海”，总督一身之阳气，具有调节阴阳、补益气血、填精益髓及醒神开窍之功。其中，百会（GV20）与神庭（GV24）为督脉要穴，历来用于改善中风后遗症、记忆障碍及痴呆^{［17， 18］}。既往多项临床与基础研究表明，电针“神庭”“百会”在改善PSCI方面具有较为明确的疗效，能够减轻神经元损伤并促进认知功能恢复^{［17， 19， 20］}。然而，其分子作用机制尚未完全阐明。

电针血清作为研究电针效应的重要体外工具，已被证实可对脑缺血后的血脑屏障发挥保护作用，为探索电针治疗卒中的机制提供了关键实验依据^［21］。本课题组前期研究发现，电针血清能够在保持电针整体效应的同时，显著减轻OGD/R条件下HT22神经元的损伤^［22］。在此基础上，本研究进一步采用“电针血清+OGD/R细胞”模型，对电针改善神经元损伤的潜在分子机制进行探索。

PSCI的发生与海马神经元损伤及突触可塑性减弱密切相关^{［23， 24］}。本研究结果显示，OGD/R处理可降低HT22神经元活力、增加细胞凋亡并导致尼氏体减少，提示该模型能够较好地模拟缺血再灌注相关的神经元损伤状态。电针血清干预后，上述损伤指标得到一定程度改善，细胞存活率提高，凋亡水平下降，神经元形态结构趋于完整，这与既往体内外研究结果基本一致^{［25， 26］}。这提示电针血清能够在体外条件下反映部分电针诱导的体内效应，并表现出潜在的神经保护作用。

PI3K/Akt信号通路在缺血性脑损伤修复、神经元存活及突触可塑性调控中发挥重要作用，其激活可促进Akt磷酸化，进而调控多种下游效应分子参与细胞存活与功能维持过程 ^［27］。本研究结果表明，OGD/R损伤后PI3K与Akt磷酸化水平降低，而电针血清干预可在一定程度上提升p-PI3K/PI3K及p-Akt/Akt比值，并上调PI3K与Akt mRNA表达；当联合使用PI3K抑制剂LY294002后，电针血清的保护作用被部分削弱。进一步分析发现，OGD/R处理后p-mTOR/mTOR比值及抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平均明显下降，而电针血清干预可在一定程度上恢复上述指标；在LY294002作用下，该改善趋势受到抑制。这提示，PI3K/Akt信号通路及其相关下游分子可能共同参与电针血清对OGD/R损伤神经元的保护过程。生物信息学分析中卒中相关差异基因在PI3K/Akt通路中的富集结果，与体外实验观察在一定程度上相互印证，为该通路的潜在作用提供了支持。

神经元功能的恢复不仅依赖于存活率，还与突触结构和功能完整性密切相关。突触可塑性是学习和记忆的细胞学基础，其中NMDAR1和PSD-95是关键分子。NMDAR1是介导钙离子内流触发突触可塑性的核心受体，在长时程增强及记忆形成中发挥不可替代的作用；而PSD-95是锚定并稳定NMDAR及其他受体至突触后膜、强化信号传递的关键支架蛋白，二者协同作用共同构成了学习与记忆的分子基础^［28-30］。本研究发现，OGD/R处理显著下调HT22细胞中NMDAR1和PSD-95蛋白及mRNA表达，而电针血清干预可在一定程度上恢复其表达水平；上述结果提示，电针血清可能通过PI3K/Akt信号通路，参与调控突触可塑性相关分子的表达，从而促进神经元结构和功能的恢复。

综上所述，本研究结果表明，电针“神庭”“百会”穴血清在体外条件下可在一定程度上改善OGD/R所致HT22神经元损伤，其效应可能与PI3K/Akt信号通路的激活、下游效应分子mTOR和Bcl-2表达的变化，以及NMDAR1、PSD-95等突触可塑性相关分子的上调有关。这些发现从分子和细胞层面为“通督醒神”针刺疗法改善卒中后认知功能提供了实验依据，也为多靶点干预PSCI提供了新的研究思路。与既往多集中于行为学或组织学层面的研究相比，本研究结合生物信息学分析与体外细胞实验，从大样本数据挖掘到分子机制验证，在一定程度上补充了从宏观通路预测到体外分子验证的研究证据，为理解电针作用通路提供了实验线索。同时，通过“电针血清+OGD/R细胞”模型，提示电针诱导的体内活性因素可能在细胞水平上参与PI3K/Akt信号通路及突触可塑性相关分子的调控；在突触层面同步检测NMDAR1与PSD-95的mRNA及蛋白表达，也使相关分子变化的证据更加完整。

本研究仍存在一定局限性。首先，电针血清为多成分复合体系，其具体发挥作用的关键活性物质尚不明确；其次，HT22细胞为永生化海马神经元细胞系，难以完全反映原代神经元及体内复杂微环境；此外，缺乏体内血清回输动物模型验证，尚无法在整体水平确认其生物学效应。未来研究可结合代谢组学、蛋白质组学等多组学技术解析电针血清的物质基础，并通过遗传学干预及多通路机制分析进一步强化因果证据，同时将其作为独立干预因子回输至MCAO动物模型，结合行为学与组织学评价，从分子、细胞及整体水平系统阐释电针改善卒中后认知障碍的作用机制，为临床转化提供更充分的实验依据。

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基金资助

国家自然科学基金联合基金(U2004131)

国家自然科学基金(82174473)

国家自然科学基金(82575189)

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