丁酸缓解高脂饮食诱导肥胖小鼠艰难梭菌感染的机制研究

Butyrate alleviates Clostridium difficile infection in high-fat diet-induced obese mice

摘要

目的 研究肥胖加重艰难梭菌感染（CDI）的作用机制，探讨肠道菌群代谢产物丁酸作为替代疗法的潜在价值。 方法 利用CDI小鼠模型，分别饲喂高脂饲料和普通饲料构建肥胖CDI模型（HFD）和正常CDI模型（NCD）进行对比，同时构建体外高脂CDI模型，6只/组。通过检测小鼠肝脏、附睾白色脂肪组织质量，肝功能指标及油红O染色评估肥胖小鼠模型；超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量测定氧化应激水平；HE染色评估结肠损伤程度；RT-PCR和免疫组化检测小鼠肠黏膜屏障（ZO-1、Occludin）表达水平；RT-PCR和ELISA检测小鼠血清和粪便的艰难梭菌毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB）含量；气相色谱-质谱（GC-MS）法检测小鼠粪便中短链脂肪酸（SCFAs）含量；免疫荧光检测高脂细胞膜型的肠黏膜屏障（ZO-1、Occludin）表达水平；流式细胞术检测高脂细胞模型凋亡情况。 结果 与NCD组相比，接种后第2天，HFD组小鼠生存率下降至70%，显著低于NCD组的90%；血清TcdA和TcdB分别由7.5 ng/L和6.5 ng/L升高至15.3 ng/L和15.0 ng/L，粪便TcdA和TcdB分别由2.8l g fold和3.9l g fold升高至5.8l g fold和6.5l g fold。HFD组AST、ALT分别由2.3 U/mL和5.2 U/mL升高至9.8 U/mL和20.0 U/mL，TG、TC分别由0.6 U/mL和1.5 U/mL升高至2.9 U/mL和10.5 U/mL；粪便丁酸盐浓度由3.20±0.62 ng/mL降至1.05±0.55 ng/mL。与此同时，HFD组结肠组织损伤加重，ZO-1和Occludin表达下调，SOD降低、MDA升高。丁酸盐干预可减轻体质量下降和死亡，降低毒素负荷，改善结肠及肝脏损伤，恢复紧密连接蛋白表达并抑制细胞凋亡。FMT亦具有类似保护作用，自感染后第2天起使生存率较HFD组提高约10%，并改善肠屏障功能、肝功能损伤及氧化应激水平。上述差异均具有统计学意义（P<0.05）。 结论 高脂饮食显著加重CDI疾病进程，丁酸在改善肥胖相关CDI中具有潜在替代治疗作用。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which obesity exacerbates Clostridium difficile infection (CDI) and explore the value of gut microbiota metabolite butyrate as an alternative therapy. Methods In mouse models of high-fat diet (HFD)-induced obesity and CDI and normal diet-fed mouse models of CDI, the effect of butyrate treatment on hepatic lipid deposition and liver function was assessed using Oil Red O staining and by measuring aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase levels. Superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) of the mice were determined, and colonic injury was evaluated using HE staining. The expression levels of intestinal mucosal barrier proteins ZO-1 and occludin were detected by RT-PCR and immunohistochemistry, and the levels of C. difficile toxins A and B in mouse serum and feces were measured using RT-PCR and ELISA. The concentration of short-chain fatty acids (SCFAs) in mouse feces was determined using gas chromatography-mass spectrometry. In HCT116 cells induced by palmitic acid in the presence or absence of C. difficile, the effect of butyrate expression levels of ZO-1 and occludin were examined by immunofluorescence staining, and cell apoptosis was analyzed with flow cytometry. Results Compared with normal diet-fed mice, the HFD-fed mice with CDI had a significantly higher mortality rate and exhibited severer colonic damage, intestinal barrier function impairment and liver injury with significantly reduced fecal SCFAs concentrations. Butyrate replacement therapy markedly alleviated CDI symptoms, improved intestinal barrier function, and reduced the levels of liver injury markers. Fecal microbiota transplantation produced similar effects to butyrate and obviously alleviated CDI symptoms and increased fecal SCFAs concentrations in the mouse models. Conclusion HFD significantly exacerbates the progression of CDI in mice, and butyrate shows the potential as an alternative therapy for improving obesity-associated CDI.

Graphical abstract

关键词

艰难梭菌感染 / 肥胖 / 丁酸 / 肠道屏障 / 粪便移植

Key words

Clostridium difficile infection / obesity / butyrate / intestinal barrier / fecal microbiota transplantation

艰难梭菌（CD）是一种通过粪口途径传播的细菌，孢子在肠道内释放毒素，损伤肠上皮细胞，导致严重的炎症反应和腹泻。艰难梭菌感染（CDI）是最常见的医院获得性感染之一。美国每年约有12万例病例，其中约2.9万例死亡^［1］。肥胖与严重CDI相关，研究显示CDI患者中体质量指数（BMI）超过25 kg/m²的人群比例为31%，高于健康人群的21%^{［2， 3］}。BMI超过35 kg/m²是重度CDI的独立预测因子^［3］，而BMI大于40 kg/m²与院内死亡率增高相关^［4］。肥胖个体常伴有肠道代谢物紊乱，表现为抗炎菌群丰度降低、促炎菌群丰度上升和肠道黏膜炎症反应加重^［5-9］。口服万古霉素常用于接受全身性抗生素治疗CDI患者的一级、二级预防，但万古霉素会促进耐药菌产生及破坏肠道菌群稳态，增加CDI复发风险^［10］，因此美国胃肠病学会（ACG）仅以低质量证据推荐口服万古霉素作为治疗手段。

研究表明，稳定的肠道共生菌群可通过菌群相互作用抑制CD孢子萌发 ^［11］；菌群失衡的个体发生条件致病菌过度生长的风险显著增加^{［12，13］}。典型的高脂、低纤维的西方型饮食模式可通过减少肠道菌群丰度降低短链脂肪酸（SCFAS）加重CDI病情^{［14，15］}。SCFAs是膳食纤维经肠道微生物发酵产生代谢产物，主要包括乙酸、丙酸和丁酸^［16］。丁酸是结肠上皮细胞的主要能量来源，能够维持肠道屏障功能的完整性^［13-15］。此外，丁酸激活线粒体β-氧化及调过氧化物酶体增殖物激活受体γ，调节结肠细胞的氧扩散，维持结肠低氧条件，从而稳定肠道菌群及结肠微环境^［17］。一项针对复发性艰难梭菌感染（rCDI）的回顾性研究分析指出，预后良好的rCDI患者在接受菌移植（FMT）治疗后的产丁酸菌群相对丰度较高，而预后较差的rCDI患者产丁酸菌群则普遍耗尽^［18］。

因此我们推测，高热量、高脂肪、低膳食纤维的饮食导致的肥胖状态可能通过降低产SCFAs菌群促进艰难梭菌的定植与感染环境的形成，但其具体机制尚不明确。已有研究证实补充丁酸对多种疾病具有良好的保护和缓解作用^［19］，但关于丁酸调节高脂饮食诱导肥胖状态的肠道菌群及结肠稳态的研究仍较有限。本研究旨在探讨高脂饮食诱导肥胖加重CDI的机制，并评估丁酸缓解肥胖小鼠CDI症状的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

选取6~8周龄健康雄性BALB/c小鼠，由广东药康生物科技有限公司提供，饲养于SPF级动物房，自由摄食和饮水。所有动物实验均符合广州医科大学实验动物伦理规定，并经广州医科大学动物伦理委员会批准（伦理批号：ES-2024-K061-01）。

1.1.2 实验菌株与细胞

艰难梭菌C.difficile VPI 10463菌株（ATCC 43255）；人结肠癌细胞HCT116。

1.1.3 主要试剂和仪器

环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂培养基、脑心浸液培养基、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒及丙二醛（MDA）试剂盒（索莱宝）；甘油三酯（TG）试剂盒、总胆固醇（TC）试剂盒、天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒及丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（Sigma-Aldrich）；TRIzol试剂（Takara）；cDNA合成试剂盒和SYBR荧光定量PCR试剂盒（艾科瑞）；艰难梭菌毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB）ELISA试剂盒（博深生物）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（联科生物）；DAB显色试剂盒及免疫组化二抗试剂盒（中杉金桥），ZO-1抗体、Occludin抗体、Bax抗体及Bcl-2抗体（Abcam）；荧光二抗CoraLite488（Proteintech）；卡那霉素、庆大霉素、多黏菌素、甲硝唑及万古霉素、棕榈酸、丁酸钠（Sigma-Aldrich）；SpectraMax M4酶标仪（Molecular Devices）；GCMS-Trace1310/ISQ LT气相色谱-质谱联用仪（Thermo Fisher Scientific）；BX53F正置显微镜及荧光显微镜（Olympus）；流式细胞仪（BD Biosciences）。

1.2 实验方法

1.2.1 CD菌种

选取C.difficile VPI 10463菌株接种于环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂培养基，在厌氧条件下37 ℃培养48 h。随后接种于脑心浸液培养基，37 ℃培养24 h，培养后的菌液稀释至1×10⁸ CFU，用于制备小鼠CDI模型。

1.2.2 小鼠CDI模型的建立及分组处理

将小鼠随机分为4组（n=6）：正常饮食组（NCD组），饲喂含脂肪热量占比13.5%的标准饲料（TP23302）连续12周，CDI感染周期，该组小鼠每日经口给予PBS持续12 d；高脂饮食组（HFD组），饲喂脂肪热量占比60%的高脂饲料（D12451）连续12周，CDI感染周期，该组小鼠每日经口给予PBS持续12 d；丁酸治疗组（BT组）。饲喂同HFD，CDI感染周期每日经口给予50 mmol/L丁酸溶液持续12 d^［20］；FMT组。饲喂同HFD，CDI建模开始时每日接受粪菌悬液干预持续12 d。

CDI小鼠建模方法如下：小鼠连续3 d饮用抗生素混合液：卡那霉素（0.4 mg/mL）、庆大霉素（0.035 mg/mL）、多黏菌素（850 U/mL）、甲硝唑（0.215 mg/mL）、万古霉素（0.045 mg/mL）。随后饮用无菌水2 d。第6天腹腔注射克林霉素（10 mg/kg）。第7天灌胃接种含1×10⁸ CFU VPI 10463株的菌悬液1次。粪菌悬液制备方法：将6~8周龄健康小鼠单笼饲养，收集离体新鲜粪便制备粪菌悬液，50 mg新鲜粪便，加入1.5 mL PBS混悬，浸泡5 min，1000 g 4 ℃离心4 min，取上清细菌悬液灌胃，200 μL/次，2次/d。

1.2.3 细胞高脂模型构建

HCT116细胞接种于含10%胎牛血清及1%青链霉素的 RPMI 1640培养基中，于37 ℃、5%CO₂条件下培养。当细胞融合率达到80%时，将细胞接种于6孔板中，在含或不含1∶500 C. difficile 菌液上清的条件下，加入250 μmol/L 棕榈酸处理24 h，建立细胞高脂模型^［21］。

1.2.4 油红O染色检测肝组织脂质沉积

各组实验小鼠处死后，取肝组织样本，制备厚度为8 μm的切片，浸置于油红O染液中染色10 min，随后依次浸入2次60%异丙醇中分化处理，时间分别为3、5 s，苏木精复染3 min，甘油明胶封片，显微镜下观察评估肝组织脂质沉积。

1.2.5 血清生化指标检测

实验结束时采集各组小鼠血清样本，根据说明书步骤检测TG、TC、AST、ALT、SOD及MDA水平，经SpectraMax M4 酶标仪测定A值：510 nm（TG、TC）、340 nm（AST、ALT）、450 nm（SOD）、532 nm（MDA）。

1.2.6 HE染色评估结肠组织形态结构

取小鼠结肠组织，经4%多聚甲醛（DF0135，北京雷根生物技术有限公司）固定过夜，随后依次经过脱水、石蜡包埋和切片。小鼠结肠组织石蜡切片（4 μm）经二甲苯脱蜡2次，10 min/次，梯度乙醇（100、95、75%）依次脱蜡各5 min，PBS溶液冲洗3 min，苏木素染色液染色5 min，PBS溶液冲洗10 s，酸性乙醇分化2 s，PBS溶液冲洗10 s，伊红染色液染色20 s，PBS溶液冲洗1 min，梯度乙醇脱水（75、95、100%）依次脱水各5 min，二甲苯脱水2次，10 min/次，进行苏木素-伊红染色（HE），封片后在光学显微镜下观察并拍照。

1.2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测艰难梭菌毒素水平

收集小鼠血浆检测艰难梭菌毒素A（TcdA）和毒素B（TcdB）的水平。简要步骤如下：将待测样本、标准品及辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体依次加入预包被抗体的酶标板孔中，37 ℃恒温箱温育后，反复洗板3次；随后加入底物 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺显色。终止反应后，根据标准曲线计算样本中TcdA与TcdB的浓度。

1.2.8 RT-PCR检测小鼠结肠黏膜屏障相关基因相对表达水平

利用TRIzol试剂提取小鼠结肠组织总RNA。取500 ng 总RNA，使用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA。利用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行RT-PCR扩增。以GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。相关引物序列详见表1，所有引物均由擎科生物合成。

1.2.9 气相色谱-质谱（GC-MS）法检测SCFAs含量

收集各组小鼠的新鲜粪便样品，用于SCFAs检测，方法如本课题组先前所述^［22］。称取200 mg小鼠盲肠内容物，加入2 mL超纯水，置于4 mL离心管中，在4 ℃、13 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，加入10 μL50%硫酸、0.5 g硫酸钠和2 mL无水乙醚混匀，6000 r/min离心10 min，取上清液，加入50 μL 2-二乙基丁酸9.2 mg/mL内标。采用GCMS-Trace1310/ISO LT型气相色谱-质谱联用仪进行定量分析。

1.2.10 免疫组化（IHC）检测肠黏膜屏障及细胞凋亡

小鼠结肠组织石蜡切片（4 μm）经二甲苯脱蜡2次，10 min/次，梯度乙醇（100、95、75%）依次脱蜡各5 min，柠檬酸钠抗原修复10 min，10%血清白蛋白封闭1 h后，于4 ℃条件下孵育，一抗过夜孵育，次日经二抗孵育1 h，加入DAB溶液染色处理，脱水封片后使用奥林巴斯BX53F型显微镜进行观察并拍照。滴加一抗包括：ZO-1（稀释比例1∶100）、Occludin（稀释比例1∶100）、Bax（稀释比例1∶250）、Bcl-2（稀释比例1∶500）。

1.2.11 免疫荧光（IF）检测体外黏膜屏障相关蛋白表达

收集待测细胞后用PBS冲洗细胞3次，4%甲醛固定细胞10 min，1% Triton X-100于室温渗透细胞20 min，10%山羊血清室温孵育1 h，一抗4 ℃孵育过夜，荧光二抗室温孵育1 h，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核3 min，在奥林巴斯BX53F型显微镜观察并采集图像。滴加一抗包括：ZO-1（稀释比例1∶100）、Occludin（稀释比例1∶100）（Abcam）。滴加荧光二抗：CoraLite488（稀释比例1∶500）（Proteintech）。

1.2.12 流式细胞术检测细胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行检测，大致步骤如下：将HCT116细胞置于含20%小鼠血清的DMEM培养基中孵育20 h，收集细胞离心沉淀后，依次经Annexin V-FITC和碘化丙锭（PI）染色，BD Biosciences流式细胞仪检测和分析细胞凋亡情况。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件及GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析；变量间相关性采用Spearman等级相关系数分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HFD加重肥胖小鼠CDI症状

将雄性BALB/c小鼠随机分为2组，分别给予高脂饮食（HFD）或正常饮食（NCD）饲喂12周（图1A）。饮食干预结束后，HFD组的小鼠脂肪质量增加（图1B）。感染初期（前2 d），两组小鼠均出现腹泻和体质量下降，但HFD组体质量下降幅度显著高于NCD组（图1C）。接种后第2天，HFD组小鼠生存率下降至70%，显著低于NCD组的90%（图1E）。组织学显示，与NCD组相比，HFD组小鼠结肠组织损伤更为明显，表现为黏膜下水肿、上皮损伤及炎症细胞浸润增加（图1D）。HFD组小鼠增加血清和粪便的C. difficile负荷（P<0.01，图2A、B）。油红O染色结果显示，HFD组肝细胞可见大量脂滴，而NCD组肝组织脂肪分布正常，无明显脂滴浸润（图1F）。肝功能损伤指标AST和ALT水平在HFD组相较于NCD组明显升高（P<0.01，图2C）。此外，HFD组血清TG和TC浓度较NCD组升高（P<0.01，图2D）。同时附睾白色脂肪组织（eWAT）和肝脏质量均高于NCD组（P<0.01，图2E）。同时，与NCD组相比，HFD组SOD水平降低，而MDA水平升高（P<0.01，图2F）。

2.2 高脂饮食加重CDI小鼠肠黏膜屏障损伤

与NCD组相比，HFD组小鼠结肠组织中ZO-1及Occludin表达水平均下降（P<0.05，图3A），mRNA检测结果进一步支持了这一发现（P<0.01，图3B）。对小鼠粪便SCFAs水平进行检测发现，与NCD组相比，HFD组粪便中3种主要SCFAs的浓度降低。其中，丁酸盐浓度在HFD组（1.05±0.55 ng/mL）仅为NCD组（3.20±0.62 ng/mL）的一半（P<0.05，图3C）。

2.3 丁酸盐缓解HFD诱导的严重CDI症状

在高脂饮食模型基础上给予50 mmol/L丁酸盐灌胃处理（图4A）。与HFD组相比，BT组小鼠体质量下降幅度减小、死亡率降低（图4C、D）。HE染色结果提示，丁酸盐改善了CDI小鼠肠道损伤，表现为上皮结构完整，炎症细胞浸润减轻（图4B）。丁酸盐处理降低C. difficile负荷，其血清及粪便中毒素含量明显下降（P<0.01，图5A、B）。油红O染色染色结果显示，丁酸盐减少了肝组织脂质沉积及脂滴体积（图4E），AST和ALT水平亦降低（P<0.01，图5C）。此外，丁酸盐处理可明显降低TG和TC水平（P<0.05，图5D）。在组织质量方面，BT组小鼠较HFD组肝脏质量降低，而eWAT质量无显著变化（图5E）。与HFD组相比，丁酸盐处理小鼠血清中SOD水平升高，MDA水平降低（P<0.01，图5F）。

2.4 丁酸盐治疗修复HFD诱导CDI小鼠肠黏膜屏障

BT组较HFD组，ZO-1及Occludin表达水平升高（P<0.05，图6A）。凋亡相关蛋白Bax的表达降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平升高（P<0.01，图6B），mRNA检测结果与蛋白水平变化趋势一致（图7A、B）。此外，对小鼠粪便SCFAs水平进行检测，结果表明，丁酸盐处理提高了粪便中丁酸盐含量（P<0.05，图7C）。

2.5 丁酸盐减轻高脂细胞模型凋亡

免疫荧光染色结果显示，丁酸盐处理后细胞中紧密连接蛋白ZO-1及Occludin表达水平升高，这与小鼠结肠组织中观察到的结果一致（图8A、B）。为准确评估细胞凋亡情况，采用PI-FITC染色检测，结果显示丁酸盐处理降低了HCT116细胞的凋亡水平（图8C）。

2.6 粪菌移植缓解高脂饮食加重CDI小鼠症状

本研究在HFD诱导CDI模型小鼠中予FMT干预（图9A），与HFD组相比，FMT组小鼠的体质量下降和生存率降低在疾病早期更为明显（图9C、D），但在艰难梭菌接种后的第2天起，FMT组小鼠的生存率较HFD组提高了约10%。组织病理学结果提示，HFD组小鼠结肠出现明显的腺体结构破坏与炎症反应；FMT处理后腺体结构恢复、炎症减轻、上皮完整性增加及杯状细胞数量增多（图9B）。此外，FMT处理降低了血清及粪便中艰难梭菌毒素负荷（P<0.01， 图10A、B）。油红O染色结果表明，FMT组小鼠肝脏脂质明显减少（图9E）。肝功能检测结果显示，FMT组AST和ALT水平降低（P<0.01，图10C）。与治疗前相比，FMT处理后小鼠血清TG和TC水平均下降（P<0.01，图10D）。尽管两组之间eWAT质量差异无统计学意义，但FMT组小鼠肝脏质量下降（P<0.01，图10E）。在氧化应激方面，FMT处理提高了SOD水平，并显著降低了MDA水平（P<0.01， 图10F）。

2.7 FMT通过促进紧密连接修复缓解HFD诱导的CDI

FMT处理增强了肠黏膜上皮ZO-1和Occludin的表达，促进了受损紧密连接的修复（P<0.01， 图11A），其mRNA水平变化趋势一致（P<0.05， 图12A）。检测小肠上皮细胞凋亡情况发现，FMT处理后凋亡相关标志蛋白Bax的表达降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平升高（P<0.05， 图11B、图12B）。对小鼠粪便SCFAs含量进行检测发现，FMT提高了丁酸盐水平，同时乙酸盐和丙酸盐也有轻度升高（P<0.05， 图12C）。

3 讨论

既往研究表明肥胖与CDI风险增加相关^［2-4］，其病理特征包括毒素产生及严重的结肠损伤。然而，直接验证这一关联的研究尚相对有限。本研究表明，HFD诱导的肥胖可显著加重小鼠CDI的症状，表现为死亡率升高、结肠组织结构严重破坏、肠屏障功能受损、肝功能损伤及氧化应激水平升高。值得注意的是，补充丁酸能够有效缓解上述症状，其机制可能与降低细菌负荷、修复肠屏障功能、改善肝功能、降低氧化应激有关。此外，FMT取得了与丁酸盐相似的治疗效果，进一步支持粪菌移植在肥胖合并CDI治疗中的潜力。

既往研究发现，HFD引起的线粒体功能障碍导致氧化应激，破坏维持肠道稳态 ^［23］，同时促使结肠细胞发生代谢重编码，诱导结肠细胞线粒体转向长链脂肪酸呼吸，产生更多脂多糖促进氧化应激 ^［24］。另有研究指出HFD中的饱和脂肪酸与脂多糖具有结构相似性，能够以 TLR4 依赖的方式激活 NFκB 信号通路的方式增强肠道通透性^［25］。本研究同样发现高脂膳食导致肥胖模式诱导全身炎症反应、肠道菌群失衡、及肠屏障功能障碍密切相关，与疾病发生发展密切相关。

从治疗角度来看，富含丁酸盐的肠道环境能够缓解艰难梭菌感染的进一步发展^［17-19］。虽然有研究表明将小鼠从低纤维饮食切换到高纤维饮食，艰难梭菌负荷得到抑制的同时，粪便中可检测到的艰难梭菌毒素增加，这可能与肠道炎症反应引起短暂性增加相关^［26］。既往研究证实丁酸盐通过抑制艰难梭梭菌生长，仍能总体上抑制毒素释放与孢子形成发挥治疗作用^［26］。体外研究表明，丁酸盐能够被艰难梭菌主动摄取并转化为丁酰辅酶A，进而扰乱胞内辅酶A与氧化还原平衡，导致对数期生长显著受抑^{［27， 28］}。并且，丁酸盐特异性上调Cwp19与TcdE，驱动Cwp19介导的细胞自溶与TcdE介导的艰难梭菌毒素（TcdA/TcdB）的释放^{［28， 29］}。丁酸盐一方面艰难梭菌菌群的生长强抑制效应更具决定性，从而使总体毒素负荷与孢子总产量呈下降趋势^［26］；但另一方面其在艰难梭菌单菌层面促进毒素释放与孢子形成。有研究发现，外源性丁酸盐可促进艰难梭菌活孢子产量且诱导孢子发育σ因子（SigE、SigF、SigG、SigK）的系统性上调^{［28， 30］}。丁酸盐的双重作用仍有待于进一步深入研究。

本研究加深了对肥胖、肠道菌群失衡及CDI发病机制之间相互作用的认识。通过在肥胖模型中验证丁酸盐缓解CDI症状的作用，本研究为肥胖人群中CDI的防治提供了新的治疗思路。本研究结果提示，丁酸盐不仅能够恢复高脂细胞模型和高脂饮食诱导的肥胖小鼠的肠道屏障功能，还可降低其氧化应激水平、肝损伤程度、炎症细胞浸润水平和高脂细胞模型的凋亡水平。同时，FMT在改善CDI方面的疗效也强调了肠道菌群恢复在疾病管理中的重要性，特别是在促进SCFAs产生方面的作用。

尽管本研究揭示了丁酸盐及FMT在肥胖患者CDI治疗中的显著潜力，但仍存在一定局限性。首先，本研究未监测HFD诱导的CDI小鼠在干预初期是否存在一过性的艰难梭菌毒素表达水平升高或孢子增加的情况，对于丁酸在缓解肥胖CDI患者病程进展的肠道菌群及免疫反应调节的具体分子机制尚待深入探讨作用机制^［31-34］。此外，丁酸在不同人群中的最佳剂量、给药时机、给药形式、长期安全性亦需进一步研究^［35-38］。对于聚焦于鉴定不同个体SCFAs生成的优势菌株，定制个性化菌群治疗方案奠定重要基础。

综上所述，本研究表明高脂饮食可加重肥胖小鼠CDI的病情，其机制可能与肠道稳态破坏及细菌负荷增加有关。丁酸盐干预能够通过修复黏膜屏障完整性、减轻炎症反应及缓解肝脏损伤，显著改善肠道健康状况。此外，FMT同样可通过提高SCFAs的产生及增强紧密连接蛋白的表达来恢复肠道功能。上述结果提示，丁酸盐及FMT有望作为减轻CDI严重程度的潜在治疗策略，尤其适用于肥胖人群；同时亦提示需进一步研究其在临床中的应用价值与可行性。

参考文献

[1] Turner NA, Anderson DJ. Hospital infection control: Clostridioides difficile [J]. Clin Colon Rectal Surg, 2020, 33(2): 98-108. doi：10.1055/s-0040-1701234

[2] Bishara J, Farah R, Mograbi J, et al. Obesity as a risk factor for Clostridium difficile infection[J]. Clin Infect Dis, 2013, 57(4): 489-93. doi：10.1093/cid/cit280

[3] Mulki R, Baumann AJ, Alnabelsi T, et al. Body mass index greater than 35 is associated with severe Clostridium difficile infection[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2017, 45(1): 75-81. doi：10.1111/apt.13832

[4] Nathanson BH, Higgins TL, McGee WT. The dangers of extreme body mass index values in patients with Clostridium difficile [J]. Infection, 2017, 45(6): 787-93. doi：10.1007/s15010-017-1036-x

[5] Le Chatelier E, Nielsen T, Qin JJ, et al. Richness of human gut microbiome correlates with metabolic markers[J]. Nature, 2013, 500(7464): 541-6.

[6] Turnbaugh PJ, Hamady M, Yatsunenko T, et al. A core gut microbiome in obese and lean twins[J]. Nature, 2009, 457(7228): 480-4. doi：10.1038/nature07540

[7] Cotillard A, Kennedy SP, Kong LC, et al. Dietary intervention impact on gut microbial gene richness[J]. Nature, 2013, 500(7464): 585-8. doi：10.1038/nature12738

[8] Boulangé CL, Neves AL, Chilloux J, et al. Impact of the gut microbiota on inflammation, obesity, and metabolic disease[J]. Genome Med, 2016, 8(1): 42. doi：10.1186/s13073-016-0303-2

[9] Kelly CR, Fischer M, Allegretti JR, et al. ACG clinical guidelines: prevention, diagnosis, and treatment of Clostridioides difficile infections[J]. Am J Gastroenterol, 2021, 116(6): 1124-47. doi：10.14309/ajg.0000000000001278

[10] Chiu CW, Tsai PJ, Lee CC, et al. Application of microbiome management in therapy for Clostridioides difficile infections: from fecal microbiota transplantation to probiotics to microbiota-preserving antimicrobial agents[J]. Pathogens, 2021, 10(6): 649. doi：10.3390/pathogens10060649

[11] de Vos WM, Tilg H, Van Hul M, et al. Gut microbiome and health: mechanistic insights[J]. Gut, 2022, 71(5): 1020-32. doi：10.1136/gutjnl-2021-326789

[12] Qin JJ, Li YR, Cai ZM, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes[J]. Nature, 2012, 490(7418): 55-60.

[13] Fei N, Zhao LP. An opportunistic pathogen isolated from the gut of an obese human causes obesity in germfree mice[J]. ISME J, 2013, 7(4): 880-4. doi：10.1038/ismej.2012.153

[14] Hazleton KZ, Martin CG, Orlicky DJ, et al. Dietary fat promotes antibiotic-induced Clostridioides difficile mortality in mice[J]. NPJ Biofilms Microbiomes, 2022, 8(1): 15. doi：10.1038/s41522-022-00276-1

[15] Mefferd CC, Bhute SS, Phan JR, et al. A high-fat/high-protein, atkins-type diet exacerbates Clostridioides (Clostridium) difficile infection in mice, whereas a high-carbohydrate diet protects[J]. mSystems, 2020, 5(1): e00765-19. doi：10.1128/msystems.00765-19

[16] Blaak EE, Canfora EE, Theis S, et al. Short chain fatty acids in human gut and metabolic health[J]. Benef Microbes, 2020, 11(5): 411-55. doi：10.3920/bm2020.0057

[17] Litvak Y, Byndloss MX, Bäumler AJ. Colonocyte metabolism shapes the gut microbiota[J]. Science, 2018, 362(6418): eaat9076. doi：10.1126/science.aat9076

[18] Tian HL, Cui JQ, Ye C, et al. Depletion of butyrate-producing microbes of the Firmicutes predicts nonresponse to FMT therapy in patients with recurrent Clostridium difficile infection[J]. Gut Microbes, 2023, 15(1): 2236362. doi：10.1080/19490976.2023.2236362

[19] Stoeva MK, Garcia-So J, Justice N, et al. Butyrate-producing human gut symbiont, Clostridium butyricum, and its role in health and disease[J]. Gut Microbes, 2021, 13(1): 1907272. doi：10.1080/19490976.2021.1907272

[20] Wang SQ, Xiang LY, Li F, et al. Butyrate protects against Clostridium difficile infection by regulating bile acid metabolism[J]. Microbiol Spectr, 2023, 11(4): e04479-22. doi：10.1128/spectrum.04479-22

[21] Fachi JL, de Souza Felipe J, Pral LP, et al. Butyrate protects mice from Clostridium difficile-induced colitis through an HIF-1-dependent mechanism[J]. Cell Rep, 2019, 27(3): 750-61.e7. doi：10.1016/j.celrep.2019.03.054

[22] Wang SQ, Lv D, Jiang SH, et al. Quantitative reduction in short-chain fatty acids, especially butyrate, contributes to the progression of chronic kidney disease[J]. Clin Sci, 2019, 133(17): 1857-70. doi：10.1042/cs20190171

[23] Qiu JX, Ma YH, Qiu J. Regulation of intestinal immunity by dietary fatty acids[J]. Mucosal Immunol, 2022, 15(5): 846-56. doi：10.1038/s41385-022-00547-2

[24] Sun PH, Wang ML, Liu YX, et al. High-fat diet-disturbed gut microbiota-colonocyte interactions contribute to dysregulating peripheral tryptophan-kynurenine metabolism[J]. Microbiome, 2023, 11(1): 154. doi：10.1186/s40168-023-01606-x

[25] Schaeffler A, Gross P, Buettner R, et al. Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappaB pathway in adipocytes links nutritional signalling with innate immunity[J]. Immunology, 2009, 126(2): 233-45. doi：10.1111/j.1365-2567.2008.02892.x

[26] Hryckowian AJ, Van Treuren W, Smits SA, et al. Microbiota-accessible carbohydrates suppress Clostridium difficile infection in a murine model[J]. Nat Microbiol, 2018, 3(6): 662-9. doi：10.1038/s41564-018-0150-6

[27] Pensinger DA, Fisher AT, Dobrila HA, et al. Butyrate differentiates permissiveness to Clostridioides difficile infection and influences growth of diverse C. difficile isolates[J]. Infect Immun, 2023, 91(2): e00570-22. doi：10.1128/iai.00570-22

[28] Pensinger DA, Dobrila HA, Stevenson DM, et al. Exogenous butyrate inhibits butyrogenic metabolism and alters virulence phenotypes in Clostridioides difficile [J]. mBio, 2024, 15(3): e02535-23. doi：10.1128/mbio.02535-23

[29] Karlsson S, Lindberg A, Norin E, et al. Toxins, butyric acid, and other short-chain fatty acids are coordinately expressed and down-regulated by cysteine in Clostridium difficile [J]. Infect Immun, 2000, 68(10): 5881-8. doi：10.1128/iai.68.10.5881-5888.2000

[30] Baldassare MA, Bhattacharjee D, Coles JD, et al. Butyrate enhances Clostridioides difficile sporulation in vitro [J]. J Bacteriol, 2023, 205(9): e00138-23. doi：10.1128/jb.00138-23

[31] Li GF, Lin J, Zhang C, et al. Microbiota metabolite butyrate constrains neutrophil functions and ameliorates mucosal inflammation in inflammatory bowel disease[J]. Gut Microbes, 2021, 13(1): 1968257. doi：10.1080/19490976.2021.1968257

[32] Salvi PS, Cowles RA. Butyrate and the intestinal epithelium: modulation of proliferation and inflammation in homeostasis and disease[J]. Cells, 2021, 10(7): 1775. doi：10.3390/cells10071775

[33] Zhou D, Pan Q, Xin FZ, et al. Sodium butyrate attenuates high-fat diet-induced steatohepatitis in mice by improving gut microbiota and gastrointestinal barrier[J]. World J Gastroenterol, 2017, 23(1): 60-75. doi：10.3748/wjg.v23.i1.60

[34] Coppola S, Avagliano C, Calignano A, et al. The protective role of butyrate against obesity and obesity-related diseases[J]. Molecules, 2021, 26(3): 682. doi：10.3390/molecules26030682

[35] Luceri C, Femia AP, Fazi M, et al. Effect of butyrate enemas on gene expression profiles and endoscopic/histopathological scores of diverted colorectal mucosa: a randomized trial[J]. Dig Liver Dis, 2016, 48(1): 27-33. doi：10.1016/j.dld.2015.09.005

[36] Barnes D, Ng K, Smits S, et al. Competitively selected donor fecal microbiota transplantation: butyrate concentration and diversity as measures of donor quality[J]. J Pediatr Gastroenterol Nutr, 2018, 67(2): 185-7. doi：10.1097/mpg.0000000000001940

[37] Facchin S, Vitulo N, Calgaro M, et al. Microbiota changes induced by microencapsulated sodium butyrate in patients with inflammatory bowel disease[J]. Neurogastroenterol Motil, 2020, 32(10): e13914. doi：10.1111/nmo.13914

[38] Cao SJ, Budina E, Raczy MM, et al. A serine-conjugated butyrate prodrug with high oral bioavailability suppresses autoimmune arthritis and neuroinflammation in mice[J]. Nat Biomed Eng, 2024, 8(5): 611-27. doi：10.1038/s41551-024-01190-x

基金资助

国家自然科学基金青年项目(82500630)

广东省基础与应用基础研究基金省市联合基金(2023A1515110161)

广州市科学技术局基础研究计划基础与应用基础研究专题项目(2024A04J3537)

广州市科技局基础研究计划市校（院）联合资助“登峰医院”项目(2024A03J1145)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021