天麻素经P53/SLC7A11/GPX4信号轴抑制神经元铁死亡减轻高原低压缺氧性脑损伤

Gastrodin alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury in rats by reducing neuronal ferroptosis via the P53/SLC7A11/GPX4 signaling axis

摘要

目的 研究天麻素（GAS）对高原低压缺氧（HH）性脑损伤的神经保护作用，并探讨其机制是否与调节P53/SLC7A11/GPX4信号通路、抑制神经元铁死亡相关。 方法 体内实验选取24只成年SD大鼠，随机分为4组（n=6）：常压常氧对照组（Nor）、低压缺氧模型组（HH）、天麻素低剂量组（HH+GAS-L，100 mg/kg）、天麻素高剂量组（HH+GAS-H，200 mg/kg）。除对照组外，其余各组大鼠置于模拟海拔6000 m的低压氧舱中持续暴露24 h以建立HH模型。天麻素于造模后腹腔给药，1次/d。取第7天的脑皮层进行Western blotting检测P53、SLC7A11及GPX4蛋白表达，同时测定组织内活性氧标志物（DHE）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）及亚铁离子（Fe²⁺）的含量。体外培养HT22神经元，分为：对照组（Control）、模型组（OGD）、天麻素干预组（OGD+GAS，500 μmol/L）、P53激动剂组（OGD+Nutlin-3，10 μmol/L）及联合处理组（OGD+GAS+Nutlin-3）。检测指标包括铁死亡相关蛋白表达、细胞内活性氧（DCFH-DA）、脂质过氧化（BODIPY-C11）、MDA、GSH、细胞存活率（CCK-8）、线粒体膜电位（JC-1）及亚铁离子（FerroOrange）。 结果 动物实验显示，与HH组相比，天麻素显著抑制P53表达，上调SLC7A11与GPX4蛋白水平（P<0.05），并显著降低脑皮层组织Fe²⁺、ROS和MDA含量，提高GSH水平（P<0.05）。细胞实验结果一致，天麻素有效减轻低压缺氧诱导的铁死亡，表现为P53表达下降，SLC7A11与GPX4表达升高（P<0.05），细胞内ROS生成、脂质过氧化和Fe²⁺蓄积被抑制，同时GSH含量、细胞活性和线粒体膜电位显著恢复（P<0.05）。而使用Nutlin-3激活P53信号通路后，天麻素的保护作用被明显逆转（P<0.05）。 结论 天麻素可能通过调控P53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制神经元铁死亡，从而对高原低压缺氧性脑损伤发挥神经保护作用。

Abstract

Objective To investigate the neuroprotective effect of gastrodin (GAS) against hypobaric hypoxia (HH)-induced brain injury in rats and the underlying mechanism. Methods Twenty-four adult SD rats were randomized equally into normoxic control group, HH model group, low-dose (100 mg/kg) GAS group (HH+GAS-L group), and high-dose (200 mg/kg) GAS group (HH+GAS-H group). In the latter 3 groups, the rats were exposed to HH in a hypobaric oxygen chamber for 24 h to simulate the condition at an altitude of 6000 m, and GAS was administered intraperitoneally once daily for 7 days. Cerebral cortex tissues were collected for analysis of P53, SLC7A11, and GPX4 protein expressions using Western blotting and for determination of the levels of reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH), and ferrous ion (Fe²⁺). In cultured HT22 neurons exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD), the effects of GAS (500 μmol/L), nutlin-3 (a P53 agonist; 10 μmol/L) or their combination were examined on ferroptosis-related protein expressions, intracellular ROS, lipid peroxidation, MDA, GSH, cell viability, mitochondrial membrane potential, and Fe²⁺ levels. Results In the rat models of HH, GAS treatment significantly inhibited P53 expression, upregulated SLC7A11 and GPX4 proteins, markedly reduced Fe²⁺, ROS, and MDA levels, and increased GSH content in the cerebral cortex. In cultured HT22 neurons, GAS treatment effectively alleviated OGD-induced cell ferroptosis as shown by decreased P53 expression, increased SLC7A11 and GPX4 expressions, and lowered levels of intracellular ROS generation, lipid peroxidation, and Fe²⁺ accumulation, along with obvious restoration of GSH levels, cell viability, and mitochondrial membrane potential. The protective effects of GAS was markedly attenuated by activation of the P53 pathway using nutlin-3. Conclusion GAS produces neuroprotective effects against HH-induced brain injury in rats by inhibiting neuronal ferroptosis via regulating the P53/SLC7A11/GPX4 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

天麻素 / 高原低压缺氧性脑损伤 / 氧糖剥夺 / 铁死亡 / GPX4/SLC7A11/FTH1

Key words

gastrodin / hypobaric hypoxia-induced brain injury / oxygen-glucose deprivation / ferroptosis / GPX4/SLC7A11/FTH1

高原低压缺氧（HH）环境，是由于海拔升高导致大气压和氧分压显著降低而形成的一种特殊应激环境^{［1， 2］}。当人体快速进入高原地区时，机体易发生急性缺氧，其中中枢神经系统对缺氧最为敏感，导致高原低压缺氧性脑损伤^［3］，并引发高原脑水肿、认知功能障碍，严重威胁高原作业人员、登山者及世居人群的健康与生命安全^［4］。目前，尽管对高原病的防治已有一定认识，如缓慢适应、吸氧等，但其分子机制复杂，尚未完全阐明，且缺乏高效特异的靶向治疗药物^［5-7］。因此，深入探索高原低压缺氧性脑损伤的发病机制，并寻找有效的神经保护策略，是当前高原医学领域亟待解决的关键科学问题之一。

铁死亡是近年来发现的一种铁依赖性的、以脂质过氧化物蓄积为特征的调节性细胞死亡新形式，其在形态学上不同于凋亡、坏死和自噬^{［8， 9］}。铁死亡的核心机制涉及细胞内抗氧化防御体系的崩溃，特别是谷胱甘肽过氧化物酶的失活，导致脂质活性氧无法被及时清除，最终引发细胞膜系统的氧化性损伤^［10］。铁死亡在多种神经系统疾病，如缺血再灌注损伤、神经退行性疾病中扮演了关键角色^{［11， 12］}。高原低压缺氧环境会破坏脑内的氧化还原平衡，诱发剧烈的氧化应激，这与铁死亡的诱发条件高度吻合^［13］。铁死亡可能参与了高原缺氧性脑损伤的病理进程^［14］。但该领域研究尚处于起步阶段，关于高原HH应激下驱动铁死亡的关键上游信号通路，特别是如何与P53等经典应激感应分子协同调控，其机制在很大程度上仍是未知的。

P53作为一个重要的肿瘤抑制因子，在细胞应激反应中发挥着核心作用^［15］。除了经典的促凋亡功能外，新研究发现P53能够通过转录调控多个下游靶基因，直接参与铁死亡的调控^［16］。其中，溶质载体家族7成员11（SLC7A11）是细胞胱氨酸摄取的关键转运体，对谷胱甘肽的合成至关重要^［17］。P53被证实可以转录抑制SLC7A11的表达，从而限制谷胱甘肽的合成，削弱细胞的抗氧化能力，最终促进铁死亡的发生^［18］。而谷胱甘肽过氧化物4（GPX4）是催化谷胱甘肽依赖的脂质过氧化物还原的关键酶，是铁死亡通路的中心调节因子^［19］。GPX4的活性和稳定性直接决定了细胞抵抗铁死亡的能力^［20］。因此，P53/SLC7A11/GPX4轴构成了调控铁死亡的一条关键信号通路。目前，该信号轴在经典病理模型（如肿瘤、脑缺血再灌注）中对铁死亡的调控已有报道^{［21， 22］}。但在高原缺氧应激下，此通路是否被激活，以及如何介导神经元损伤，是目前值得探究的科学问题。

天麻素是从云南高原传统名贵中药天麻中提取的主要活性成分，具有镇静、抗惊厥、神经保护等多种药理活性^［23］。天麻素对脑缺血、阿尔茨海默病等模型均显示出良好的保护效应，其作用机制可能与抗氧化、抗炎和抑制凋亡有关^{［24， 25］}。然而，天麻素是否能够通过抑制铁死亡途径来发挥神经保护作用，尤其是在高原低压缺氧这一特殊环境下，有待深入的研究予以阐明。

鉴于天麻素卓越的抗氧化特性和良好的安全性，我们推测它可能成为干预高原脑损伤的潜在候选药物。本研究旨在通过体内和体外实验，首次系统探讨天麻素在高原低压缺氧环境下是否通过抑制铁死亡发挥神经保护作用，并率先揭示P53/SLC7A11/GPX4信号轴在高原低压缺氧诱导神经元铁死亡中的关键角色及天麻素对其的调控机制。这不仅将为阐明高原脑损伤的新机制提供理论依据，也为将天麻素开发为防治高原病的新型药物提供重要的实验证据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

实验试剂包括：天麻素（MCE，HY-N0115，纯度≥99.94%）；由ABclonal公司提供的P53（A25915）、SLC7A11（A13685）、GPX4（A11243）、4-HNE（A24456）及β-actin（AC026）抗体；NeuN抗体（Abcam，ab104224）；P53激活剂Nutlin-3（MCE公司，HY-50696）；亚铁离子（BC5410）与JC-1试剂盒（M8650）购自北京索莱宝公司；活性氧检测试剂DHE（S0063）、DCFH-DA（S0033）、脂质过氧化探针BODIPY-C11（S0043）及CCK-8细胞增殖检测试剂（C0042）（北京碧云天公司）；FerroOrange亚铁离子荧光探针（日本同仁公司，F374）；氧化应激指标MDA（A003-1-2）和GSH（A006-1-1）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；细胞培养采用Gibco公司的DMEM培养基（11320033）；麻醉剂异氟烷由瑞沃德公司提供（R510-22）。

恒温培养箱、高速离心机及多功能酶标仪（Thermo）；荧光显微成像系统（Leica）；全自动蛋白电泳、转印与化学发光检测系统（Bio-Rad）以及缺氧培养装置（Billups-Rothenberg）。

1.2 动物饲养及体内模型建立

本研究使用24只SPF级健康成年SD雄性大鼠，体质量220~250 g，所有动物实验方案均经昆明理工大学实验动物福利伦理委员会批准（伦理批号： kust20240118）。大鼠购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，生产许可证号：SCXK（豫）2023-0013，并随附动物质量合格证（No.410983251100075021）。动物在SPF级屏障环境中饲养，维持恒温恒湿与12 h/12 h明暗循环，可自由获取灭菌饲料及饮水。

采用低压舱模拟高原缺氧环境以构建体内模型。将24只大鼠随机分为常压常氧对照组（Nor）、低压缺氧模型组（HH）、天麻素低剂量组（HH+GAS-L，100 mg/kg）及天麻素高剂量组（HH+GAS-H，200 mg/kg），每组6只。天麻素1次/d，连续7 d给药后取大脑皮层。模型组大鼠被置于动物低压舱内，通过抽气系统15 min内将舱内压力平稳降至并维持在相当于海拔6000 m的气压条件（大气压约为47 kPa），在此低压缺氧环境中持续暴露24 h。期间，动物可自由获取食物与水。常压常氧对照组大鼠则在相同时长内饲养于正常的实验室环境中。

1.3 细胞培养及体外模型建立

细胞实验采用HT22细胞系，购自武汉普诺赛生命科技有限公司（No. CL-0697），细胞在实验前已通过短串联重复序列（STR）分析进行身份验证。HT22细胞常规维持于含10%热灭活胎牛血清（FBS）及1%青霉素-链霉素溶液的DMEM高糖培养基中，并放置于37 ℃、5% CO₂条件下的细胞培养箱内进行恒温培养。为确保实验的一致性，所有细胞处理步骤均在细胞处于对数生长期时实施。

采用氧糖剥夺方法处理HT22细胞以模拟体外神经元损伤。建模时，移除原完全培养基，使用预温至37 ℃的无糖Earle's平衡盐溶液对细胞进行3次轻柔漂洗，以彻底去除残余的葡萄糖与血清。随后，向每孔中加入适量不含葡萄糖的培养基，并立即将培养板转移至缺氧小室装置中。该培养箱持续通入混合气体（95% N₂、5% CO₂），在37 ℃恒温条件下培养6 h，以建立OGD模型。对照组细胞则始终在含正常葡萄糖浓度的完全培养基中，并于含5% CO₂的常规培养箱内培养。设定分组：正常对照组（Control）、氧糖剥夺组（OGD）、天麻素500 μmol/L处理组（OGD+GAS）、Nutlin-3干预组（OGD+Nutlin-3，10 μmol/L）以及天麻素与Nutlin-3联合处理组（OGD+GAS+Nutlin-3）。

1.4 Western blotting

为检测铁死亡相关蛋白表达，本研究分别从大脑皮层组织及HT22细胞中提取总蛋白。对于脑组织样本，加入预冷的RIPA裂解液（含1% PMSF蛋白酶抑制剂）后进行机械匀浆，随后在4 ℃条件下静置裂解30 min，最后于4 ℃、12 000×g离心15 min，收集上清液即为总蛋白。对于HT22细胞样本，弃去培养基并用PBS轻柔漂洗2次后，直接在培养板中加入适量上述裂解液，于冰上刮取细胞并收集裂解液，同样经4 ℃离心后获取上清。

采用BCA法对所有蛋白样品进行定量，并通过沸水浴使蛋白变性。等量蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转移至PVDF膜，随后用5%脱脂牛奶封闭1 h。随后，膜与针对铁死亡关键蛋白的特异性一抗（P53、SLC7A11、GPX4，稀释比例均为1∶1000） 在4 ℃下孵育过夜。TBST洗膜后，与HRP标记的羊抗兔二抗（1∶5000） 于室温孵育2 h。最后，使用ECL化学发光试剂盒在成像系统下显影，并通过Image J软件对条带灰度值进行定量分析。

1.5 双重免疫荧光实验

通过双重免疫荧光染色在组织与细胞水平分别观察铁死亡相关蛋白P53或4-HNE在神经元中的表达与定位。组织切片染色方面，取经4%多聚甲醛灌注固定、石蜡包埋的脑组织冠状切片（厚度5 μm）。切片经脱蜡、水化后，用含0.5% Triton X-100的PBS溶液透化，并用10%牛血清白蛋白（BSA）室温封闭1 h。为检测铁死亡与神经元的共定位，切片与兔抗P53（1∶400）或兔抗4-HNE抗体（1∶400）与小鼠抗NeuN抗体（1∶800） 的混合一抗于4 ℃孵育过夜。次日，切片经PBS清洗后，与相应Cy3标记的抗兔IgG（1∶800）和FITC标记的抗小鼠IgG（1∶800） 混合二抗于室温避光孵育2 h。最后，使用DAPI溶液复染细胞核5 min，抗荧光淬灭封片剂封片。

细胞爬片染色方面，将HT22细胞接种于预置无菌盖玻片的24孔板中，待细胞密度达70%时进行相应处理。细胞爬片经4%多聚甲醛固定15 min、0.5% Triton X-100透化10 min及5% BSA封闭30 min后，与兔抗P53抗体（1∶400） 和小鼠抗NeuN抗体（1∶800） 的混合一抗于4 ℃孵育过夜。次日，按上述组织切片相同的方法进行二抗孵育、DAPI复染及封片。所有样本均使用共聚焦显微镜进行图像采集并进行荧光分析。

1.6 活性氧（ROS）探针染色

采用不同的荧光探针法检测组织及细胞水平的ROS水平。体内组织切片与二氢乙啶（DHE）探针（溶于PBS，终浓度10 μmol/L）在37 ℃避光孵育30 min。同样的，体外细胞爬片加入2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酯（DCFH-DA）探针（用无血清培养基稀释，终浓度5 μmol/L），于37 ℃细胞培养箱中避光孵育30 min。孵育结束后，使用预冷PBS充分漂洗以去除未结合的探针。随后在荧光显微镜下观察并采集图像。

1.7 MDA、GSH及BODIPY-C11检测

本研究分别检测了脂质过氧化终产物丙二醛（MDA）及抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）的含量，来评估组织与细胞中的氧化应激水平。称取约30 mg脑皮层组织或收集1×10⁶ HT22细胞，加入预冷的生理盐水进行机械匀浆，并于4 ℃、12 000×g条件下离心15 min，收集上清液。MDA含量测定与TBA工作液充分混合，GSH含量测定与DTNB工作液充分混合，反应30 min后，离心取上清，使用酶标仪测定吸光度A_{532 nm}。

使用BODIPY™ 581/591 C11荧光探针检测细胞内的脂质过氧化水平。将BODIPY-C11探针稀释至工作浓度（终浓度5 μmol/L），与HT22细胞于37 ℃、5% CO₂的培养箱中避光孵育10 min。经PBS洗涤后，在共聚焦显微镜下观察。脂质过氧化发生于红色荧光向绿色荧光的转变，可通过观察绿色荧光的增强来判断脂质过氧化的发生强度。

1.8 CCK-8及JC-1检测

采用CCK-8试剂盒评估不同处理对HT22细胞活力的影响。每孔加入100 μL不含血清的新鲜培养基及10 μL CCK-8溶液，轻微振荡混匀后，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中避光孵育2 h。孵育结束后，使用酶标仪测定各孔的吸光度A_{450 nm}。

采用JC-1荧光探针法检测线粒体膜电位（ΔΨm）的变化。按照试剂盒说明书，使用无血清培养基稀释JC-1探针至工作浓度，并加入含有细胞爬片的孔板中，于37 ℃细胞培养箱中避光孵育30 min。孵育结束后，使用预冷的JC-1染色缓冲液（1×）轻柔洗涤细胞2次，以彻底去除未进入细胞的探针，直接置于荧光显微镜下观察。正常细胞线粒体中可见红色聚集体荧光；而膜电位下降的细胞则表现为绿色单体荧光增强。

1.9 铁离子水平检测

分别在体内和体外对铁离子含量进行测定。采用可见分光光度法定量检测大鼠脑皮层组织中的亚铁离子含量。加入预冷的提取液进行机械匀浆，离心收集上清液，使用酶标仪测定各孔的吸光度A_{450 nm}。根据预先绘制的亚铁离子标准曲线，计算单位质量组织中的亚铁离子含量。

另外，采用FerroOrange荧光探针检测HT22细胞内的游离亚铁离子水平。将生长在盖玻片上的细胞用HBSS缓冲液轻柔漂洗，随后加入浓度为1 μmol/L的FerroOrange染色工作液，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中避光孵育30 min。孵育结束后，无需洗涤，直接在荧光显微镜下观察并采集图像，分析细胞内的红色荧光强度。

1.10 统计学分析

本研究所有实验均独立重复3次。实验数据均以均数±标准差表示。采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。首先，使用Shapiro-Wilk检验对数据进行正态性检验。对于符合正态分布的数据，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。对于不符合正态分布的数据则采用非参数检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GAS 通过调控P53/SLC7A11/GPX4通路改善HH模型中铁死亡相关蛋白的表达

Western blotting结果显示（图1A~D），与Nor组相比，HH模型组的P53蛋白表达显著增强（P<0.001），而铁死亡关键蛋白SLC7A11、GPX4的表达明显减弱（P<0.001）；在HH基础上给予GAS低剂量和高剂量处理后，P53表达随GAS剂量增加逐渐降低（P<0.05），SLC7A11、GPX4表达则随剂量增加逐渐增强（P<0.05）。

2.2 GAS下调HH模型神经元中P53表达及铁死亡标志物4-HNE水平

双重免疫荧光结果表明（图2A~D），Nor组神经元中P53和4-HNE荧光信号较弱；而HH模型组中，P53和4-HNE红色信号显著增强（P<0.01）；经GAS处理后，HH+GAS-L组和HH+GAS-H组的P53和4-HNE荧光强度随GAS剂量升高逐渐减弱（P<0.05）。

2.3 GAS缓解HH模型中的氧化应激与铁离子过载

ROS的荧光探针结果显示（图3A、B），Nor组荧光强度较弱；HH组DHE荧光强度显著高于Nor组（P<0.001）；经GAS处理后，HH+GAS-L组和HH+GAS-H组红色荧光较HH组依次降低（P<0.01）。其次，脂质过氧化产物（MDA，图3C）结果显示，HH组MDA相对表达量显著高于Nor组（P<0.001）；HH+GAS-L、HH+GAS-H组较HH组依次降低（P<0.05）。然后，抗氧化物质结果表明（GSH，图3D），HH组GSH相对表达量显著低于Nor组（P<0.001）；HH+GAS-L、HH+GAS-H组较HH组有所回升（P<0.05）。最后，亚铁离子水平表明（图3E），HH组铁离子相对浓度显著高于Nor组（P<0.001）；HH+GAS-L、HH+GAS-H组较HH组依次降低（P<0.05）。

2.4 GAS通过抑制P53通路调控OGD模型中铁死亡相关蛋白的表达

在体外实验中，P53的双重免疫荧光结果显示（图4A、B），Control组神经元中P53荧光信号较弱；OGD组P53荧光强度显著高于Control组（P<0.001）；OGD+GAS组较OGD组降低（P<0.01）。然而，当使用P53激动剂Nutlin-3时，不论是OGD+Nutlin-3组相比OGD组，还是OGD+GAS+Nutlin-3组相比OGD+GAS组，Nutlin-3进一步促进了P53荧光强度的表达（P<0.01）。Western blotting结果表明（图4C~F），OGD组P53蛋白表达显著高于Control 组（P<0.001）；OGD+GAS组较OGD组降低（P<0.05）；Nutlin-3干预增强了P53蛋白的表达（P<0.01）。相反，OGD组SLC7A11和GPX4表达显著低于Control组（P<0.001）；OGD+GAS组较OGD组升高（P<0.05）；P53的激动剂Nutlin-3联合干预OGD或OGD+GAS，SLC7A11和GPX4的表达均明显降低（P<0.05）。

2.5 GAS通过抑制P53通路缓解OGD模型的氧化应激与脂质过氧化

氧化应激与脂质过氧化的相关标志物结果显示，与Control组相比，OGD组DCHF-DA的绿色荧光强度增强（图5A、C），BODIPY-C11的氧化型占比显著增加（图5B、D），MDA表达量明显上升（图5E），而GSH表达显著降低（图5F，P<0.001）。使用GAS处理后，出现相反的结果，表现为ROS、脂质过氧化水平降低以及抗氧化能力部分恢复（P<0.05）。然而，Nutlin-3干预再次逆转这一治疗效果，不论是OGD+Nutlin-3组相比OGD组，还是OGD+GAS+Nutlin-3组相比OGD+GAS组，ROS、BODIPY-C11氧化型与还原型比值、MDA水平进一步升高，GSH含量减弱（P<0.05）。

2.6 GAS通过P53通路改善OGD模型的细胞存活与线粒体功能

CCK-8、JC-1以及FerroOrange的结果表明，与Control组相比，OGD组的细胞存活率显著降低（图6A），线粒体膜电位（JC-1聚集体/单体比值）显著下降（图6B、C），Fe²⁺水平显著升高（图6D、E，P<0.001）。OGD+GAS组相较于OGD组，细胞存活率提升，线粒体膜电位升高，Fe²⁺积累减弱（P<0.05）。使用P53激动剂Nutlin-3的干预后，OGD+Nutlin-3组相较于OGD组，细胞存活率进一步降低，线粒体膜电位下降，Fe²⁺水平升高（P<0.05）。OGD+GAS+Nutlin-3组相较于OGD+GAS，GAS的治疗作用被Nutlin-3逆转（P<0.01）。

3 讨论

高原低压缺氧性脑损伤是急性高原病最严重的表现形式之一，其发病机制复杂，涉及氧化应激、炎症反应、细胞凋亡与自噬等多种病理过程^［26-28］。然而，铁死亡在HH中的作用尚未被充分阐明。本研究通过整合体内外实验模型，系统地证实了天然产物天麻素能够通过调控P53/SLC7A11/GPX4信号轴，有效抑制神经元铁死亡，从而在HH中发挥显著的神经保护作用。这一发现不仅为HH的病理机制提供了新的视角，也为天麻素作为潜在神经保护剂的开发提供了坚实的实验依据和明确的作用靶点。

本研究揭示了铁死亡在HH发生发展中的核心地位。在体内实验中，我们观察到HH模型大鼠脑皮层组织出现了典型的铁死亡生化特征，如细胞内铁超载的Fe²⁺浓度显著升高，作为脂质过氧化终末产物的MDA含量急剧增加，而关键的细胞内源性抗氧化剂GSH则被大量消耗。这些变化与组织内总体ROS水平的升高相一致。在采用OGD模拟HH的细胞模型中，我们同样观察到Fe²⁺的蓄积和ROS的爆发，并利用BODIPY-C11探针直接检测到脂质过氧化水平增强。更为重要的是，这些氧化还原失衡的后果直接导致了线粒体膜电位的崩溃和细胞存活率的显著下降。这些实验数据有力地证明了铁死亡是低压缺氧导致神经元损伤的一条至关重要的通路。

面对HH诱导的铁死亡，寻找有效的干预策略是本研究的核心目标。我们的结果表明，天麻素在体内外均展现出强大的抗铁死亡效应。在动物水平，天麻素治疗剂量依赖性地逆转了HH引起的脑组织生化紊乱，显著降低了Fe²⁺、ROS和MDA水平，并提升了GSH含量。在细胞水平，天麻素同样逆转了OGD诱导的所有铁死亡相关表型，包括抑制脂质过氧化、减少铁蓄积、恢复线粒体膜电位，并最终挽救了神经元活力。这些数据充分说明，天麻素是一种有效的铁死亡抑制剂。

为了深入揭示其作用机制，我们将研究焦点集中于铁死亡的P53/SLC7A11/GPX4核心调控通路。P53作为一个重要的肿瘤抑制因子，近年研究发现其在调节细胞代谢和死亡中扮演着关键角色^［29］。在应激条件下，P53可以转录抑制SLC7A11的表达。SLC7A11是系统Xc-轻链，负责将胞外的胱氨酸转运入胞，用于合成GSH^［30］。GSH则是GPX4不可或缺的辅因子，GPX4通过将有毒的脂质过氧化物还原为无害的脂质醇，是抑制铁死亡最关键的防线^［31］。因此，P53的上调会通过抑制SLC7A11，导致GSH合成受阻、GPX4活性丧失，最终引发脂质过氧化物累积和铁死亡。

本研究的结果验证了这一通路在HH中的激活以及天麻素的干预作用。在HH和OGD模型中，我们均观察到P53蛋白表达显著上调，与此同时，其下游的SLC7A11和GPX4蛋白水平则相应地下调。这一分子层面的变化与上述的铁死亡生化及功能表型高度吻合。而天麻素干预逆转了这一分子事件，它显著抑制了P53的过度表达，从而解除了P53对SLC7A11的转录抑制，使SLC7A11和GPX4的蛋白表达得以恢复。GPX4水平的回升意味着细胞清除脂质过氧化物的能力增强，这直接解释了为何天麻素处理后MDA和脂质ROS水平显著下降。同时，SLC7A11的上调促进了胱氨酸的摄取和GSH的合成，为GPX4提供了充足的补给，并直接贡献于细胞内抗氧化储备的恢复。因此，我们认为，天麻素通过负向调控P53，正向调节SLC7A11/GPX4信号通路，是其抑制神经元铁死亡、发挥神经保护作用的分子基石。

为了确证P53在天麻素保护通路中的上游核心地位。在体外模型中，本研究使用了P53的特异性激动剂Nutlin-3^［32］。实验结果显示，当我们在天麻素处理的基础上联合使用Nutlin-3时，天麻素所带来的一系列保护效应被显著削弱或逆转。具体而言，Nutlin-3的加入重新提高了P53的水平，并随之再次压制了SLC7A11和GPX4的表达。在功能上，这种分子层面的逆转直接表现为天麻素原本能够抑制的脂质过氧化和铁蓄积重新加剧，其所能提升的细胞活力和线粒体膜电位也显著下降。这一结果这强有力地证明了P53的抑制是天麻素发挥作用不可或缺的上游事件。

本研究的创新性是多方面的：首先，本研究首次将铁死亡与高原低压缺氧性脑损伤明确关联，拓展了HH的机制研究范畴。其次，本研究首次系统地揭示了天麻素抗铁死亡的神经保护作用，为这一传统中药有效成分的现代应用提供了新的药理学依据。最后，本研究开创性地将天麻素的作用机制定位在P53/SLC7A11/GPX4这一精确的信号通路上，并通过激动剂挽救实验完成了因果论证。当然，本研究亦存在一些局限性。第一，铁代谢是一个复杂网络，除SLC7A11/GPX4轴外，铁蛋白的自噬降解（铁自噬）、转铁蛋白受体等也深刻影响铁死亡敏感性，天麻素是否调节这些环节尚不清楚。第二，本研究使用的P53激动剂是药理学工具，未来利用P53基因敲除的细胞或动物模型，将能更遗传学地验证该靶点。第三，本研究观察了7 d内的急性保护效应，天麻素对于HH的长期神经功能恢复（如认知、运动功能）是否有益，需要通过更复杂的行为学实验进行验证。

综上所述，本研究层层深入地揭示了天麻素在高原低压缺氧性脑损伤中的新型保护机制。我们证实，铁死亡是HH中神经元损伤的关键执行方式，而天麻素能够作为一种有效的铁死亡抑制剂，通过靶向抑制P53的表达，解除其对SLC7A11的转录抑制，进而上调GPX4蛋白水平，最终增强细胞的抗氧化防御能力，抑制脂质过氧化和铁依赖性损伤，改善线粒体功能与神经元存活。这一完整论证，不仅极大地丰富了HH的病理理论，也为将天麻素开发成为防治高原脑损伤的靶向药物提供了极具前景的科学基础。

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