化瘀通络灸联合神经干细胞移植对血管性痴呆大鼠Drp1/Mfn蛋白表达及线粒体动力学的影响

Effect of Huayu Tongluo moxibustion combined with neural stem cell transplantation on hippocampal Drp1/Mfn proteins and mitochondrial dynamics in rats with vascular dementia

摘要

目的 探讨化瘀通络灸调控神经干细胞（NSCs）线粒体动力学治疗血管性痴呆（VD）的作用机制。 方法 将72只SPF级SD大鼠随机分为假手术组、VD组、VD+定位注射等量细胞培养基组（VD+CM组）、VD+定位注射NSCs悬液组（VD+NSCs组）、VD+化瘀通络灸组（VD+HYTLM组）、VD+定位注射NSCs悬液+化瘀通络灸组（VD+NSCs+HYTLM组），12只/组。分别于造模后和治疗后，采用Morris水迷宫实验检测大鼠学习、运动能力；TUNEL法、免疫荧光单标法观察海马CA1区脑组织神经元凋亡率及神经干细胞分化情况；苏木精-伊红（HE）染色、免疫荧光共染色检测海马CA1区脑组织神经元存活情况及神经元病理形态；流式细胞仪测定各海马CA1区脑组织线粒体活性氧（ROS）；Western blotting法检测Drp1、Mfn1、Mfn2、Fis1的蛋白表达情况。 结果 与假手术组相比，VD组大鼠逃避潜伏期延长（P<0.01），运动轨迹紊乱；神经元凋亡率上升（P<0.001）；神经干细胞增殖抑制，成熟神经元丢失，新生神经元抑制；ROS平均水平上升（P<0.001）；神经元大面积结构破坏，胞体缩小、胞核固缩，排列疏松，局灶性空洞形成；Drp1、Mfn1、Mfn2 表达下降（P<0.05），Fis1表达上升（P<0.001）。与VD组相比，VD+定位注射等量细胞培养基组无明显变化（P>0.05）。与VD+定位注射等量细胞培养基组比较，VD+NSCs组大鼠逃避潜伏期缩短（P<0.05），运动轨迹趋于集中；神经元凋亡率下降（P<0.05）；神经干细胞增殖增加，成熟神经元数量增多，新生神经元生成增强；ROS平均水平降低（P<0.001）；神经元形态改善，胞体较饱满、胞核固缩减轻，细胞排列稍紧密；Drp1、Mfn1、Mfn2表达上升（P<0.001，P<0.001，P<0.01），Fis1表达下降（P<0.05）。与VD+NSCs组比较，VD+化瘀通络灸组无明显变化（P>0.05）。与VD+化瘀通络灸组比较，VD+NSCs+化瘀通络灸组逃避潜伏期缩短（P<0.001），运动轨迹接近假手术组；神经元凋亡率下降（P<0.01）；神经干细胞增殖、成熟神经元存活及新生神经元生成增强；ROS平均水平下降（P<0.01）；结构完整，胞体饱满，排列紧密；Drp1、Mfn1、Mfn2蛋白表达上升（P<0.001，P<0.01，P<0.01），Fis1表达下降（P<0.05）。 结论 化瘀通络灸法可促进VD大鼠认知功能改善，诱导NSCs分化为功能性神经元，提升神经元存活率并减轻病理损伤。其机制可能通过调节海马区线粒体动力学相关蛋白，促进融合、抑制过度裂变，恢复线粒体动态平衡，从而缓解功能障碍。

Abstract

Objective To investigate the mechanism by which Huayu Tongluo moxibustion (HYTLM) regulates mitochondrial dynamics of neural stem cells (NSCs) for treatment of vascular dementia (VD). Methods Seventy-two SD rats were randomized equally into 6 groups, including a sham-operated group, a VD model group, and 4 VD groups receiving HYTLM treatment, HYTLM treatment with stereotactic injection of NSC suspension into the hippocampal CA1 region, or injections of NSC suspension or cell culture medium without HYTLM treatment. Morris water maze test was used to assess learning and memory ability of the rats. Hippocampal neuronal apoptosis, NSC differentiation, neuronal survival, histopathological changes, mitochondrial reactive oxygen species (ROS) levels, and hippocampal expressions of Drp1, Mfn1, Mfn2, and Fis1 proteins were evaluated using TUNEL assay, immunofluorescence staining, HE staining, flow cytometry, and Western blotting. Results The rats receiving culture medium injection, similar to the VD rats, exhibited prolonged escape latency and disorganized swimming trajectories in Morris water maze test and had significantly increased neuronal apoptosis, suppressed NSC proliferation, reduced mature neurons, impaired neurogenesis, and increased ROS levels in the hippocampal CA1 region, showing also obvious neuronal injuries, lowered hippocampal Drp1, Mfn1, and Mfn2 expressions and increased Fis1 expression. All these changes were significantly alleviated in VD rats receiving NSC transplantation. HYTLM treatment produced similar effects to NSC transplantation, but their combined treatment further shortened the escape latency of the VD rats, which showed similar swimming patterns to the sham-operated rats, and produced stronger protective effects on the hippocampal neurons. The combined treatment also further reduced ROS levels and improved aberrant expressions of Drp1, Mfn1, Mfn2, and Fis1. Conclusion HYTLM treatment improves cognitive functions of VD rats, promotes NSC differentiation into functional neurons and neuronal survival, and attenuates neuronal injury possibly by regulating hippocampal mitochondrial dynamics, thereby restoring mitochondrial homeostasis and ameliorating functional impairment.

Graphical abstract

关键词

血管性痴呆 / 化瘀通络灸 / 神经干细胞 / 线粒体动力学 / 神经元

Key words

vascular dementia / Huayu Tongluo moxibustion / neural stem cells / mitochondrial dynamics / neurons

血管性痴呆（VD）是以认知、情绪及社会功能进行性衰退为特征的痴呆综合征，其病理机制为脑血管病变诱发的认知功能障碍^［1］。随着老龄化进程加快及心脑血管疾病负担加重，VD的疾病占比持续攀升，现已成为仅次于阿尔茨海默病的第2大痴呆类型，占痴呆病例总数的17%~20%^［2］。目前其致病因素具有多样性，病理机制尚未完全阐明^［3］，而现阶段临床多采用多奈哌齐、丁苯酞等药物进行对症治疗，虽可部分缓解症状，但仍存在安全性问题，且难以实现VD的病理逆转^［4］。因此阐明VD的病理机制并发掘其干预靶点，对于研究新型治疗策略、改善患者生存质量及降低社会疾病负担具有重要意义。

神经干细胞（NSCs）目前已成为临床治疗VD的研究热点之一，其具有自我更新及分化为多种神经细胞类型的能力，可促进神经修复与功能恢复^［5］。然而，在病理微环境下，内源性NSCs的存活率、分化率降低，修复效能受到明显限制^［6］。线粒体功能状态直接影响NSCs的增殖、分化及迁移能力^［7］。线粒体是维持神经元功能和能量代谢的核心细胞器，其动态平衡依赖分裂与融合过程的调控，主要由线粒体动力相关蛋白决定，如：动力蛋白相关蛋白1（Drp1）、融合蛋白1（Mfn1）、融合蛋白2（Mfn2）、分裂蛋白（Fis1）。在VD状态下，线粒体分裂亢进、融合受阻，导致能量供应不足、活性氧（ROS）过度积累并诱发细胞凋亡，进而导致神经元损伤^{［8， 9］}。

VD属中医“痴呆”“呆病”等范畴。其病位在脑，病机以本虚标实为特点，多为脏腑亏虚、瘀血阻窍、脑神失用，治宜益精填髓、化瘀通络。化瘀通络灸是全国名中医杨骏教授治疗VD的经验疗法，在临床取得明显效果。本团队在前期研究基础上发现^{［10， 11］}：化瘀通络灸对早期血管性认知功能障碍疗效显著，并能刺激NSCs分化、成熟为新生神经元，改善VD大鼠认知功能。此外，该疗法可通过激活海马区神经修复，加快血管新生过程，从而实现神经细胞及血管新生，进而促进VD恢复^［12］。本疗法以附子为介质，配合艾叶气清香味苦，性辛、苦、温之效，灸之可舒筋活络、活血化瘀。现代研究表明^［13］：艾灸可减少VD患者氧化应激状态，提高学习、认知能力，从而改善生活质量。本研究择取百会、大椎、神庭三穴，其中神庭位于脑海前庭，为神识所在，可养神充髓；百会位于巅顶，又称“三阳五会”，可开窍醒神；大椎为“诸阳之会”，手足阳经皆过于此，灸之可温阳通脉。脑为“元神之府”，且督脉入络于脑，神庭、百会、大椎皆属督脉，且为局部取穴，三穴共用，可醒脑调神、温阳通气。三穴合用共奏化瘀血、通经络、益脑髓、调神志之功^［14］。

本团队预实验发现，化瘀通络灸可改变NSCs线粒体动力学，但其作用机制尚不明晰。基于此，本研究采用VD大鼠模型，并在此基础上构建VD+NSCs大鼠模型，观察化瘀通络灸联合NSCs对大鼠认知功能、细胞凋亡、海马神经元存活的影响，并探讨其对NSCs线粒体动力学的调控作用，以期为化瘀通络灸联合NSCs防治VD提供新的实验依据和理论支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

选用SPF级健康成年雄性SD大鼠72只，6~8周，体质量280~300 g，购于湖北省实验动物研究中心，生产许可证编号：SCXK（鄂）2020-0018，饲养于安徽中医药大学实验动物饲养中心，环境温度22~25 ℃，相对湿度55%~60%，自由获取食物和水，12 h明暗交替环境下适应性饲养7 d。本实验中对动物的处理符合科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，且已通过安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查，符合伦理规范（伦理批号：AHUCM-rats-2024138）。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

异氟烷（瑞沃德）；通用组织固定液（Biosharp）；二甲苯（国药集团）；抗荧光淬灭封片剂（southernbiotech）；正常山羊血清（BOSTER）；4%多聚甲醛固定液（旗赛生物技术有限公司）；抗荧光淬灭封片剂（southernbiotech）；CY3-羊抗兔IgG（BOSTER）；CY3-羊抗小鼠IgG（BOSTER）；兔多抗Nestin、小鼠单抗BrdU、兔多抗DCX、小鼠单抗GAPDH、兔多抗drp1、HRP标记羊抗小鼠二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；小鼠单抗GFAP、小鼠单抗Neun（Abcam）；；BCA蛋白浓度测定试剂盒（广州捷倍斯生物科技有限公司）；鼠单抗mfn1、鼠单抗mfn2、鼠单抗fis1（Santa）；HRP标记羊抗兔二抗（碧云天生物技术有限公司）。

1.2.2 主要仪器

数显型脑立体定位仪（北京易则佳科技有限公司）；Morris水迷宫视频分析系统（北京众实科技有限公司）；组织脱水机、组织包埋机、组织摊烤片机（武汉俊杰电子有限公司）；生物组织石蜡切片机（Leica）；荧光显微镜（奥林巴斯）；电泳仪电源（北京六一仪器厂）；磁力加热搅拌器（常州梅香仪器有限公司）；酶标仪（BIO-Tek）；常温离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；冷冻高速离心机（湖南可成仪器设备有限公司）。

1.3 分组及造模方法

通过Morris水迷宫实验剔除贴壁悬浮不动或原地打转的大鼠后，使用随机数字表法随机筛选12只大鼠作为假手术组（Control），剩余大鼠以改良双侧颈总动脉闭塞法复制 VD 模型，并使用Morris水迷宫法鉴定VD模型，将模型复制成功的大鼠随机分为VD组、VD+等量细胞培养基组、VD+NSCs组、VD+化瘀通络灸组、VD+NSCs+化瘀通络灸组，每组各12只。

采用改良双侧颈总动脉结扎法^［15］来建立VD大鼠模型。实验采用健康成年SD大鼠，术前24 h禁食但自由饮水。麻醉诱导时将大鼠置于密闭麻醉诱导盒，以5%异氟烷（气体流量1 L/min）进行吸入麻醉，待翻正反射消失后转移至手术台，改用2%异氟烷通过呼吸面罩维持麻醉状态。术区颈部剃毛后，依次用碘伏和75%乙醇消毒3遍。沿颈部正中线作约1.5 cm纵行切口，钝性分离皮下组织及颌下腺，暴露气管前肌群后，沿右侧胸锁乳突肌内侧缘精细分离颈动脉鞘，在手术显微镜下辨认颈总动脉及其伴行迷走神经，使用显微血管钳轻柔分离血管周围结缔组织，以4-0丝线双重结扎颈总动脉，两结扎点间距保持3 mm。术毕用6-0可吸收缝线分层缝合肌层和皮肤，术区再次消毒处理。术后将动物置于预热至28 ℃的独立笼具中观察，连续3 d肌肉注射青霉素（1×10⁵ IU/d）预防感染，每日更换灭菌垫料。造模完成后，运用水迷宫测试模型鼠的逃避潜伏期，与造模型前做比较，逃避潜伏期延长≥35s，即为造模成功^［16］。假手术组仅开颈，不做结扎处理。

1.4 干预方法

造模结束7 d后开始干预，1次/d，连续14 d。

VD+NSCs组，参考操作方式如下^［17］：采用原代培养至第2代的NSCs制备细胞悬液，经立体定向定位后，使用微量注射泵注射至大鼠双侧海马CA1区，每侧注射5 μL，注射速度为1 μL/min，每只共注射10 μL、含2×10⁵NSCs的细胞悬液。注射完毕后留针5 min，再缓慢退针并缝合切口。

VD+化瘀通络灸组：采用标准清艾条（L：120 mm，D：7 mm；南阳汉医艾绒有限责任公司；河南南阳；中国）进行艾灸干预，取百会、大椎、神庭三穴。参考中国针灸协会《实验动物常用穴位名称与定位腧穴具体定位第2部分：大鼠》^［18］。百会（GV20）定位：顶骨正中；大椎（GV14）定位：第7颈椎与第1胸椎间，背部正中；神庭（穴）模拟人体腧穴骨度分寸法定位取穴：神庭穴位于大鼠头前正中线，额顶骨缝交界线前方。治疗前对穴区进行剃毛处理，将大鼠固定于自制鼠板上，并采用依据大鼠头形制作的环氧树脂头部固定器固定头部，以保持体位稳定，便于准确取穴及施灸操作。于“百会”穴放置1枚附子饼（直径3 mm，厚2 mm），待艾条充分燃烧后，将灸火按压于附子饼上1~3 s，随后抬起2~3 s，反复压灸20 min，每5 min更换1枚附子饼，以防止局部皮肤烫伤。“神庭”“大椎”穴采用悬灸法，每穴施灸20 min，施灸过程中采用红外温度计（Fluke，Avery De，WA，USA）监测穴区皮肤温度，并通过调节艾条与穴区皮肤之间的距离，将局部温度维持在43±1 ℃。

VD+等量细胞培养基组：与VD+NSCs组操作方式相同，每只大鼠接受1次立体定向注射操作，并于该次操作中向双侧海马CA1区分别注射等量细胞培养基，每侧5 μL，双侧共10 μL。

VD+NSCs+化瘀通络灸组，参考操作方式如下^［19］：于NSCs移植后3 d开始治疗，以预防立体定向注射术后感染，并保证各组于同一时间接受干预。操作方法同VD+化瘀通络灸组。

VD组时间与化瘀通络灸组时间保持一致，仅在特制灸架上停留而不进行其他任何干预。

1.5 取材

Morris水迷宫测试结束后，大鼠经腹腔注射2.5%三溴乙醇（6 mL/kg）麻醉，待麻醉深度达标后，仰卧位固定，消毒胸腹部。开胸后经左心室穿刺采血5 mL，室温静置30 min，3500 r/min离心10 min，取血清分装，-80 ℃冻存。采血后剪开右心耳，经左心室灌注30 mL生理盐水，至肝脏变土黄色、流出液澄清时停止，于冰上迅速分离全脑海马组织，沿中线分为左右半球：左半球4%多聚甲醛固定，右半球液氮速冻后-80 ℃保存，用于后续检测。另取新鲜脑组织用于流式检测。

1.6 观察指标及检测方法

1.6.1 Morris水迷宫实验

造模成功大鼠进行Morris水迷宫行为学检测。实验使用直径150 cm、高60 cm的圆形水池（水深40 cm），水温恒定为21.5~22.5 ℃。水池划分为4个等面积象限（Ⅰ：东北，Ⅱ：西北，Ⅲ：西南，Ⅳ：东南），Ⅲ象限中心置直径8 cm有机玻璃平台（低于水面1 cm），平台位置固定不变。采用Xeye Aba动物行为分析系统记录数据。（1）第1~4天进行定位航行实验。大鼠先进行60 s无平台自由游泳适应，随后引导至平台停留10 s建立空间认知。正式测试每日进行4轮，按Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅳ象限序列将大鼠面向池壁入水，记录入水至登台持续停留≥5 s的逃避潜伏期（上限60 s）；超时未登台者引导至平台10 s并记潜伏期60 s。各轮次间隔≥30 min，连续训练4 d。（2）第5天空间探索实验。撤除平台后，再次放入大鼠，记录大鼠第5天后游泳运动轨迹。

1.6.2 TUNEL法检测大鼠海马CA1区神经元凋亡率

取上述固定于多聚甲醛中的海马组织，梯度乙醇脱水（100%→95%→80%→70%）、二甲苯透明3次（10 min/次）、石蜡包埋，切片厚5 μm。切片经40℃水浴展片，60 ℃烤片3 h后通透：用免疫组化笔圈定组织，加Proteinase K（PBS稀释1∶100，终浓度20 μg/mL）室温孵育15 min，PBS冲洗3次（3 min/次）。加1×Equilibration Buffer（去离子水稀释5×缓冲液1∶10）平衡15 min，PBS冲洗3次。加50 μL TUNEL反应液，37 ℃避光孵育60 min；加DAPI避光孵育5 min，PBS冲洗4次（5 min/次）。抗荧光淬灭封片液封片。结果判读：细胞核呈蓝色，凋亡细胞呈红色；凋亡率=凋亡神经元数÷（凋亡神经元数+正常神经元数）×100%。×400荧光显微镜下观察。

1.6.3 免疫荧光单标法检测各组大鼠海马CA1区神经干细胞分化情况

取上述固定于多聚甲醛中的海马组织，用PBST冲洗3次（3 min/次）。0.5% Triton X-100（PBS稀释）室温通透5 min，PBST冲洗3次。正常山羊血清室温封闭30 min，弃液后加稀释一抗（1∶100），4 ℃孵育过夜。PBST冲洗3次后，加CY3-羊抗兔IgG荧光二抗（1∶100），37 ℃避光孵育1 h，PBST冲洗4次。DAPI避光染核5 min，PBST冲洗4次。抗荧光淬灭封片液封片。结果判读：细胞核呈蓝色，目标蛋白呈红色。×400荧光显微镜下观察。

1.6.4 免疫荧光双标法检测各组大鼠海马CA1区神经元情况

取上述固定于多聚甲醛中的海马组织，经脱水、透明、浸蜡包埋，切片厚5 μm。切片脱蜡后以0.01 M Tris-EDTA修复液（pH 9.0）修复15 min，室温冷却后用TBST（pH 7.4）冲洗3次（3 min/次）。正常山羊血清室温封闭30 min。加入稀释好的一抗NeuN（1∶100）、DCX（1∶100），可同时孵育，4 ℃湿盒孵育过夜（约15 h）。TBST冲洗3次（3 min/次），加稀释好的荧光二抗CY3-羊抗小鼠IgG（1∶100）、FITC-羊抗兔（1∶100），37 ℃湿盒孵育1h，TBST冲洗4次（3 min/次）。抗荧光淬灭剂封片，固化后于荧光显微镜下采集图像（每张切片随机选取3个400倍视野），IPP6.0软件测定光密度。结果判读：细胞核呈蓝色，NeuN呈红色，DCX呈绿色，NeuN+DCX阳性细胞视为神经元。×400荧光显微镜下观察。

1.6.5 流式细胞仪测定线粒体ROS生成

无菌摘取上述大鼠新鲜脑组织，含双抗PBS冲洗；眼科剪碎组织至1 mm³；移入离心管，加双倍体积0.125%胰酶-EDTA消化液；37 ℃摇床120 r/min消化20 min；取上清，等量完全培养基终止；过200目筛，双抗PBS冲洗两次；收滤液，1000 r/min离心5 min；弃上清，得大鼠脑组织单细胞悬液。继行流式检测：按试剂盒法，将50 µg线粒体超氧化物红色荧光探针粉末溶于13 µL DMSO，经涡旋振荡30 s配制成5 mmol/L储存液（-20 ℃避光保存）；临用前取储存液用预温无血清培养基进行1000倍稀释，获得终浓度5 µmol/L工作液。细胞样本弃原培养液后，每管加入500 µL工作液，置于37 ℃培养箱避光孵育10 min（期间每3 min轻柔摇匀）。孵育结束后吸除工作液，用预冷无血清培养基洗涤细胞3次（每次加入1 mL培养基，1200 r/min离心5 min弃上清）。末次离心后以500 µL PBS重悬细胞，经200目尼龙滤网过滤后转移至流式管。最后流式细胞仪上机检测。

1.6.6 HE染色观察海马CA1区神经元形态

取上述固定于多聚甲醛中的海马组织，经脱水、透明及浸蜡处理后包埋于熔点较浸蜡石蜡高2~3 ℃的包埋蜡中，确保组织与石蜡充分融合。蜡块凝固后用徕卡切片机连续切片（厚4~5 μm），切片经40 ℃水浴展片并倾斜贴附于载玻片，60 ℃烘烤3 h固化。梯度脱蜡：二甲苯3次（15 min/次）、无水乙醇2次（5 min/次）、梯度乙醇（95%→90%→80%→70%，各5 min），蒸馏水浸洗5 min。染色：Mayer苏木素染核5 min（无需分化），PBS返蓝5 min，自来水漂洗30 s；1%水溶性伊红染胞质5 min，自来水漂洗30 s。梯度脱水：95%乙醇2次（30 s、1 min）、无水乙醇2次（5 min/次）、二甲苯2次（5 min/次）。中性树胶封片，风干，显微镜下观察。结果判读：细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。（×100，×200）荧光显微镜下观察。

1.6.7 Western blotting法检测大鼠海马组织Drp1、Mfn1、Mfn2、FiS1蛋白表达

取上述保存于-80 ℃冰箱的海马组织，每个样本称取50 mg左右，置2 mL EP管，加入洗净钢珠及300 μL预冷PIPA裂解液（含1 mmol/L PMSF、1 mmol/L偏钒酸钠），研磨至无明显组织块，12 000 r/min离心5 min，取上清液（-20 ℃保存）。蛋白浓度采用BCA法测定：标准蛋白及样品（PBS稀释）加入96孔板（标准品2个平行孔，样品3个平行孔，20 μL/孔），空白孔加PBS，加入BCA工作液（A液∶B液=50∶1）200 μL/孔，37 ℃避光孵育后测OD值。上清与上样缓冲液按4∶1混合，沸水浴10 min，冷却后-20 ℃保存。SDS-PAGE分离蛋白并转膜，PVDF膜5%脱脂奶粉TBST室温封闭2 h；加一抗：GAPDH（1∶50 000）、Drp1（1∶5000）、Mfn1（1∶500）、Mfn2（1∶500）、Fis1 （1∶500），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5次（5 min/次）；加二抗：HRP标记羊抗兔（1∶1000）或羊抗鼠（1∶10 000）室温孵育2 h，TBST洗5次（5 min/次）。ECL显色液（增强液∶过氧化物酶溶液=1∶1）显色，吸去多余液体，覆保鲜膜，X光胶片曝光、显影、定影，扫描并用IPP分析灰度值。

1.7 统计学分析

采用SPSS 25.0统计软件处理分析，计量资料用均数±标准差，数据符合正态分布并满足方差齐性，则用t检验，组间比较单因素采用One-way ANOVA-Tukey分析，双因素采用Two-way ANOVA-Duncan's Multiple Range Test；方差不齐者用 Kruskal-Wallis 秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠Morris水迷宫实验结果比较

假手术组：出现较短的逃避潜伏期和较集中的游泳轨迹，可认为认知功能正常。治疗后，与假手术组相比，VD组逃避潜伏期显著延长（P<0.001），游泳轨迹更为杂乱；与VD组相比，VD+定位注射等量细胞培养基组差异无统计学意义（P>0.05）；与VD+定位注射等量细胞培养基组相比，VD+NSCs组逃避潜伏期显著缩短（P<0.05），游泳轨迹均较为集中；与VD+NSCs组比较，VD+化瘀通络灸组改善幅度相近，认知差异无统计学意义（P>0.05）；与VD+NSCs相比，VD+NSCs+化瘀通络灸组逃避潜伏期进一步缩短，游泳轨迹更为集中认知差异有统计学意义（P<0.001，图1）。

2.2 各组大鼠海马CA1区TUNEL染色情况及神经元凋亡率比较

与假手术组相比，VD组大鼠海马CA1区神经元凋亡率升高（P<0.001）。与VD组相比，VD+定位注射等量细胞培养基组大鼠海马CA1区神经元凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。与VD+定位注射等量细胞培养基组相比，VD+NSCs组大鼠海马CA1区神经元凋亡率降低（P<0.05）。与VD+NSCs组相比，VD+化瘀通络灸组大鼠海马CA1区神经元凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。与VD+化瘀通络灸组相比，VD+NSCs+化瘀通络灸组大鼠海马CA1区神经元凋亡率降低（P<0.01，图2）。

2.3 各组大鼠海马CA1区脑组织神经干细胞分化情况及不同分组的平均光密度值

与假手术组相比，VD组BrdU、Nestin、GFAP阳性细胞均显著增加（P<0.05，P<0.001，P<0.05）。与VD组相比，VD+定位注射等量细胞培养基组BrdU、GFAP及Nestin阳性细胞差异均无统计学意义（P>0.05）。与VD+定位注射等量细胞培养基组相比，VD+NSCs组BrdU、Nestin阳性细胞增加（P<0.01，P<0.05），GFAP阳性细胞减少（P<0.05）。与VD+NSCs组相比，VD+化瘀通络灸组BrdU、GFAP及Nestin阳性细胞差异均无统计学意义（P>0.05）。与VD+化瘀通络灸组相比，VD+NSCs+化瘀通络灸组BrdU、Nestin阳性细胞进一步增加（P<0.05），GFAP阳性细胞进一步减少（P<0.05，图3）。

2.4 各组大鼠海马CA1区NeuN+DCX检测神经元表达情况及不同分组的平均光密度值

与假手术组相比，VD组神经元排列稀疏，部分形态不规则，成熟神经元大幅丢失（P<0.001），新生神经元生成抑制（P<0.01）；与VD组相比，VD+定位注射等量细胞培养基组与VD组差异无统计学意义（P>0.05）；与VD+定位注射等量细胞培养基组相比，VD+NSCs组神经元排列较整齐，少部分形态不规则，成熟神经元丢失减少（P<0.01），新生神经元生成增多（P<0.001）；与VD+NSCs组比较，VD+化瘀通络灸组差异无统计学意义（P>0.05）；与VD+化瘀通络灸组相比，VD+NSCs+化瘀通络灸组神经元排列整齐，形态规则，成熟神经元未见明显丢失（P<0.05），新生神经元生成促进（P<0.01，图4）。

2.5 各组大鼠海马CA1区脑组织线粒体ROS表达情况

假手术组线粒体ROS含量最低，荧光峰主要集中于低荧光强度区。与假手术组相比，VD组荧光峰明显右移，提示模型建立后ROS水平显著升高（P<0.001），证明建模成功。与VD组比较，VD+定位注射等量细胞培养基组曲线分布基本一致，ROS水平差异无统计学意义（P>0.05）；与VD+定位注射等量细胞培养基组相比，VD+NSCs组荧光峰均左移，ROS水平显著下降（P<0.001）；与VD+NSCs组相比，VD+化瘀通络灸组峰位左移幅度相近，峰形变化趋势一致，ROS水平差异无统计学意义（P>0.05）；与VD+化瘀通络灸组相比，VD+NSCs+化瘀通络灸组荧光峰进一步左移，峰形更接近假手术组，ROS水平进一步下降（P<0.01，图5）。

2.6 各组大鼠海马CA1区脑组织HE染色分析

假手术组海马区结构完整，神经元排列紧密，胞体饱满圆整，无明显萎缩，形态正常。与假手术组相比，VD组海马区出现大面积结构破坏，大量神经元胞体缩小、胞核固缩深染，排列疏松，伴局灶性空洞形成；与VD组相比，VD+定位注射等量细胞培养基组可见结构破坏及大量细胞萎缩，胞核固缩深染，细胞排列稀疏，伴少量空洞；与VD+定位注射等量细胞培养基组相比，VD+NSCs组仅见轻度结构异常及少量神经元胞体萎缩和胞核固缩；与VD+NSCs组相比，VD+化瘀通络灸组亦呈轻度损伤；与VD+化瘀通络灸组相比，VD+NSCs+化瘀通络灸组海马区神经元结构完整，排列紧密，仅见极少量神经元胞体萎缩及胞核固缩，整体结构接近假手术组（图6）。

2.7 各组大鼠海马组织Drp1/Mfn1/Mfn2/Fis1蛋白表达含量的比较

与假手术组相比，VD组Drp1、Mfn1、Mfn2蛋白表达含量下降（P<0.001）、Fis1蛋白表达含量上升（P<0.001）；与VD组相比，VD+等量细胞培养基组Drp1、Mfn1、Mfn2、Fis1蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；与VD+等量细胞培养基组相比，VD+NSCs组Drp1、Mfn1、Mfn2蛋白表达含量上升（P<0.001，P<0.001，P<0.01）、Fis1蛋白表达含量下降（P<0.05）；与VD+NSCs组相比，VD+化瘀通络灸组Drp1、Mfn1蛋白含量差异无统计学意义（P>0.05），Mfn2、Fis1蛋白含量下降（P<0.05）；与VD+化瘀通络灸组相比，VD+NSCs+化瘀通络灸组Drp1、Mfn1、Mfn2蛋白表达含量上升（P<0.001，P<0.01，P<0.01）、Fis1蛋白表达含量下降（P<0.05，图7）。

3 讨论

本研究通过Morris水迷宫实验评估化瘀通络灸联合NSCs移植对VD大鼠学习、行为能力的影响。结果表明VD模型大鼠表现出明显的行为和认知能力下降。NSCs与化瘀通络灸均能有效缓解VD大鼠的认知活动能力。然而，联合干预组在单一干预治疗上表现出更加显著的改善。NSCs具有自我更新与多向分化潜能，其通过持续分化产生新生神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞，从而参与神经组织的再生修复^{［20， 21］}。在缺氧、缺血等病理条件下，NSCs从静息态被激活，经不对称分裂产生一个自我更新的NSC和一个过渡性扩增祖细胞^［22］。该祖细胞增殖并转化为神经母细胞，并在迁移过程中逐步形成功能性神经元或胶质细胞以替代损伤组织，而新生神经元则通过突触重塑整合至现存神经功能网络重建，星形胶质细胞可提供神经营养支持并清除坏死碎片，但过度活化的星形胶质细胞会形成胶质瘢痕，通过阻碍轴突再生与神经回路重建，进而加剧认知功能障碍^［23］。研究发现^［24］相比于模型组，NSCs组大鼠逃避潜伏期较短，相比于NSCs组，NSCs+艾灸组大鼠逃避潜伏期较短，表明艾灸可显著改善VD模型大鼠的认知功能，其机制涉及促进海马区神经再生及突触可塑性重建。此外，艾灸还可抑制脑缺血诱导的星形胶质细胞过度增殖，促进神经干细胞向功能神经元分化，显著减轻海马神经元缺血性损伤并提升其存活率^［25-27］。本研究中假手术组细胞增殖活跃，神经干细胞活性良好，胶质细胞轻度活化，神经元形态正常，存活良好。。发挥协同作用的机制可能与化瘀通络灸抑制神经炎症反应，调节星形胶质细胞活性，从而减轻炎症对NSCs分化的影响，为NSCs移植分化提供了更有利的环境有关^［28］。本研究中，NSCs组和化瘀通络灸组均显著促进了神经元分化和增加了神经细胞数量，提示两者可能通过不同途径共同作用于神经元存活和修复。NSCs可能通过抑制TLR4/MAPK/NF-Κb信号通路并抑制炎症反应，而化瘀通络灸可能通过激活内源性抗氧化系统来发挥作用^{［29， 30］}，其效应或体现在改善局部血液供应和氧合水平、缓解缺血缺氧状态下的细胞能量代谢压力，并减轻线粒体功能负荷，从而为线粒体动力学稳态的重建提供基础。

外膜融合受Mfn1、Mfn2的调节^［31］，而线粒体分裂过程主要受Drp1和其接头蛋白共同调节。线粒体动力学失衡是加重脑缺血损伤和认知功能障碍的首要环节^［32］，线粒体动力学异常是VD的重要发病机制^［33］。而NSCs的分化过程中，线粒体会由多能性状态下的糖酵解代谢转化为氧化磷酸化代谢，线粒体延长呈网状结构，耗氧量和ROS增加，ROS水平可直接调控小鼠祖细胞向神经元或星形胶质细胞谱系的分化命运，从而影响VD功能^{［34， 35］}。本研究显示线粒体裂变-融合动态平衡失调，ROS清除能力减弱，进一步加重线粒体功能障碍，这与严重的神经损伤和认知障碍相一致。与VD组相比，VD+NSCs组和VD+化瘀通络灸组中，ROS水平下降，Fis1的表达得到抑制，Drp1、Mfn1、Mfn2的表达升高，提示线粒体裂变受抑制、融合得到促进，ROS积累减轻，线粒体处于动态平衡稳态。与VD+NSCs组和VD+化瘀通络灸组相比，VD+NSCs+化瘀通络灸组中Fis1表达进一步得到抑制，Drp1、Mfn1、Mfn2表达进一步上调，ROS水平与假手术组接近，提示线粒体功能基本恢复，这与我们的实验结果一致。然而，值得注意的是，VD+NSCs组与VD+化瘀通络灸组在Drp1、Mfn1的蛋白含量上未表现出明显差异，ROS含量变化也不显著，而Mfn2、Fis1的蛋白含量下降，提示化瘀通络灸相较于NSCs治疗VD的作用机制可能通过促进线粒体融合并抑制过度分裂，此结果也与我们之前的研究一致^{［36， 37］}。因此本团队推测其作用机制可能与化瘀通络灸能有效促进脑缺血后的血管新生，改善海马脑组织整体的血流灌注和氧合能力，为移植的NSCs提供存活与分化环境，减轻局部缺血缺氧压力，从而间接稳定线粒体功能有关。可见这些途径并非相互排斥，化瘀通络灸很可能通过多靶点、多层次的综合调控，改善NSCs的生存微环境，从而最大化其发挥治疗潜力，最终在促进线粒体动态平衡、神经发生和认知恢复上展现出显著优势。

线粒体动力学稳态维持的机制在于线粒体网络在分离受损成分与重建功能连接之间保持动态平衡^［38］。Drp1作为线粒体分裂的核心执行蛋白，在分裂位点发生寡聚化，并依赖其GTP酶活性介导膜收缩，最终完成线粒体断裂^［39］。同时Mfn1和Mfn2作为线粒体外膜融合蛋白，可通过形成同源或异源复合体介导相邻线粒体外膜融合，使彼此分离的线粒体重新建立网络连接，从而维持线粒体网络的完整性及功能稳态^［40］。可见Fis1/Drp1介导的分裂过程与Mfn1/Mfn2介导的融合过程并非彼此孤立，而是前后衔接、相互制约。前者将受损或功能异常的线粒体片段从原有网络中分离出来，为其质量控制与更新提供基础；后者则促进功能相对完整的线粒体重新整合入网络，以维持整体网络稳态及代谢适应能力^［41］。基于此，本研究结果显示，联合干预后线粒体动力学相关调控网络发生有利性调整。化瘀通络灸联合NSCs可能通过促进线粒体由异常重塑状态向相对稳定的网络稳态回调，从而为神经元功能维持及损伤修复提供更有利的细胞内环境。

然而本研究在机制深度上仍存在一定局限性：本研究未深入检测与上述推测密切相关的指标，如CD31、特异性炎症因子水平等。基于这些发现和局限，未来的研究方向将着重于利用细胞特异性标记直接在NSCs及其子代细胞中验证线粒体形态、动力学关键蛋白表达定位及ROS水平的变化，以确证其核心作用。其次将系统评估神经血管微环境、神经营养因子谱及炎症状态的影响，以深入阐明具体细胞与分子基础。

综上，化瘀通络灸法可诱导NSCs分化成熟形成有效神经元，提高神经元存活率，改善神经元病理性损伤，从而提高VD大鼠的学习认知能力，其作用机制可能与调控线粒体动力学稳态相关，即上调Drp1、Mfn1、Mfn2，下调Fis1表达，重塑线粒体融合与分裂的动态平衡，减少线粒体氧化应激状态有关。

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