缺血性脑卒中（IS），又称脑梗死，严重影响老年人的身心健康
［1， 2］。该疾病主要由于脑部血液供应突然中断，导致脑组织因缺氧而发生损伤。目前，缺血性脑卒中的主要临床治疗手段包括在发病4.5 h内进行静脉溶栓以及血管内机械取栓，以实现脑血流的再灌注。然而，在血流恢复过程中，脑组织可能遭受进一步损害，即脑缺血再灌注损伤（CIRI）
［3-5］。这种继发性损伤源于缺血期间脑细胞的代谢紊乱，并且在再灌注后因一系列复杂的病理生理过程而加剧，这些过程包括自由基生成与氧化应激、钙离子超载、炎症反应以及细胞凋亡和坏死等
［6］。其中，炎症反应在CIRI的发展中发挥关键作用。研究表明，CIRI会激活小胶质细胞，通过NLRP3炎症小体通路诱导细胞焦亡
［7-9］，进而释放白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）等促炎因子，加重神经炎症反应。
血浆纤维蛋白原（FIB）是一种在血液凝固过程中发挥关键作用的糖蛋白，不仅参与止血与血栓形成，还在维持血管稳态及调控炎症反应中具有重要功能。研究表明，CIRI可导致FIB穿越血脑屏障（BBB），进而激活小胶质细胞中的NLRP3炎症小体
［10］，促进神经炎症的进展。因此，调控FIB介导的小胶质细胞活化及其下游的NLRP3炎症小体通路，可能成为CIRI干预治疗的重要靶点。
中医理论认为，“脑脉”痹阻、血脉瘀滞是缺血性中风的核心病机之一，其本质归属于“血瘀证”，活血化瘀是该证型的经典治法。通窍活血汤（TQHXD）系清代名医王清任所创，为活血化瘀代表方剂，具有活血行气、开窍通络之功效，尤擅治疗头面部血瘀所致诸症，临床上广泛应用于缺血性脑血管疾病的治疗。现代药理研究显示，通窍活血汤可通过扩张血管、改善缺血区域微循环、增加脑血流量，减轻缺血引起的脑组织损伤
［11， 12］，从而改善神经功能缺损及运动功能障碍。
课题组前期研究发现，通窍活血汤不仅能降低大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）模型大鼠血脑屏障的通透性，促进血管新生
［13］，还对缺血性卒中大鼠表现出显著的神经保护作用
［14］，并可修复炎症相关损伤的细胞
［15］，同时促进神经干细胞的增殖与分化
［16］，缓解神经元损伤。此外，通窍活血汤含药脑脊液（TQHXD-CSF）可有效抑制FIB-NLRP3炎症信号通路，减轻小胶质细胞的炎性反应
［17］。然而，通窍活血汤是否可通过调节FIB表达以抑制BV-2细胞中FIB含量，进而减轻对神经元的继发性损伤，尚待阐明。
尽管已有证据表明通窍活血汤在缓解脑缺血再灌注引发的炎症反应方面具有一定疗效，但其对小胶质细胞与神经元之间相互作用的具体调控机制仍不明确。本研究拟通过构建体外氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤的BV-2小胶质细胞与HT22神经元共培养模型，模拟CIRI过程中的神经炎症环境，系统探讨TQHXD-CSF对OGD/R诱导的神经炎症反应的干预效应，旨在为缺血性卒中的临床治疗提供新的理论依据和实验支持，进一步推动通窍活血汤在缺血性脑血管疾病中的临床转化应用。
1 材料和方法
1.1 药物与试剂
通窍活血汤：桃仁90 g、赤芍30 g、川芎30 g、红花90 g、葱30 g、大枣50 g，均由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供；DMEM高糖培养基（山东思科捷生物技术有限公司，货号：CA0002-500ML）；无糖DMEM培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：PM150278）；GAPDH抗体、ZENBIO、β-actin抗体、ZENBIO（Zen bioscience）；NLRP3抗体（货号：ab263899）、ASC抗体（货号：ab309497）（abcam）；IL-1β抗体（货号：16806-1-AP）、IL-18抗体（货号：10663-1-AP）（Proteintech）。
1.2 细胞培养与分组
小鼠小胶质细胞（BV-2）和小鼠海马神经元（HT22）（中国科学院上海细胞生物学研究所）。细胞按标准程序在适宜培养基中培养，选择对数生长期细胞进行实验。采用 Transwell 共培养体系，HT22细胞接种于6孔板下室，BV-2细胞接种于上室Transwell小室，建立共培养模型。
实验细胞随机分为4组：正常对照组（Control）：正常培养条件+空白脑脊液（CSF）；模型组（Model）：OGD/R+FIB处理+空白脑脊液；TQHXD-CSF组：OGD/R+FIB处理+10% TQHXD含药脑脊液；蚓激酶组（Lumbrokinase）：OGD/R+FIB处理+1 μg/mL蚓激酶 +空白脑脊液。仅对上层BV-2细胞进行相应处理，下层HT22细胞不直接给药。
1.3 实验动物
成年雄性SPF级SD大鼠（体质量220~250 g）购买于济南朋悦实验动物繁育有限公司。饲养环境维持在温度22~25 ℃、相对湿度52%~56%，并实行12 h∶12 h光/暗交替。实验获伦理审批（伦理批号：AHUCM-rats-2024106）。
大鼠适应性喂养1周，按照通窍活血汤最佳给药量灌胃4.5 d，每天早晚各1次，最后1次给药1.5 h后，对大鼠进行麻醉，剪除头枕部的毛，颈后部备皮，剪开大鼠头颈部背侧的皮肤，钝性剥离覆盖在枕骨上的肌肉及组织，再将大鼠的颈部弯曲以暴露枕骨大孔，然后用微量进样器从枕骨大孔刺入延髓池，缓慢吸取清亮的脑脊液后，以最快的速度拔出针头，合并脑脊液。将抽取的脑脊液在4 ℃离心机中以3000 r/min离心10 min，收集上清液，在洁净工作台进行无菌操作，用0.22 µm滤膜过滤除菌，-20 ℃条件下冻存备用。平均每只大鼠抽取量约为200 µL。
1.5 OGD/R 模型的建立
HT22细胞以2×10
4/mL的密度接种于12孔板内；BV-2细胞以2×10
3/mL的密度接种于Transwell小室内；置细胞培养箱中培养24 h；待细胞密度达到70%时，将小室取出，置于新的12孔板内，吸去上层小室中的完全培养基，用PBS润洗1次，加入含有筛选浓度FIB的DMEM无糖培养基，将细胞置于三气培养箱中2 h；取出细胞，吸除无糖培养基；加入含有筛选浓度FIB和10%空白CSF的完全培养基，继续正常培养12 h。正常组细胞不取出，继续换液培养。造模结束后将两种细胞一起共培养12 h后进行各种指标检测（
图1）。
1.6 CCK-8检测细胞活力
造模及给药结束后，分别收集 Transwell 上室和 6 孔板下室的培养基，将细胞接种至 96 孔板，设置 6 个重复孔/组。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，铝箔包裹后 37 ℃避光孵育1 h，使用酶标仪检测各组细胞的吸光度A450 nm，计算细胞活力。
1.7 LDH试剂盒检测LDH的释放量
细胞处理完毕后，收集100 μL/孔培养基，1000 r/min离心10 min，取上清作为细胞培养上清液。再向培养板中加入与原培养基等体积的新培养基后置于-80 ℃冷冻约30 min，随后37 ℃温育15 min， 将细胞冻融液1000 r/min离心10 min，取上清，即为细胞冻融液。分别取BV-2细胞培养上清液和细胞冻融液100 μL，加入60 μL LDH检测工作液，混匀，室温避光孵育，计算培养上清液和细胞冻融液中的LDH释放量。
1.8 免疫荧光染色检测小胶质细胞极化
造模及给药后，收集BV-2细胞，经固定、细胞膜渗透、封闭处理后，加入CD86（M1表型标志物）和 CD206（M2 表型标志物）一抗（1∶500）孵育过夜。洗涤后加入荧光二抗（1∶1000）孵育，再次洗涤后通过倒置荧光显微镜观察细胞形态并获取荧光图像，分析CD86和CD206的荧光表达强度。
1.9 流式细胞术检测ROS含量
收集 6 孔板中培养的 HT22 细胞，用 PBS 洗涤后离心，加入稀释后的ROS荧光探针（DCFH-DA），黑暗中孵育30 min。采用流式细胞术检测细胞内 ROS 荧光强度，使用 FlowJo 软件进行数据处理。
1.10 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡
收集 HT22 细胞，离心后用 PBS 洗涤2次，重悬于 1×Annexin V 结合缓冲液中，调整细胞密度至1×10 ⁶/mL。取 100 μL 细胞悬液，加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI 染色液，轻轻混匀后室温避光孵育 15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.11 细胞外囊泡（EVs）提取与鉴定
实验前，细胞在T75烧瓶中添加EV- FBS。治疗前8 h，将培养基交换为无血清培养基。收集的含纤维蛋白原的上清液在37 ℃下与凝血酶（16 U/mg FIB）孵育10 min。从 Transwell 上室收集 BV-2 细胞培养基，按照细胞外囊泡提取试剂盒说明书操作：培养基经离心去除细胞碎片后，取上清液加入萃取液，4 ℃孵育过夜。次日经10 000×g、4 ℃离心 60 min，收集沉淀并重悬于囊泡保存液中，获得 EVs 样品。通过透射电镜观察 EVs 形态，纳米流式细胞仪定量含 FIB 的 EVs 数量。
1.12 Western blotting检测NLRP3炎症小体相关蛋白的表达
将造模给药后的细胞经消化、离心、裂解、离心，提取总蛋白；BCA法进行蛋白定量；电泳分离蛋白质；转膜；免疫显影，检测NLRP3，Caspase-1，GSDMD，ASC，IL-1β，IL-18蛋白的表达。
1.13 Pull-down检测NLRP3与FIB的相互作用
将对数生长期的BV-2细胞与HT22细胞种于T25细胞瓶中，待细胞密度达到90%左右，进行造模处理后，收集细胞。在裂解液上清中加入适量体积的50%谷胱甘肽-琼脂糖凝胶，4 ℃摇床孵育30 min后4000 r/min离心5 min，弃上清。加入PBS轻轻重悬后，4000 r/min离心5 min，弃上清，重复2次。混合含有FIB-GST蛋白和含有NLRP3蛋白的溶液，将混合液在4 ℃旋转仪上混匀孵育过夜。4000 r/min离心5 min，弃上清后用预冷的缓冲液进行洗涤后离心，重复3次。吸干琼脂糖凝胶上层的水分后，加入20 μL蛋白上样缓冲液，95 ℃煮10 min后，进行后续的Western blotting检测。
1.14 统计学分析
所有实验数据采用 GraphPad Prism 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。P<0.05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 BV-2细胞造模前后形态变化
通过对BV-2细胞造模前后的形态进行拍照发现（
图2），正常培养的BV-2细胞主要呈现梭形、不规则长条形或带有细长伪足的分枝状形态，胞体扁平、伸展，突起明显且分散。细胞发生显著形态改变，转变为圆形/类圆形的阿米巴样形态，胞体收缩变圆，突起减少或消失，细胞聚集性增加，整体呈现更饱满的圆球状外观。这种阿米巴样形态是小胶质细胞被激活后的典型表现，提示FIB+OGD/R诱导可以使BV-2细胞从静息状态转变为激活的效应状态。
2.2 TQHXD-CSF升高细胞活性
通过CCK-8试剂盒对Transwell培养体系的BV-2细胞和HT22细胞活力分别进行检测发现OGD/R+FIB损伤会造成BV-2细胞活力下降（
P<0.01，
图3A），位于孔板内的HT22细胞活力也会受到影响（
P<0.01，
图3B）；经过TQHXD-CSF干预一段时间后，两种细胞的细胞活力均上升。通过LDH试剂盒对Transwell培养体系的BV-2细胞和HT22细胞上清液中LDH释放量分别进行检测发现OGD/R+FIB损伤会造成BV-2细胞（
P<0.01，
图3C）和HT22细胞（
P<0.01，
图3D）LDH的释放量上升，TQHXD-CSF和Lumbrokinase均可以降低两种细胞的LDH释放量。
2.3 TQHXD-CSF调控BV-2细胞极化平衡
造模给药后的细胞形态显示，OGD/R+FIB损伤会促使BV-2细胞向M1促炎表型极化，表现为细胞核肿大、呈阿米巴样；而TQHXD-CSF能显著修复这一损伤，使BV-2细胞核肿大现象减轻、呈圆形，部分细胞核恢复至正常状态，Lumbrokinase干预也可修复BV-2受损细胞形态，使其趋于正常。与此同时，免疫荧光检测结果表明，模型构建后BV-2细胞中M1型标志分子CD86的荧光信号明显增强，而M2型标志物CD206的表达水平改变无统计学意义；经TQHXD-CSF干预后，CD86的荧光强度显著降低，CD206表达则明显升高，Lumbrokinase处理组亦表现出相似的变化趋势（
P<0.01，
图4）。
2.4 TQHXD-CSF 减少含 FIB 的 EVs 释放
电镜观察显示，EVs呈现典型的茶托样双层膜结构，大小分布在30~200 nm，符合国际细胞外囊泡学会（ISEV）所建议的EVs形态特征和粒径标准，说明所分离的EVs具有较高的纯度和结构完整性，适用于后续的流式细胞术分析（
图5A）。通过流式细胞术检测发现，与Control组相比，Model组中表达FIB的EVs数量明显增多；而经TQHXD-CSF处理后，携带FIB的EVs水平降低（
P<0.01，
图5B）。
2.5 TQHXD-CSF降低HT22细胞 ROS生成
流式细胞术检测结果（
P<0.01，
图6）显示，与对照组相比，模型组HT22细胞内ROS水平明显升高；经TQHXD-CSF干预后，ROS的生成降低。
2.6 TQHXD-CSF 抑制 HT22 细胞凋亡
Annexin V-FITC/PI双染法检测结果（
P<0.01，
图7）显示，与对照组相比，模型组HT22细胞的凋亡比例明显上升；而经TQHXD-CSF干预后，细胞凋亡水平下降（
P<0.01）。
2.7 TQHXD-CSF 抑制 NLRP3 炎性体激活
Western blotting结果显示，与正常对照组相比，模型构建后HT22细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-1β、IL-18的蛋白表达均升高，而经过TQHXD-CSF和Lumbrokinase的干预后，NLRP3、Caspase-1、GSDMD、ASC、IL-1β、IL-18的蛋白表达均受到抑制（
P<0.05，
图8）。
2.8 FIB与NLRP3存在直接的相互作用
将带有GST标签的“诱饵蛋白”（GST-FIB）与带有His标签的“猎物蛋白”（His-NLRP3）在体外进行共孵育，NLRP3能够被GST-FIB有效沉淀，表明FIB与NLRP3之间存在直接且特异性的相互作用（
图9）。
3 讨论
脑缺血再灌注损伤是由于脑组织长时间缺血后，当血流恢复时反而引发细胞发生不可逆性损害甚至死亡的现象，其中炎症反应是该过程中的关键病理特征。本研究采用 Transwell 共培养系统构建脑缺血再灌注的模拟微环境，旨在探究 TQHXD-CSF 对OGD/R+FIB条件下小胶质细胞与神经元相互作用的调节效应及其潜在机制，从而为通窍活血汤 在缺血性脑卒中临床治疗中的应用提供新的实验支持。
FIB是一种由肝细胞合成与分泌的四聚体糖蛋白（α₂β₂γ₂），在机体凝血与止血过程中发挥关键作用，同时也是多种血栓性疾病的独立危险因素，其水平升高已成为临床评估疾病进展的重要生物标志物。缺血性脑卒中发生后，血脑屏障受损破坏，为血浆 FIB 侵入脑组织提供了病理条件
［19-22］。本研究结果证实，FIB 可通过与 NLRP3 直接结合，激活神经细胞内 NLRP3 炎性小体；NLRP3 作为核心炎症反应分子，其表达水平常被用于反映细胞炎症损伤程度。在 NLRP3 炎性小体组装与活化过程中，ASC 发挥关键接头作用，负责连接受体蛋白与效应蛋白
［23， 24］；活化的 NLRP3 可进一步调控 Caspase‑1 剪切激活，并介导 GSDMD 发生自切割与活化，进而在天然免疫应答中促进促炎细胞因子前体 pro‑IL‑18与pro‑IL‑1β的成熟与分泌
［25， 26］。上述 FIB‑NLRP3 相互作用可触发下游 Caspase‑1 活化、GSDMD 剪切等级联反应，最终推动 IL‑1β、IL‑18 等促炎因子大量释放，同时诱导小胶质细胞向 M1 型促炎表型极化，进一步放大并加剧神经炎症反应
［27， 28］。此外，OGD/R 联合 FIB 损伤还可刺激 BV‑2 细胞释放富含 FIB 的EVs，扩大炎症损伤范围，加剧 HT22 神经元内 ROS 过量生成与凋亡水平升高。上述结果与既往报道 “FIB 参与脑缺血后炎症级联反应” 的研究结论一致
［29， 30］，明确FIB‑NLRP3 通路在脑缺血再灌注损伤中发挥关键调控作用，是干预脑缺血后神经炎症的重要潜在靶点。
研究表明，脑缺血性损伤引起的神经炎症表现为中枢神经系统驻留小胶质细胞的激活，活化的小胶质细胞可以极化为促炎的M1型或抗炎型M2型
［31-33］。课题组之前的研究也发现当小胶质细胞受到缺糖缺氧或者炎症刺激时，其胞质内的NLRP3炎症小体数量会异常增多，给予FIB刺激小胶质细胞后，其体内的NLRP3表达也显著增多
［17］。本研究发现，TQHXD-CSF 显著抑制 BV-2 细胞向 M1 表型极化，下调 CD86 表达，同时促进其向 M2 抗炎表型转化，上调 CD206 表达，恢复小胶质细胞极化平衡，减少促炎因子释放。共培养体系制造了TQHXD-CSF只接触BV-2细胞而不接触HT22细胞的可能，本研究证实，TQHXD-CSF有效减少 BV-2 细胞含 FIB 的 EVs 分泌，切断FIB向神经元的传递途径，进而抑制 HT22 细胞中 NLRP3炎性小体激活，降低 NLRP3、ASC、Caspase-1 等相关蛋白的表达水平。这一系列调控最终改善了神经元的氧化应激状态，减少 ROS 生成，降低神经元细胞凋亡率，提升细胞活力，与Lumbrokinase组的干预效果相当，验证了TQHXD-CSF 对 FIB-NLRP3 通路的特异性抑制作用。
本研究的创新点在于明确了 TQHXD-CSF 通过抑制含 FIB 的 EVs 释放，阻断 FIB 与 NLRP3 的相互作用，进而调控小胶质细胞极化和神经元细胞NLRP3 炎性小体活化的分子机制，为中医活血化瘀法治疗缺血性脑卒中提供了现代生物学解释。同时，含药脑脊液的应用更贴近体内药物作用的真实环境，提高了实验结果的临床转化价值。但本研究仍存在一定局限性：未深入探讨 TQHXD-CSF 中发挥核心作用的活性成分，需通过成分分离与鉴定明确其物质基础；其次，对 EVs 的具体亚型及 FIB 在 EVs 中的装载机制未展开研究，未来可进一步细化相关调控环节。
综上所述，TQHXD-CSF 可通过抑制 OGD/R +FIB损伤后 BV-2 细胞释放含 FIB 的EVs，阻断 FIB 与 NLRP3 的直接相互作用，进而抑制 NLRP3 炎性小体活化及小胶质细胞 M1 型极化，减轻神经元的氧化应激损伤和凋亡，最终发挥神经保护作用。本研究揭示了 通窍活血汤 治疗缺血性脑卒中的新机制，为其临床应用提供了实验支撑，也为缺血性脑卒中的靶向治疗提供了新的思路。
安徽省高校优秀科研创新团队项目(2022AH010034)
安徽省高等学校科学研究重点项目(2023AH050738)
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