关节置换术显著改善了终末期关节疾病患者的疼痛与功能，但其术后并发症——关节假体周围感染（PJI）依然是骨科面临的严峻挑战。PJI不仅致残率高，还导致治疗周期延长及医疗成本激增
［1， 2］。临床上PJI 难以根治的核心原因在于致病菌易在假体表面形成生物被膜
［3］，这种复杂的细菌群落能有效抵御抗菌药物的渗透，并协助细菌逃逸宿主免疫监视
［4，5］，致使局部炎症持续存在，最终演变为难治性的慢性感染
［6］。此外，最新研究表明，金黄色葡萄球菌（
Staphylococcus aureus）甚至能入侵骨细胞的陷窝-小管系统，即使在宿主强烈的炎症反应下也能实现长期胞内存活，这是慢性感染难以根除的重要解剖学基础
［7］。
尽管目前对PJI的病原学特征已有深入认识，但其免疫病理机制，特别是慢性感染阶段的局部微环境重塑过程，尚不完全清楚。一个关键的科学问题在于：在细菌持续抗原刺激下，宿主能否在假体周围建立起有组织的适应性免疫防御？既往观点倾向于认为PJI的局部免疫反应主要表现为中性粒细胞等固有免疫细胞的无序浸润，这种低效的防御往往不足以清除固着的细菌生物被膜。
值得注意的是，近期在自身免疫性疾病、慢性炎症及肿瘤等非淋巴组织中，研究者观察到一种异位的淋巴样新生组织——三级淋巴结构（TLS）
［8］。与先天发育的次级淋巴器官不同，TLS是一种在慢性抗原持续诱导下后天获得的适应性免疫结构。TLS在组织学和功能上与二级淋巴器官（如淋巴结）高度相似，一般表现为相对独立的T细胞区和B细胞区，并伴有滤泡树突状细胞（FDCs）网络及高内皮微静脉（HEVs）的形成
［9］。相关的功能研究表明，TLS能够有效招募并激活淋巴细胞，促进局部抗原的特异性免疫应答，对疾病进程产生重要影响
［10］。在肿瘤研究领域，TLS的存在已被证实与更强的抗肿瘤免疫反应及更佳的临床预后密切相关
［11］。
然而，截至目前，PJI领域关于TLS的研究仍十分有限，其是否存在于假体周围慢性炎症组织中、是否参与感染的免疫调控过程，尚缺乏直接证据。鉴于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等病原体可引发长期、持续的抗原刺激，我们推测在MRSA所致慢性PJI微环境中，假体周围组织可能诱导TLS形成，作为宿主限制感染扩散的一种局部免疫组织形式
［12］。这些结构可能通过促进抗原呈递、诱导特异性抗体产生及激活效应T细胞，在慢性感染过程中发挥重要作用。
基于上述背景，本研究拟构建接近临床特征的小鼠膝关节MRSA假体感染模型，系统观察假体周围组织中TLS的存在情况及其基本结构特征，并初步探索其与慢性感染之间的关系，从而为阐明PJI慢性化的免疫学机制提供新的实验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
23周龄雄性C57BL/6J小鼠，购自南方医科大学实验动物中心（SPF级），实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2025-0053。所有动物饲养及实验操作均在广州铂晋生物科技有限公司实验动物中心完成（实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2023-0343）。本研究已获得广州铂晋生物科技有限公司实验动物伦理委员会批准（伦理批号：BG-AMS-250925-CH01-Y）。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）USA300菌株（实验室保存）。3D打印钛合金（Ti6Al4V）小鼠膝关节假体（广东省科学院新材料研究所；粉末原料：EOS GmbH），1.25%三溴乙醇（Sigma-Aldrich），聚维酮碘（山东利尔康医疗科技有限公司），磷酸盐缓冲液（PBS）（江苏凯基生物技术有限公司），Luria-Bertani（LB）培养基、TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）染色试剂盒、中性树胶、EDTA抗原修复液、山羊血清封闭液（北京索莱宝科技有限公司）。苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（安徽雷根生物技术有限公司），4%多聚甲醛、10% EDTA骨组织脱钙液（安徽白鲨易生物科技有限公司），石蜡包埋剂（Leica）。抗小鼠 B220、CD3、CD21抗体（华安生物技术有限公司），DAPI 染液、抗荧光淬灭封片剂（Sigma-Aldrich），多重免疫荧光TSA试剂盒（长沙晨辰医药科技有限公司）。牙科钻（W&H），Stemi 508小动物体式显微镜、荧光显微镜（Zeiss），分光光度计（Thermo Fisher Scientific），GDINM-D150 3D打印机（广东省科学院新材料研究所），恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），超净工作台（苏净安泰科技有限公司），石蜡包埋机、全自动轮转式切片机（Leica）。
1.2 方法
1.2.1 菌株培养与准备
将MRSA USA300菌株接种于LB液体培养基，在37 ℃、180~200 r/min振荡培养至对数生长期。收集菌液，离心去除上清后用无菌PBS洗涤3次，去除残余培养基。利用分光光度计测定A600 nm，参照标准曲线换算菌液浓度，并结合平板菌落计数法进行校准。最终配制成1×106 CFU/mL储备液，置于冰上备用。
1.2.2 3D打印假体的设计与制备
根据C57BL/6J小鼠膝关节股骨远端解剖结构，使用三维建模软件设计微型膝关节假体（
图1A）。本实验前期采用Ti6Al4V ELI（Grade 23，EOS GmbH）球形粉末，其化学成分如
表1所示。本研究使用广东省科学院新材料研究所自主研发设备GDINM-D150增材制造系统进行样品的制备。将设计文件导入选择性激光熔化（SLM）3D打印机，使用Ti6Al4V粉末打印假体（
图1B）。打印完成后，对假体进行清洗、超声、灭菌等后处理，备用。
1.2.3 小鼠膝关节置换模型的建立
23周龄C57BL/6J小鼠在腹腔注射1.25%三溴乙醇麻醉后，于膝关节前内侧做小切口，逐层切开皮肤、筋膜，显露关节腔。切断髌骨韧带以后，将髌骨移至外侧，充分暴露胫骨平台便于操作。切除双侧半月板及前交叉韧带，用显微剪将后交叉韧带推至内侧。用牙科钻磨平胫骨平台，并在胫骨近端髓腔开入口，将消毒好的假体稳固植入。植入完成后髌骨复位，分层缝合关节囊、筋膜和皮肤，全程保持无菌操作以减少手术感染。术后密切观察小鼠情况。在术后及时给予镇痛处理，连续3 d。
1.2.4 PJI模型的诱导
在假体植入以后，立即通过原手术切口向关节腔内注射10 μL浓度为1×106 CFU/mL的MRSA USA300菌液（共1×104 CFU）。假体组在相同手术操作后仅注射等体积的无菌PBS。每组6只，全程保持无菌操作以减少手术感染，术后密切观察小鼠情况。
1.2.5 样本收集
术后60 d，麻醉并处死小鼠。无菌条件下完整剥离包括股骨远端、胫骨近端及周围的软组织，并同时采集小鼠脾脏组织作为免疫染色的阳性对照。将上述软组织样本置于4%多聚甲醛中固定24~48 h。考虑到骨组织较长时间的脱钙过程可能会破坏相邻软组织中TLS的抗原表位与精细形态，本研究采取了软组织与骨组织分离取材的策略。固定后的骨组织置于EDTA 脱钙液（pH 7.4），进行为期 2~3 周的脱钙处理（期间每周更换2次新鲜脱钙液），直至大头针可轻松刺入组织。
1.2.6 软组织处理与HE染色
固定后的软组织经梯度酒精脱水后，使用石蜡包埋剂包埋，制作石蜡切片（厚度约4 μm）。切片按照标准苏木精-伊红（HE）染色流程进行染色，脱水透明后用中性树胶封片。在光学显微镜下观察并采集图像。
1.2.7 假体周围骨组织的TRAP染色评估
脱钙后的骨组织经梯度酒精脱水-石蜡包埋-制作石蜡切片（厚度约4 μm）-脱蜡水化。按照TRAP染色试剂盒说明书进行操作，在显微镜下观察破骨细胞的分布与活性状态。
1.2.8 多重免疫荧光（mIF）染色
取石蜡切片。使用EDTA抗原修复液微波炉煮沸并放入65 ℃水浴锅1 h，取出并冷却至室温。用含山羊血清的封闭液室温封闭1 h。滴加B220、CD3、CD21的一抗混合液，4 ℃孵育过夜。次日用PBS洗涤后，滴加相应的荧光二抗混合液，避光孵育1 h。PBS洗涤后，用含DAPI的封片剂封片。在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下采集图像并分析。
1.2.9 统计学分析
采用GraphPad Prism 9.0和ImageJ软件进行数据分析与图表绘制。计量资料若符合正态分布，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验；若不符合正态分布，则采用非参数Mann-Whitney U检验。所有动物实验均独立重复3次，每组动物样本量n=6。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠膝关节PJI模型的成功建立与验证
图3A展示了模型建立的关键手术步骤。此外，术后28 d X线检查（
图3B）显示，两组小鼠的假体均稳固位于胫骨近端髓腔内，未出现松动、移位或骨溶解，证实假体植入手术操作可靠。外周血炎症指标的动态监测结果（
图3C）显示：术后7 d，PJI组小鼠外周血WBC、ESR及CRP水平与假体组相比，差异均无统计学意义（
P>0.05）。术后21 d时，PJI组的上述3项炎症指标均急剧升高，显著高于假体组（
P<0.0001），提示模型中已形成明显的系统性炎症反应。
2.2 HE染色结果显示PJI组形成高度组织的细胞聚集体
HE染色镜检发现：在PJI组中，关节周围软组织内可见大量致密的炎性细胞浸润，边界清晰、形态类似淋巴滤泡的圆形或卵圆形聚集结构，部分甚至形成了生发中心样结构（
图4A~C）。而假体组小鼠膝关节周围仅见少量散在的炎性细胞浸润，组织结构清晰（
图4D~F）。
对各组病理切片中的淋巴聚集灶及成熟TLS进行形态学勾勒与截面积定量分析，结果显示：PJI组中诱导形成的成熟TLS平均截面积达到了17 212.10± 7624.28 μm²，显著高于假体组微小且散在的淋巴聚集灶750.09±371.01 μm²，两组间差异具有统计学意义（
P<0.01，
图4）。
2.3 mIF染色提示PJI组细胞聚集体为典型三级淋巴结构
2.3.1 免疫细胞谱系全景分析
CD45⁺细胞的聚集特征 结合HE与mIF染色结果观察，在PJI组假体周围组织中，CD45（红色）呈强阳性，证实该聚集体主要由免疫细胞构成，且与周围非免疫组织（如肌细胞）界限分明。在聚集体内部，CD3⁺ T细胞（黄色）呈高密度聚合，与CD45信号高度共定位；同时，CD21⁺ FDCs（绿色）呈现明确表达，主要局限于特定的CD45阳性区域内，并与 CD3⁺ T细胞呈现出空间上相对分离的分布特征，提示TLS内部已存在一定程度的功能分区（
图5A~D）。相较之下，假体组小鼠关节周围组织中的CD3⁺、CD21⁺及CD45⁺荧光信号均极其微弱且呈散在分布，未观察到明显的免疫细胞聚集现象（
图5E、F）。
2.3.2 T/B淋巴细胞空间分区及CD21⁺ FDC网络的区域化分布特征
结合HE与三通道mIF染色结果显示，PJI组假体周围组织中可见典型的淋巴细胞空间分区结构（
图6A、B）。B220⁺ B细胞（黄色）主要聚集形成致密的滤泡样区域，CD3⁺ T细胞（红色）则分布于其周围，呈环形或弥散状包绕，形成T/B分区界面；CD21⁺ FDCs（绿色）在PJI组中呈现明显表达，并在B细胞富集区域内形成致密的网状结构，其空间分布与B220⁺ B细胞高度一致，而与CD3⁺ T细胞区域基本不重叠。相较之下，假体组组织中未观察到上述区域化分布结构，仅见散在的免疫细胞信号（
图6C、D）。此外，阳性对照（小鼠脾脏）切片展示了经典的白髓结构（
图6E、F），其内部 CD21⁺、CD3⁺及 B220⁺细胞的空间分布模式与PJI组中观察到的成熟TLS结构高度相似。
2.3.3 成熟TLS的功能活性鉴定：局部淋巴细胞增殖与HEV的形成
mIF染色结果显示，在PJI组小鼠假体周围组织的成熟TLS内部，尤其是富含B220⁺细胞的生发中心样区域，可见大量Ki67强阳性细胞，提示局部存在活跃的淋巴细胞增殖（
图7A）。同时，在TLS的边缘及实质内观察到明确表达PNAd的微血管结构，提示HEVs的形成（
图7B）。相较之下，假体组小鼠假体周围组织中几乎未见成簇的Ki67⁺增殖细胞及PNAd⁺微血管网络（
图7A、B）。
2.4 评估PJI模型假体周围骨组织的破骨细胞活化
组织学观察显示，在PJI组中，小鼠假体周围骨表面可见大量胞浆呈紫红色的TRAP阳性多核巨细胞（破骨细胞）聚集；而假体组骨表面仅见极少量散在的TRAP阳性细胞。骨形态计量学定量分析显示，PJI组骨表面破骨细胞数量（N.Oc/BS）达到了（28.75±4.13）/mm，显著高于假体组的（1.63±0.74）/mm，两组间差异具有统计学意义（
P<0.0001，
图8）。
3 讨论
本研究利用3D打印钛合金假体成功构建了小鼠膝关节 PJI 模型，并在组织病理学层面证实了假体周围慢性感染微环境中TLS的异位生成。既往 PJI 动物模型多数采用克氏针或光滑钛钉直接植入到胫骨髓腔里，这种固定方式往往难以精确模拟临床关节置换术后的真实生物力学环境，且容易因假体微动导致早期无菌性松动或脱出，难以维持长期的慢性感染状态
［13， 14］。本研究采用的3D打印Ti6Al4V假体在解剖结构与生物力学上高度契合小鼠生理特征，其多孔表面设计不仅促进了初始的骨整合
［15］，更保证了假体的长期在位稳定性
［16］。此外，已有研究证实多孔钛合金支架的孔径参数能显著影响新生血管长入，同时影响巨噬细胞的极化状态，进而调节局部的免疫微环境
［17］。这种力学稳定基础上持续存在的感染微环境，为MRSA在假体表面形成成熟生物被膜以及宿主免疫系统的长期重塑提供了必要条件，这也是本研究能够观察到典型TLS形成的关键前提。本研究通过定量分析进一步证实，PJI组中诱导形成的成熟TLS平均截面积显著大于假体组的微小淋巴细胞聚集灶，从而为慢性感染驱动大规模TLS形成提供了有力的形态学证据。
长期以来，研究人员普遍认为PJI的局部免疫反应主要表现为无序的中性粒细胞浸润和非特异性的淋巴细胞聚集，缺乏有效的组织架构
［18］。然而，本研究的免疫荧光全景分析揭示了一个截然不同的现象：在慢性感染阶段，PJI微环境中的宿主免疫应答呈现出高度的区域化特征。我们观察到的“B220⁺ B细胞居中，CD3⁺ T细胞环绕”的簇状分布模式，与淋巴结等次级淋巴器官的解剖结构高度一致
［19］。这种 T、B 细胞区的严格分离并非随机聚集，而是淋巴样组织发育成熟的典型标志
［20］。现有研究表明，这种结构重塑往往受控于特定的趋化因子轴（如CXCL13-CXCR5 和CCL19/CCL21-CCR7 轴）
［21-23］。这提示在MRSA 持续释放的生物被膜抗原刺激下，假体周围滑膜组织发生了淋巴新生，宿主免疫系统试图通过构建这种类淋巴器官结构，在感染局部建立特异性免疫应答的局部反应中心，以弥补外周淋巴器官远程调控免疫反应的滞后性
［24］。类似的异位淋巴样结构已在结核分枝杆菌感染的肺部
［25］及幽门螺杆菌感染的胃黏膜
［26］中被证实，这些结构被研究人员认为是宿主为了在感染局部环境维持高浓度抗体滴度而建立的类似的局部适应性免疫应答位点。
本研究最显著的发现之一，是在这些淋巴聚集体中检测到了致密的CD21⁺ 滤泡树突状细胞（FDC）网络。在经典免疫学中，FDCs不仅是TLS结构稳态的物理支架，更是启动高效体液免疫应答的关键调控节点
［27，28］。FDCs具有独特的Fcγ受体和补体受体（CR1/CR2），能够捕获并长期保留天然构象的抗原-抗体复合物，形成抗原库供 B 细胞反复识别
［29］。本研究中CD21⁺ FDC与B细胞滤泡的高度共定位，强烈暗示了PJI局部的TLS已具备支持生发中心反应的结构基础。在这种微环境中，B细胞可能在T滤泡辅助细胞的协助下，进行体细胞高频突变和抗体类别转换
［30］。此外，本研究进一步检测到成熟TLS内部生发中心样区域存在大量Ki67⁺细胞，且其边缘形成了表达PNAd的HEV网络。Ki67⁺增殖细胞不仅直接证实了淋巴细胞在局部的活跃增殖与克隆扩增，而PNAd⁺ HEV的出现则提示该异位淋巴组织已构建了招募外周循环免疫细胞的专属微血管系统。这些功能学标志物与FDC网络的共存，提供了超越单纯形态学的有力证据，这意味着假体周围组织正在尝试原位产生针对MRSA的高亲和力特异性抗体，而非单纯依赖血液循环中的抗体渗出。这一发现丰富了我们对PJI慢性化机制的理解——即局部组织可能已经具备了独立运作的适应性免疫功能。
尽管TLS的形成通常被视为机体抗感染能力的提升，但在PJI的特定背景下，其作用可能具有复杂的病理生理学双重调节作用
［31］。一方面，TLS作为局部的特异性体液免疫效应中心，通过募集淋巴细胞和产生特异性抗体，可能有助于限制MRSA的全身扩散。这也解释了为何本研究中PJI组小鼠虽然局部骨与软组织感染严重，但并未发生致死性的全身脓毒血症，且外周血炎症指标在后期趋于稳定
［32］。但另一方面，过度的淋巴新生与慢性炎症的持续及组织损伤密切相关。值得注意的是，近年来的骨免疫学研究发现，激活的B细胞和T细胞是核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的重要来源之一
［33-35］。在类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中，滑膜异位淋巴结构中的B细胞已被证实可分泌大量RANKL，直接驱动破骨细胞的分化与骨吸收
［35］。这种免疫细胞与骨代谢细胞之间的交互作用是骨免疫学的核心内容
［36］。特别是Th17细胞已被证实能通过分泌IL-17诱导成骨细胞表达 RANKL，从而间接促进破骨细胞分化
［37］。在本研究的PJI模型中，持续存在的TLS若无法彻底清除受生物被膜保护的细菌，极可能转变为一个病理性的RANKL分泌中心，进而打破局部的骨代谢平衡，加剧假体周围的骨溶解与假体松动
［38］。因此，PJI中的TLS究竟是保护性的免疫屏障，还是导致骨破坏的免疫病理基础，将是后续研究的核心问题。
本研究尚存在一定局限性。首先，我们仅观察了术后60 d这一单一时间点，未能完整描绘TLS从诱导到成熟的动态演变过程及其与趋化因子表达谱的时空关联。其次，为了最大程度保留感染部位软组织的完整形态以进行高质量的组织学与多重荧光观察，所有动物标本均进行了整体固定处理。因此，本研究未能获取新鲜组织匀浆以检测局部针对MRSA的特异性抗体滴度，亦未能对拔除的假体表面生物被膜进行定量的超声洗脱菌落分析。未来的研究需聚焦于以下方向：（1） 在局部组织液或培养物中获取特异性抗体分泌的直接定量证据；（2） 探究TLS内部RANKL/OPG的表达比例，以明确其在感染性骨溶解中的具体贡献。这些研究将有助于我们更全面地评估TLS作为难治性PJI免疫治疗靶点的潜力。
此外，在探究 TLS 形成与局部骨溶解病理结局的空间相关性时，为了最大程度地保证软组织中 TLS 精细结构及其抗原表位的完整性，以便进行高质量的多重免疫荧光分析，我们对假体周围的骨组织和软组织采取了分离取材与独立处理的策略。这一必要的实验设计取舍，限制了我们在同一含金属假体的骨标本上，利用高分辨率Micro-CT同步获取TLS空间分布与三维宏观骨微结构改变的影像学定量数据。然而，我们通过对独立取材的骨组织进行特异性的TRAP染色，在细胞层面上直接证实了同一局部炎症微环境中破骨细胞的高度活化与骨吸收结局，从微观病理学角度弥补了这一不足。未来研究可考虑采用脱钙后高分辨显微影像技术或空间转录组学，以更直观地原位解析TLS与骨破坏区域的交互机制。
综上所述，本研究的免疫学观察为PJI免疫病理研究提供了新的视角。我们在PJI微环境中证实了TLS的存在，从组织学层面进一步阐释了PJI慢性化的免疫学基础。TLS的形成提示局部适应性免疫在持续感染过程中被重新组织和维持，可能在宿主防御与病原持留之间发挥关键调控作用。本研究不仅加深了对PJI致慢性免疫病理机制的理解，也为靶向TLS的免疫调控策略提供了理论依据，有望通过增强保护性免疫或抑制病理性免疫反应，为难治性PJI的免疫治疗探索新的干预思路。
广东省自然科学基金(2026A1515011093)
南方医科大学第三附属医院院长基金(YL202202)
京公网安备11010202008535号
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