甲基结合蛋白1对人脐静脉内皮细胞迁移、增殖以及血管形成的影响

MBD1 knockdown inhibits proliferation, migration and angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells in vitro

摘要

目的 探讨甲基结合蛋白1（MBD1）对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖、迁移以及血管形成的影响。 方法 设置MBD1敲低（sh-MBD1）组和对照（sh-NC）组。使用靶向人MBD1基因shRNA LV3（H1/GFP&Puro）-MBD1-HOMO-270的慢病毒液和携带Scramble shRNA的慢病毒液LV3（H1/GFP&Puro）-NC感染HUVECs细胞，使用嘌呤霉素筛选感染成功的细胞。通过实时定量PCR（RT-qPCR）以及蛋白质印迹检测MBD1基因的沉默效率。通过CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期改变，细胞划痕实验以及Transwell实验检测细胞迁移速度，血管形成实验检测MBD1对HUVECs的血管形成能力的影响，免疫荧光检测MBD1对HUVECs中血管内皮生长因子A（VEGFA）表达的影响。 结果 成功构建MBD1敲低的HUVECs；与sh-NC组相比，sh-MBD1组细胞的增殖能力、增殖指数以及迁移能力显著降低（P<0.0001）；sh-MBD1组细胞体外生成的血管总长度、血管闭合环路以及血管分支点均低于sh-NC组细胞（P<0.01）；sh-MBD1组细胞中VEGFA表达量较对照细胞显著降低（P<0.0001）。 结论 MBD1促进人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和血管形成，且促进作用可能通过调控VEGFA的表达实现。

Abstract

Objective To investigate the effects of methyl-CpG binding domain protein 1 (MBD1) on proliferation, migration, and angiogenesis in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Method Cultured HUVECs were infected with a lentivirus carrying sh-MBD1 or a scramble shRNA (sh-NC), and the successfully infected cells were screened using puromycin. RT-qPCR and Western blotting were used to assess MBD1 gene silencing efficiency. The changes in proliferation, cell cycle, and migration of the infected cells were assessed using CCK-8 and colony formation assays, flow cytometry, scratch assay, and Transwell assay. The impact of MBD1 knockdown on angiogenic capacity of HUVECs was evaluated using angiogenesis assay. Immunofluorescence staining was used to investigate the expression of vascular endothelial growth factor A (VEGFA) in the infected HUVECs. Result Compared with the sh-NC cells, HUVECs infected with the lentivirus carrying sh-MBD1 exhibited significantly reduced proliferation capacity and migration ability. The total length of vessels formed in vitro, closed vascular loops, and the number of branching points were all lower in sh-MBD1 cells than in sh-NC cells. VEGFA expression was significantly reduced in sh-MBD1 cells compared to the sh-NC cells. Conclusion MBD1 promotes proliferation, migration, and angiogenesis of HUVECs possibly by regulating the expression of VEGFA.

Graphical abstract

关键词

血管形成 / 甲基结合蛋白1 / 人脐静脉内皮细胞 / 血管内皮生长因子A / 细胞增殖 / 细胞迁移

Key words

angiogenesis / methyl-CpG-binding domain protein 1 / human umbilical vein endothelial cells / vascular endothelial growth factor A / cell proliferation / cell migration

血管形成是指从已有的血管上“长”出新血管的生理过程，是机体生长、修复、疾病进展中的关键环节^［1-4］。在健康组织中，通过血管发生、出芽式血管生成和套入式血管生成形成新的功能性血管^［5-7］。研究发现多种内源性转录因子通过靶向血管内皮生长因子（VEGF）进而促进血管的形成^{［8， 9］}。另一方面，表观遗传调控如DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等在血管生成中也发挥重要作用^{［10， 11］}。有研究报道敲低m⁶A甲基转移酶METTL3可减少血管内皮生长因子A（VEGFA）mRNA的m⁶A修饰，削弱其稳定性，导致VEGFA蛋白下降 60%，HUVEC管腔形成减少50%，小鼠瘤内血管密度降低42%^［12］。这说明甲基化修饰对于HUVECs以及肿瘤的血管形成能力有明显影响。

血管形成与肿瘤生长密切相关，肿瘤的生长、侵袭和转移都依赖于新生血管的形成^［13-15］。在肿瘤早期，肿瘤细胞可以通过转移获得氧气和营养，但当肿瘤体积超过2~3 mm³时，就必须依赖新生血管来维持其生长和代谢需求^［16］。这些新生血管为肿瘤提供氧气、营养，并帮助清除代谢废物，从而促进肿瘤的持续生长和恶化^［17-19］。因此，对于探究肿瘤血管形成的机制是很有必要的。

CpG岛的DNA甲基化作为哺乳动物基因组上主要的表观遗传修饰，是基因调控所必需的，甲基结合蛋白1（MBD1）是一种哺乳动物蛋白，它能结合甲基化的CpG岛，并将DNA甲基化与转录抑制结合起来，与转录调控、异染色质形成、基因组稳定性、细胞周期和发育有关^［20-23］。

MBD1在胰腺癌^［23］、胆囊癌^［22］等上皮来源的肿瘤中高表达，参与促进肿瘤的侵袭和转移。肿瘤血管生成不仅是肿瘤生长的前提，更是其侵袭和转移的标志^［24］。多个研究表明MBD1高表达与胰腺癌^［23］、结肠癌^［25］、胆囊癌^［22］以及肝细胞癌患者^［26］较短总生存期显著相关。在肝细胞癌的生信分析中，MBD1共表达网络显著富集血管生成相关基因集，提示MBD1与血管生成相关基因存在共调控关系^［26］。除此之外，在人绒毛膜肿瘤的滋养层细胞中敲低MBD1后，缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）及其下游促血管生成靶基因（IL-1β、CXCR4）表达随之下降^［27］，说明MBD1参与了与肿瘤血管形成相关的生物学过程。在胰腺癌细胞BxPC-3中稳定敲低MBD1，发现促血管相关蛋白肌动蛋白解聚因子-2（Cofilin-2）显著下调^［28］，推测MBD1可能通过甲基化调控促血管相关蛋白，从而间接影响肿瘤血管生成。

甲基结合蛋白介导的表观遗传调控对于血管形成的影响相关研究较少，研究发现甲基结合蛋白2（MeCP2）在衰老的内皮祖细胞中表达上调，导致血管生成相关蛋白VEGF表达减少，最终抑制EPCs的血管形成能力^［29］。在HUVECs中敲低甲基结合域蛋白2（MBD2）会抑制血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）表达，导致血管形成能力增强^［30］。在肝癌细胞中下调甲基结合蛋白3（MBD3）的表达会促进肿瘤血管的生成^［31］。但目前尚未见关于MBD1介导的表观遗传调控对血管形成的研究报道，因此探讨MBD1的表达对HUVECs的迁移、增殖和血管形成能力的影响是很有必要的。

本研究通过构建MBD1敲低人脐静脉内皮细胞系，探讨敲低MBD1对人皮静脉内皮细胞迁移、增殖和血管生成能力等影响，为进一步阐明MBD1与肿瘤血管生成和迁移的关系奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和质粒

人胚胎肾细胞系（HEK293T）与人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）购于中乔新舟公司，HUVECs为脐带静脉中分离出来的原代细胞，在传3代后构建了实验组和对照组细胞，随后进行成管实验；MBD1敲低质粒LV3（H1/GFP&Puro）-MBD1-HOMO-270以及阴性对照质粒LV3（H1/GFP&Puro）-NC由上海吉玛基因股份有限公司合成；慢病毒包装质粒pLP-VSVG和pCMV-dR8.91（淼灵生物公司）。

1.1.2 主要试剂

DMEM（GIBICO），胎牛血清（FBS）、青链霉素混合液（PS）、胰酶（BI）、质粒大量提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），4%多聚甲醛、高效RIPA裂解液、总RNA提取试剂、0.1%结晶紫溶液\丽春红染液、30%制胶液（北京索莱宝科技有限公司），CCK-8试剂（苏州新赛美生物科技有限公司），第一链cDNA合成试剂盒、MBD1 recombinant rabbit Monoclonal Antibody、Goat anti-Rabbit lgG（H+L）cross-adsorbed secondary antibody，HRP、goat anti-Rabbit IgG （H+L） cross-adsorbed secondary Antibody，Cyanine3、琼脂糖（赛默飞公司），VEGFA monoclonal antibody（武汉三鹰生物技术有限公司），硝酸纤维素膜（NC膜）、ECL发光液（Cytiva），2×SYBR Green qPCR Master Mix（bimake），Transwell小室（广州杰特生物过滤股份有限公司），Ceturegel®Matrix LDEV-Free基质胶（翊圣生物）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与慢病毒包装

293T和HUVECs培养于含有10% 胎牛血清和1% 青霉素和链霉素的DMEM培养基中，并置于5% CO₂，37 ℃的培养箱中。首先，准备293T细胞，待其融合度在30%~50%时，使用转染试剂线性聚乙烯亚胺将准备好的慢病毒包装质粒VSVG、dr8.91以及目的质粒sh-MBD1或者sh-NC混合并添加到293T中。转染后，细胞放置于5% CO₂的细胞培养箱中37 ℃继续培养，于24、48、72 h收集含有病毒粒子的培养上清液，将所有上清液混合通过0.45 μm滤膜过滤病毒上清，清除细胞残渣，使用聚乙二醇（PEG）沉淀方法进行病毒浓缩。浓缩后的病毒液通过慢病毒感染的方式构建sh-MBD1以及sh-NC的HUVECs细胞系。

1.2.2 蛋白印迹实验

收集两组细胞于1.5 mL离心管中，使用RIPA强裂解液与1% PMSF的混合液裂解细胞提取蛋白。配置12% SDS-PAGE分离胶，5% SDS-PAGE浓缩胶进行电泳，将蛋白转至0.45 μm NC膜上。5%脱脂奶粉封闭1 h，MBD1 Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody 1∶1000稀释后4 ℃过夜孵育，Goat anti-Rabbit lgG（H+L）Cross-AdsorbedSecondary Antibody，HRP 1∶5000稀释后室温孵育1 h，用含有0.5‰吐温的PBS（PBST）洗涤3次，进行ECL化学发光，使用Image J软件分析条带灰度值。

1.2.3 荧光定量实验

收集两组HUVECs于1.5 mL离心管中，使用Trizol提取总RNA，根据第一链cDNA合成试剂盒操作说明书逆转录为cDNA，根据2×SYBR Green qPCR Master Mix进行qPCR。MBD1（F：ACACCTATTACCAGAGCCCCAC；R：ATAGCACAA GATGCCTTGTTTGAA）为目的基因，以GAPDH（F：CATGAGAAGTATGACAACAGCCT；R：AGTCCTT CCACGATACCAAAGT）为内参基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。实验重复3次，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。在ABI QuantStudio3 荧光定量PCR仪器上进行荧光扩增和检测其相对表达量。

1.2.4 细胞划痕实验

将构建好的两组细胞接种至6孔板中培养，等待两组细胞汇合度均为90%时，吸弃完全培养基，PBS清洗，用1000 μL枪头在6孔板底部纵向划痕，PBS再次清洗细胞，加入无血清培养基于培养箱中继续培养。光学显微镜下定位同一个位置，分别于0和12 h在显微镜4倍目镜/10倍物镜下观察拍照；将高内涵显微镜温度条件设置为37 ℃，CO₂浓度为5%，在5×水镜下实时观察细胞迁移情况。利用ImageJ软件分析划痕面积。划痕愈合率%=（0 h划痕面积-12 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%，划痕愈合率越大说明细胞迁移速率越快。

1.2.5 细胞迁移实验

选取处于对数期的两组细胞，胰酶消化后进行细胞计数，每组1×10⁵细胞使用200 μL无血清培养基重悬。无血清重悬细胞液加入小室上层，小室下层内加入1 mL含20% FBS培养基，37 ℃培养箱培养24 h。吸弃小室内培养基，用棉拭子轻轻移去小室内非转移细胞，用PBS清洗小室，4%多聚甲醛固定20 min。用0.1%结晶紫染色10 min，PBS清洗后置入新12孔板，倒置显微镜拍照和细胞计数分析。

1.2.6 CCK-8实验

将两组细胞接种至96孔板中（3×10³/孔），细胞在培养箱中继续培养。细胞增殖检测：将10 μL CCK-8试剂与培养基以1∶10混合，分别于0、24、48、72 h以换液形式加入96孔板，培养箱孵育3 h后使用多功能酶标仪检测A_{450 nm}，根据sh-NC组细胞在0 h的A_{450 nm}进行归一化处理并绘制增殖曲线。细胞活力检测：两组细胞培养24 h后使用同样的方法加入CCK-8试剂并检测A_{450 nm}，细胞存活率%=细胞A_{450 nm}/sh-NC组细胞A_{450 nm}平均值，细胞存活率越高代表细胞活力越高。

1.2.7 克隆形成实验

将两组细胞接种于6孔板中（1×10³/孔），每组设置3个复孔，在培养箱中培养1周后，用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.1%结晶紫染色10 min，体视显微镜下观察拍照，使用ImageJ软件分析克隆个数。

1.2.8 细胞周期

收集处于生长对数期的两组细胞1×10⁶个于1 mL离心管中，使用预冷的PBS清洗3次，1000 r/min离心3 min后吸弃PBS，使用预冷的70%乙醇4 ℃固定过夜。第2天将细胞1000 r/min离心3 min弃上清，向两管细胞中加入PBS重悬清洗，室温静置15 min后离心1000 r/min离心3 min弃上清，加入100 μL RNase Reagent并充分混匀细胞，37 ℃金属浴30 min，再加入200 μL PI Reagent并充分混匀，4 ℃避光孵育30 min，随后流式细胞仪检测细胞周期。细胞增殖指数（PI）=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

1.2.9 免疫荧光染色实验

12孔板中放入15 mm细胞爬片，铺板细胞5×10⁵细胞培养2 d，细胞汇合度70%左右将爬片取出，用4%多聚甲醛固定15 min，加入含有0.5%的TritonX-100 的PBS透化20 min，PBS洗3次，4% BSA封闭1 h。VEGFA Monoclonal Antibody（1∶200）4 ℃过夜孵育，Goat anti-Rabbit IgG （H+L） Cross-Adsorbed Secondary Antibody，Cyanine3（1∶1000）室温孵育1 h，PBST清洗后5 μg/mL DAPI室温避光孵育5 min标记细胞核。封片后，高内涵显微镜和共聚焦显微镜成像。

1.2.10 体外血管生成实验

提前在4 ℃冰箱将基质胶解冻过夜，并将塑料制品提前冷却。第2天将液体基质胶以40 μL/孔加入提前冷却好的12孔板中。37 ℃培养箱放置1 h，待基质胶固化后备用。将sh-MBD1组、sh-NC组细胞以每孔1.5×10⁵个接种于基质胶表面。用倒置显微镜拍照记录2、4、6 h时血管生长情况，使用Image J分析小管总长度、小管闭合环路和小管分支节点形成数。

1.3 统计学分析

使用Image J软件进行量化分析，高内涵成像分析系统分析荧光强度，Graphpad Prism 9.0进行数据分析并绘图。连续变量以均数±标准差表示。t检验用于两组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。所有的实验都是独立重复3次。

2 结果

2.1 成功构建MBD1敲低的HUVECs细胞系

经293T细胞包装后的sh-NC和sh-MBD1慢病毒载体感染48 h后，倒置荧光显微镜检测显示，sh-NC组和sh-MBD1组绝大多数细胞均带有GFP标记的绿色荧光，使用2 μg/mL 嘌呤霉素筛选7 d后细胞全部存活（图1A），比例尺100 μm。qPCR检测结果显示，sh-MBD1组细胞MBD1的mRNA表达水平比sh-NC组细胞降低了40%（P<0.01，图1B）；Western blotting检测结果显示sh-MBD1组中MBD1蛋白表达明显下调（P<0.001，图1C）。

2.2 敲低MBD1抑制HUVECs的迁移能力

培养12 h后，sh-NC组的划痕愈合率显著高于sh-MBD1组（图2A），高内涵显微镜实时观察也发现sh-MBD1组细胞向划痕区域迁移的数量明显少于sh-NC组，迁移距离更短（P<0.0001，图2B）。Transwell迁移实验中，结晶紫染色后倒置显微镜下计数，sh-MBD1组穿过小室膜的细胞数显著低于sh-NC组（P<0.0001，图2C）。

2.3 敲低MBD1抑制HUVECs的增殖能力

克隆形成实验结果显示，sh-MBD1组细胞在1周内形成的细胞克隆数量显著低于sh-NC组（P<0.0001，图3A）；CCK-8检测细胞活性结果显示，sh-MBD1组细胞在24 h内的细胞活性明显低于sh-NC组细胞（P<0.0001，图3B），且CCK-8细胞增殖实验表明，sh-MBD1组细胞的增殖能力亦低于sh-NC组细胞（P<0.0001，图3C）。

2.4 敲低MBD1导致细胞周期停滞于G1期

与sh-NC组相比，敲低MBD1后HUVECs的G1期细胞比例显著升高（P<0.0001），而S期细胞比例明显降低（P<0.0001，图4A）。敲低MBD1的HUVECs增殖指数显著下降（P<0.0001，图4B）。

2.5 敲低MBD1抑制HUVECs成管能力

将基质胶提前解冻并铺于12孔板，待其固化后，分别接种sh-MBD1组和sh-NC组HUVECs各1.5×10⁵个（图5A）。倒置显微镜下观察血管形成结果显示与sh-NC组相比，敲低MBD1组的小管总长度显著缩短，小管闭合环路数量明显减少，且小管分支节点形成数也显著降低（P<0.01，图B~D）。

2.6 敲低MBD1会降低HUVECs中VEGFA的表达

免疫荧光染色实验显示，sh-MBD1组细胞中VEGFA蛋白的荧光强度明显弱于sh-NC组（P<0.0001），且主要分布在细胞质区域（图6A、B）。

3 讨论

本研究通过一系列实验探讨了MBD1对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）迁移、增殖及血管形成的影响。结果显示，敲低MBD1后，HUVECs的迁移能力显著下降，无论是细胞划痕实验中的划痕愈合率，还是Transwell迁移实验中穿过小室膜的细胞数量，sh-MBD1组均明显低于sh-NC组，这表明MBD1在维持HUVECs的正常迁移功能中发挥着重要作用。细胞增殖方面，克隆形成实验、CCK8细胞活性及增殖实验结果一致表明，敲低MBD1可有效抑制HUVECs的增殖，而流式细胞周期检测进一步揭示，这种增殖抑制可能与细胞周期停滞于G1期、无法顺利进入S期有关，同时增殖指数的显著下降也印证了这一点。在血管形成能力上，体外血管生成实验发现，敲低MBD1导致HUVECs的小管总长度、闭合环路数量及分支节点形成数均显著减少，提示MBD1对HUVECs的成管能力至关重要。此外，免疫荧光染色实验结果显示，敲低MBD1会降低HUVECs中VEGFA的表达，由于VEGFA是一种重要的促血管生成因子，其表达水平的降低可能是MBD1影响HUVECs血管形成相关生物学行为的重要原因之一，推测MBD1可能通过调控VEGFA的表达，进而参与对HUVECs迁移、增殖及成管等血管生成关键步骤的调控。

有研究首次在临床-细胞模型里把MBD1与VEGFA表达量关联起来，并明确提出“MBD1可能通过改变甲基化状态调控VEGFA”这一假设，但在血管内皮研究中缺少直接甲基化测序或 ChIP 证据^［32］。研究发现MBD2可直接结合VEGF受体2（VEGFR2）启动子甲基化区并抑制其表达，提示MBD1也可能通过类似机制影响VEGFA^［33］。我们的发现为深入理解MBD1在血管生成过程中的作用机制提供了实验依据，也为相关血管生成异常疾病的研究提供了新的潜在靶点。但本研究并未详细阐明MBD1与VEGFA影响HUVECs细胞迁移、增殖和成管能力的作用机制，未来可以进一步通过ChIP-qPCR检测MBD1是否富集于VEGFA启动子甲基化区域，还可以通过亚硫酸氢盐测序观察敲低MBD1的HUVECs中VEGFA甲基化表达变化。另外，虽然我们的研究中检测到MBD1敲低后，VEGFA的表达下降从而影响血管形成，但由于MBD1为一种甲基结合蛋白，其低表达可能也会影响细胞内与血管形成的其它蛋白或通路的变化，因此，未来的研究可以通过全转录组测序方式进一步阐明MBD1对血管形成的具体调控机制。最后，本研究也未能建立体外动物模型，MBD1如何影响各类肿瘤内皮细胞的功能，未来还需进一步体内试验证实。

综上所述，本研究构建了稳定低表达MBD1的HUVECs细胞系，发现在HUVECs中敲低MBD1可抑制其增殖与迁移，并伴随VEGFA表达下降及血管形成能力减弱。本研究为深入探究MBD1在肿瘤血管生成中的作用奠定了理论基础，并为肿瘤抗血管生成治疗提供了新方向。

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基金资助

国家自然科学基金(32000601)

贵州省教育厅高校科技创新团队，黔教计[2023]068号

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贵州医科大学高层次人才科研启动基金项目(校博合J字（2024）065号)

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