CHIR99021通过抑制GSK-3β/NF-κB信号通路减轻帕金森病小鼠的神经炎症

CHIR99021 alleviates neuroinflammation in a mouse model of Parkinson's disease by inhibiting the GSK-3β/NF-κB pathway

摘要

目的 探讨CHIR99021抑制GSK-3β/NF-κB通路改善帕金森病神经炎症的作用。 方法 SH-SY5Y细胞加入1-甲基-4-苯基吡啶（MPP⁺）（1 mmol/L）培养24 h，构建MPP-PD细胞模型，治疗组SH-SY5Y细胞先经CHIR99021（3μmol/L）预处理2 h，再加入MPP⁺（1 mmol/L）培养24 h。将野生型（WT）小鼠连续5 d腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）构建MPTP-PD动物模型，治疗组连续7 d腹腔注射CHIR99021，从第3天开始间隔12 h再腹腔注射MPTP，连续注射5 d。以WT型小鼠作对照，通过旷场实验、爬杆实验、疲劳转棒实验评估各组运动行为能力。通过Western blotting 和免疫荧光检测CHIR99021在体内和体外抑制GSK-3β/NF-κB通路信号调控NLRP3炎症小体激活和细胞自噬改善帕金森病神经炎症的作用。 结果 与对照组相比，MPP⁺-PD细胞模型中，p-GSK-3β （Ser9）的蛋白表达水平下调（P<0.01），而总GSK-3β蛋白量差异没有统计学意义。p-NF-κB p65 （Ser536）的蛋白表达水平上调（P<0.01），而总NF-κB p65 （Ser536）蛋白量差异没有统计学意义。同时ASC、NLPR3、Caspase-1炎症小体表达上调（P<0.01）。而在MPP⁺+CHIR99021组中，p-GSK-3β、NF-κB及炎症小体蛋白表达下调.与对照组相比，MPTP-PD小鼠模型中，小鼠运动功能下降（P<0.001），脑内TH神经元减少（P<0.01）。黑质部位的p-GSK-3β （Ser9）水平同样降低（P<0.01），总GSK-3β蛋白量变化差异无统计学意义。而p-NF-κB p65 （Ser536）水平同样显著升高（P<0.01），总NF-κB p65蛋白量表达变化差异无统计学意义，ASC、NLPR3、Caspase-1炎症小体表达上调（P<0.01）。而MPTP-CHIR99021组较MPTP-PD组相比，p-GSK-3β、NF-κB及炎症小体蛋白表达下调（P<0.01）。 结论 CHIR99021通过抑制GSK-3β/NF-κB信号通路，显著改善帕金森病（PD）小鼠的运动功能，减轻神经炎症，并激活细胞自噬以维持细胞内环境稳态。靶向GSK-3β可同时调控PD多个关键病理环节，具有作为多功能治疗靶点的潜力。

Abstract

Objective To investigate the effect of CHIR99021 for improving neuroinflammation in a mouse model of Parkinson's disease (PD) and the role of the GSK-3β/NF-κB pathway in mediating this effect. Methods In the cell experiment, induced SH-SY5Y cells were pretreated with 3 μmol/L CHIR99021 for 2 h prior to MPP+ treatment. In a male C57BL/6 mouse model of MPTP-induced PD, the effect of intraperitoneal injection of CHIR99021 for 7 days on motor function of the mice were assessed using behavioral tests. Western blotting and immunofluorescence staining were used to detect the changes in the GSK-3β/NF-κB pathway, NLRP3 inflammasome and autophagy in both SH-SY5Y cells and the mouse models. Results MPP+-treated SH-SY5Y cells showed significantly downregulated expression of p-GSK-3β protein and upregulated expressions of p-NF-κB p65, ASC, NLPR3, and caspase-1, and these changes were obviously attenuated by pretreatment with CHIR99021. Compared with normal mice, the PD mouse models showed significantly decreased motor function and reduced TH neurons in the brain with lowered expression of p-GSK-3β, increased expression of p-NF-κB p65 (Ser536), and upregulated ASC, NLPR3, and caspase-1 expressions. Treatment with CHIR99021 significantly increased the expression of p-GSK-3β, and reduced the expression of p-NF‑κB p65 (Ser536), ASC, NLPR3, and caspase-1. Conclusion CHIR99021 inhibits the GSK-3β/NF‑κB signaling pathway to improve motor function of PD mice, reduce neuroinflammation, and activate autophagy to maintain the homeostasis of intracellular environment, suggesting that targeting GSK-3β, a potential multifunctional therapeutic target, can simultaneously regulate multiple key pathological links in PD.

Graphical abstract

关键词

帕金森病 / CHIR99021 / GSK-3β / NF-κB / 神经炎症

Key words

Parkinson's disease / CHIR99021 / GSK-3β / NF-κB / neuroinflammation

帕金森病（PD）作为第二常见的神经退行性疾病，其全球患病人数已超过600万 ^［1］，且患病率增长迅速^［2］。在PD复杂的分子机制中 ^［3］，神经炎症被认为是驱动疾病发生与进展最关键的因素之一，人类样本和动物模型中的大量证据支持炎症参与 PD 的发展^{［4， 5］}。因此，深入探究PD发病的炎症机制，从而探寻切实有效的治疗方法尤为重要。

糖原合成酶激酶3（GSK-3）是一种广泛表达的丝氨酸/苏氨酸激酶^［6］，其中GSK-3β在大脑功能中发挥关键作用^［7］，参与神经元形态、突触形成、神经炎症及神经系统疾病的调控^［8］。GSK-3β作为多种促炎途径的中心分子，在促炎细胞因子的转录和释放中起着关键作用^［9］。是核因子κB（NF-κB）等信号通路的调控中心^［10］。PD患者及1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD动物模型中，NF-κB在黑质区域被显著激活，并调控多种促炎介质的表达^{［3， 11］}。NF-κB已被证明在大脑中受 GSK-3β 的调节^{［12， 13］}。作为NF-κB的上游调控因子^［14］，抑制GSK-3β已被证明可保护多巴胺能神经元免受损伤，因此选择性抑制GSK-3β可能成为PD治疗的新策略。

氨基嘧啶衍生物CHIR99021作为一种高选择性GSK-3抑制剂，可有效抑制GSK-3β的表达^［15］，在神经炎症调控及多种炎症动物模型中展现出显著的治疗效果^{［16， 17］}。研究表明，CHIR99021能通过抑制NF-κB等通路，显著降低巨噬细胞、肥大细胞等免疫细胞产生TNF-α、IL-6等关键炎症因子，展现出强大的抗炎活性^{［18， 19］}。在适应性免疫中，CHIR99021能进一步维持免疫平衡^［16］。

目前，以左旋多巴为主的药物治疗仅能缓解帕金森症状，无法延缓疾病进展^［20］。尽管神经炎症是驱动神经元变性的关键因素^［21］，但GSK-3β抑制剂能否通过调控神经炎症发挥治疗作用，尚未得到充分阐述。基于以上空白，本研究旨在采用体内外相结合的实验体系，全面评估GSK-3β抑制剂CHIR99021对PD的治疗潜力。我们的研究创新性地将行为学改善、多巴胺能神经元数量保护与抗神经炎症作用进行联合分析。

在体外，本研究采用1-甲基-4-苯基吡啶（MPP⁺）构建神经炎症细胞模型^［22］，验证CHIR99021对神经元保护，并着重探究其对SH-SY5Y细胞介导的神经炎症的调控作用。在体内，通过MPTP诱导亚急性 PD小鼠模型^［23］，我们利用MPTP小鼠模型，明确CHIR99021对运动功能障碍的改善效应，并与黑质TH⁺神经元数量进行关联。本研究旨在为CHIR99021作为PD的神经保护和抗炎双重功能治疗策略提供坚实的实验依据，并深化对GSK-3β在PD神经炎症中作用机制的理解。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 抗体及试剂

鼠抗p62、鼠抗Beclin1、鼠抗NF-κB p65、兔抗p-NF-κB p65、鼠抗IL-1b、鼠抗Caspase-1、鼠抗p-GSK-3β（Ser 9）、鼠抗TBK1、鼠抗CEBPβ、鼠抗ASC（Santa cruz），兔抗LC3B、兔抗TH（Abcam），鼠抗NLRP3（AdipoGen），兔抗GSK-3β（Proteintech），MPP⁺（MCE），DMEM 高糖培养基、0.25%胰蛋白酶-EDTA（1×）、Antibiotic-Antimycotic（Gibco）；多聚甲醛（Greagent）、OCT（SAKURA）、BSA（Solarbio）、驴血清（Jackson immuno research）、BSA（Solarbio）、MPTP、Triton-100（Sigma-Aldrich）、DAPI 、RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂PMSF（Beyotime）；固体封片剂（Invitrogen）、磷酸酶抑制剂（Bioss）、PVDF膜（Millipore）、Cover slip（Electron Microscopy Sciences）、PAGE凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶生物）

1.1.2 实验动物

成年雄性C57BL/6小鼠（杭州子源实验动物科技有限公司），饲养在清洁级动物房中，环境温度控制在23±1 ℃，相对湿度为55%~65%，光暗周期各为12 h。实验操作按照我国《实验动物福利伦理审查指南（GB/T 35892-2018）》要求，规范落实实验动物福利伦理。所有实验的设计和报告均符合《动物研究：体内实验报告（ARRIVE）》指南进行设计和报告。实验动物的使用和所有实验程序均经蚌埠医学院伦理委员会（IACUC）批准（伦理批号：2023-228））。

1.2 方法

1.2.1 细胞模型构建

SH-SY5Y细胞在含有10%胎牛血清和 1%青霉素-链霉素抗生素的高糖DMEM培养基的6孔板中，置于37 ℃、5% CO₂的培养箱中培养。当生长密度达至70%时，建模组加入1 mmol/L的 MPP⁺培养24 h，构建MPP⁺-PD细胞模型。治疗组细胞先经3 μmol/L 的CHIR99021预处理2 h^［24］，再加入1 mmol/L 的MPP⁺培养24 h^［15］。

1.2.2 MPTP-PD小鼠模型构建

取8周龄，体质量为22~25 g的野生雄性健康C57BL小鼠，根据实验要求将小鼠分为3组，WT组、MPTP组、MPTP+CHIR99021组，（n=12）。采用亚急性中毒模型研究糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是否通过激活NF-κB信号通路驱动MPTP诱导的PD小鼠发展及神经炎症的作用。向野生型（WT）小鼠每天1次连续5 d腹腔注射MPTP 30 mg/kg制备MPTP-PD动物模型；MPTP+CHIR99021治疗组小鼠每天1次连续7 d腹腔注射CHIR99021 12.5 mg/kg，从第3天起，先注射CHIR99021后间隔12 h再腹腔注射MPTP 30 mg/kg，连续5 d。

1.2.3 运动行为学检测

动物爬杆测试（Pole Test）：固定爬杆：分别将各组小鼠放置在杆顶鼻部朝上，让其转身爬到底部，训练2 d让小鼠适应爬杆设备，第3天开始正式测试。转身时间记录头部转向下方所用时间，下降时间同时记录动物爬至杆底部所需要时间。

疲劳转棒试验：训练阶段：将各组小鼠置于转棒仪上连续训练2 d，转速设置为20 r/min，运行时间为10 min，以使小鼠适应疲劳转棒装置。测试阶段：于第3天及第4天连续2 d进行正式测试。每只小鼠测试结束后，立即进行高速疲劳测试：设置转速在300 s内匀加速至40 r/min，并维持运行10 min，记录小鼠在棒时间。同时进行恒定转速测试：设置转速在20 s内匀加速至20 r/min，运行20 min，记录小鼠在棒时间。

旷场试验：正式测试前24 h，将小鼠放置测试房间内以适应环境，减少小鼠应激反应。每只小鼠同一方向放入测试箱中央，使其自由探索10 min。使用ANY-maze Video Tracking System 7.1.6进行视频分析。

1.2.4 Western blotting检测

取动物模型各组小鼠大脑黑质和细胞模型各组细胞，放入裂解液（RIPA、PMSF、磷酸酶抑制剂）中进行超声破碎后，于4 ℃，12 000 r/min离心30 min，收集上清。总蛋白样品在120 V恒压SDS-PAGE电泳1 h，随后340 mA恒定电流转移至PVDF膜上，加入封闭液（3% BSA）封闭1 h，一抗分别用兔抗GSK-3β（1∶4000）、鼠抗p-GSK-3β（1∶1000）、鼠抗NF-κB p65（1∶1000）、鼠抗TBK1（1∶1000）、鼠抗CEBPβ （1∶1000）、兔抗NLRP3（1∶1500）、鼠抗IL-18（1∶2000）、鼠抗Caspase-1（1∶1000）、鼠抗IL-1β（1∶1000）、兔抗ASC（1∶2000）、兔抗Beclin-1（1∶1000）、鼠抗p62 （1∶1000）、兔抗LC3 B（1∶2500）、鼠抗TH（1∶2000））、4 ℃孵育过夜。次日洗去一抗，用二抗羊抗兔IgG-HRP 抗体和羊抗鼠IgG-HRP抗体（1∶5000）室温孵育1 h，TBST冲洗，化学发光法显影，经凝胶成像仪（BIO RAD）图像采集，Image lab软件对蛋白表达量进行分析。

1.2.5 制备小鼠脑脑冷冻切片

将不同分组小鼠用异氟烷气体麻醉后，分别使用提前预冷的PBS和4 %多聚甲醛进行心脏灌注后取脑，浸于4%多聚甲醛中固定24 h，先后使用15%、20%、25%、30%蔗糖进行梯度脱水，置于-80 ℃冷冻过夜，次日使用OCT包埋后，使用冷冻切片机（CM1950，Leica）进行厚度为12 μm的冠状冰冻切片，贴于涂有明胶的载玻片上。

1.2.6 免疫荧光染色

各组细胞爬片用 4% PFA 固定 18 min，用 0.2% Triton X-100 透化 10 min，并在室温下用 2% BSA 和 10%驴血清中继续封闭 1 h。制备好的脑组织切片用含10%驴血清、2%BSA和0.2%Triton-100的PBS缓冲液封闭1 h后，用PBS冲洗3次。分别用兔抗TH（1∶500）、兔抗GSK-3β（1∶500）、鼠抗p-GSK-3β（1∶500）、鼠抗NF-κB p65（1∶500）、鼠抗p-NF-κB p65、鼠抗IL-18（1∶500）、兔抗NLRP3（1∶200）、鼠抗IL-1b（1∶500）、鼠抗p62（1∶500）、兔抗LC3B（1∶500）、鼠抗Beclin-1（1∶500）于4 ℃孵育过夜。洗去一抗后分别加入对应二抗Alexa Fluor 488（1∶500）、Alexa Fluor Cy3（1∶1000）孵育1 h，DAPI复染15 min后，用抗荧光淬灭剂封片。使用共聚焦显微镜（Olympus， FV1200MPE SHARE）观察。

1.2.7 统计学分析

使用SPSS 26.0软件进行分析，使用GraphPad Prism 8.0软件可视化。两组之间差异采用两独立样本t检验进行分析；多个样本比较，符合正态分布和方差齐性，则采用单因素方差分析，不符则使用多个独立样本的非参数检验方法Kruskal-Wallis检验，并以均数±标准差方式进行描述。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CHIR99021显著改善MPTP-PD小鼠运动功能障碍

Pole Test检测结果显示，MPTP+CHIR99021治疗组小鼠比MPTP-PD组转身时间和下降时间减少（P<0.01，图1B、C）。疲劳转棒试验结果显示，治疗组小鼠20 r/min在棒时间，40 r/min在棒时间均增加（P<0.001，图1D、E）。旷场试验结果显示，治疗组小鼠运动总距离较MPTP-PD组增加（P<0.001，图1F~I）。

2.2 CHIR99021抑制GSK-3β/NF-κB通路改善MPP⁺/MPTP诱导产生的PD神经炎症

细胞实验Western blotting结果显示，与对照组相比，MPP⁺组GSK-3β蛋白表达升高（P<0.01）而p-GSK-3β蛋白表达降低（P<0.05），炎症相关因子 NLRP3、Caspase-1、ASC、TBK1、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达量均增加（P<0.01）；而MPP⁺+CHIR9901组GSK-3β蛋白量表达下降（P<0.01）、p-GSK-3β表达升高（P<0.05），炎症相关因子 NLRP3、Caspase-1、ASC、TBK1、NF-κB p65、p-NF-κB p65表达量均下降（P<0.01，图2A、B），免疫荧光染色结果与Western blotting检测结果一致（图2C）。

Western blotting结果显示，与对照组相比，MPTP组炎症因子NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、CEBPβ表达量均增加（P<0.01），而CHIR9901+MPTP组上述炎症因子表达量均降低（P<0.05）。MPTP组GSK-3β差异没有统计学意义，而CHIR9901+MPTP组p-GSK-3β表达量增加（P<0.01，图3A、B）。免疫荧光染色结果与Western blotting检测结果一致（图3C）。

2.3 CHIR99021抑制GSK-3β/NF-κB通路影响MPP⁺/MPTP诱导的细胞自噬

细胞蛋白Western blotting结果显示，MPP⁺组自噬标记物Beclin-1和LC3B下降（P<0.05），而MPP⁺+CHIR9901组LC3B和Beclin-1的表达上升（P<0.05）。MPP⁺组GSK-3β差异没有统计学意义，而MPP⁺+CHIR9901组p-GSK-3β水平升高（P<0.05）。同时，MPP⁺组中TH表达量下降（P<0.05），而MPP⁺+CHIR9901组TH蛋白表达量上升（P<0.05，图4A、B）。免疫荧光染色结果与Western blotting检测结果一致（图4C）。

Western blotting结果显示，MPTP组自噬标志物p62的表达上调（P<0.05），LC3B表达量下调（P<0.01），而MPTP+CHIR9901组p62下调（P<0.05），LC3B表达上调（P<0.05）。MPTP组GSK-3β表达上调（P<0.01），而MPTP+CHIR9901组p-GSK-3β表达水平升高（P<0.05） MPTP组小鼠黒质致密部TH表达量减少（P<0.01），而MPTP+CHIR99021组小鼠黑质部位蛋白表达量增加（P<0.05，图5A、B）。免疫荧光染色结果与Western blotting检测结果一致（图5C）。

3 讨论

神经炎症在神经退行性疾病的进展中起着至关重要的作用，尤其是帕金森病^［25］。神经炎症因其在神经退行性疾病中的关键作用而作为常见危险因素引起了相当大的关注^［26］。临床尸检与脑脊液分析进一步证实，PD 患者脑内病变区域（如黑质、纹状体）存在显著的促炎细胞因子积累^［27］，且这些炎症介质可激活核因子NF-κB、Ying-Yang 1、mTOR等转录因子，通过调控下游信号通路加剧多巴胺能神经元损伤^［28］。由于多巴胺能神经元本身对氧化应激和炎症攻击具有高敏感性，通过含死亡结构域的受体（如 TNFR1）启动凋亡程序，直接诱导神经元死亡^［29］。CHIR99021作为一个经典的GSK-3抑制剂，过去十几年在糖尿病领域已被广泛验证，这与其在胰岛素信号通路中的关键调控作用密切相关。但我们注意到一个问题：GSK-3的生物学功能远不止调控血糖。这几年越来越多的证据开始指向它在神经系统里的角色，尤其是在帕金森病的病理过程中，GSK-3的异常激活似乎贯穿了多条通路——从tau蛋白磷酸化到自噬障碍，再到神经炎症。这就引出一个问题：既然CHIR99021能高效抑制GSK-3，它是否能从糖尿病跨界到PD？基于这一思路展开，本研究将这一经典药物引入帕金森病的治疗中，通过MPTP处理的小鼠大脑黑质致密部多巴胺表达量显著减少^［30］，MPTP组小鼠表现为明显的帕金森症运动功能障碍，而经CHIR99021治疗后小鼠大脑黑质部多巴胺表达量显著增加，免疫组化结果显示CHIR99021有效地减缓了小鼠大脑SNc区多巴胺能神经元数量下降，行为学检测进一步证实了CHIR99021可以有效改善MPTP诱导的帕金森症小鼠运动功能障碍。

前期研究发现帕金森病患者血清中IL1B和Caspase-1的表达明显上升，表明帕金森症病理过程中炎症因子被显著激活^［31］。在使用MPP⁺ 建立的细胞模型中，炎症因子IL-1β的释放与NLRP3炎性小体的激活高度相关^［32］。本研究通过MPP⁺细胞模型和MPTP诱导动物模型，证实经CHIR99021治疗后NLRP3、Caspase-1、ASC、NF-κB等炎症因子表达量显著降低，而自噬标记物Beclin-1和LC3B显著上升，表明CHIR99021可有效改善MPP⁺/MPTP诱导产生的帕金森症神经炎症和自噬功能障碍。在 PD 神经炎症的分子调控网络中，GSK-3β/NF-κB 信号轴是连接病理刺激与炎症损伤的核心节点，过度活化的GSK-3β会促进线粒体功能障碍以及凋亡信号的激活，从而诱导多巴胺能神经元凋亡^［33］，NF-κB在大脑中受 GSK-3β 的调节^［12］，当NF-κB激活时，NLRP3 炎性小体过度活化，进一步加剧神经损伤，加速 PD 病理进展^［34］。使用CHIR99021通过磷酸化失活机制显著上调 GSK-3β Ser9位点磷酸化水平，直接抑制其激酶活性，进而减少IKKβ磷酸化与IκBα降解，最终阻断 NF-κB p65 的核转位。在 MPP⁺处理的 SH-SY5Y 细胞中，CHIR99021 预处理可显著减少NF-κB核转位；在 MPTP 小鼠模型中，CHIR99021处理可降低黑质区 NF-κB 活化水平，减少 IL-1β、NLRP3 等炎症因子表达^［35］。此外，CHIR99021 还可恢复自噬功能，促进α-syn等病理蛋白的清除。已有研究证实，在 MPTP 诱导的 PD 小鼠模型中，抑制 GSK-3β活性不仅能显著减轻 MPTP 对多巴胺能神经元的毒性，还可降低α- 突触核蛋白（α-syn）的异常表达，提示 GSK-3β是 PD 病理进展的关键调控分子^［35］。

增强的自噬除了直接清除错误折叠的蛋白外，还能维持细胞内环境稳态^［36］。鉴于帕金森病中存在明确的线粒体功能损伤，而受损的线粒体被认为是胞质mtDNA泄漏的主要来源，后者正是激活cGAS-STING通路进而引发神经炎症的关键信号^［37］。因此，我们推测，CHIR99021所诱导的强劲自噬，可能通过有效清除受损线粒体，从源头上减少了mtDNA的泄漏，从而潜在抑制了cGAS-STING通路的异常激活^［38］。尽管这一推测需要后续实验直接验证，但它为CHIR99021的神经保护效应提供了一个新颖的逻辑延伸。

我们的研究结果不仅证实了CHIR99021在PD模型中的治疗潜力，也强有力地支持了GSK-3β作为PD治疗新靶点的可行性，同时也为 CHIR99021 作为潜在 PD 治疗药物提供了扎实的实验依据。

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基金资助

国家自然科学基金(82371382)

安徽省自然科学基金(2308085MH256)

蚌埠医科大学龙湖英才项目(LH250102002)

蚌埠医科大学自然科学研究项目资助(2024byzd024)

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