熊胆粉通过调控NF-κB和Nrf-2/HO-1信号通路减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤

Natural bear bile powder attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice by regulating the NF-κB and Nrf-2/HO-1 signaling pathways

摘要

目的 探究熊胆粉（BBP）通过调控NF-κB和Nrf-2/HO-1信号通路对脂多糖诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠的保护作用。 方法 体外实验：采用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞建立体外模型，设置对照组、模型组、地塞米松（Dex，25 μg/mL）、BBP低剂量组（6.25 μg/mL）和BBP高剂量组（12.5 μg/mL）。体内实验：将60只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组、Dex组（5 mg/kg）、BBP低剂量组（30 mg/kg）和BBP高剂量组（120 mg/kg），12只/组。通过ELISA和相关试剂盒检测细胞和肺组织中炎症与氧化应激指标；通过肺组织病理分析、免疫细胞计数和肺湿/干质量比等指标评价BBP对ALI的干预作用。通过qRT-PCR、Western blotting和免疫组化法分析NF-κB和Nrf-2/HO-1信号通路相关蛋白与基因的表达变化。 结果 细胞实验结果显示，与模型组相比，BBP组（12.5μg/mL）显著降低TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和活性氧水平，升高SOD水平，且IκB-α、Nrf-2和HO-1的mRNA表达水平升高，而TNF-α、IL-1β、Keap-1和NF-κB（p65）的mRNA表达水平降低（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。动物实验结果显示，与对照组相比，模型组小鼠肺组织结构紊乱，肺泡壁增厚，肺泡内可见大量炎症细胞浸润，肺组织湿/干质量比及支气管肺泡灌洗液（BALF）总细胞数升高（P<0.01）；肺组织中的TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6、MDA和NO含量升高，而SOD浓度降低（P<0.01，P<0.001）；且肺组织中IκB-α、Nrf-2和HO-1的蛋白表达水平降低，Keap-1和NF-κB（p65）的蛋白表达水平升高（P<0.01）。与模型组相比，BBP（120 mg/kg）组能改善小鼠肺组织病理损伤状态，改善肺肿胀程度，降低BALF总细胞数、TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6、MDA和NO水平，升高SOD水平（P<0.05，P<0.01）；同时，BBP上调了肺组织中IκB-α、Nrf-2和HO-1的蛋白表达水平，并抑制了Keap-1和NF-κB（p65）的蛋白表达水平（P<0.05，P<0.01）。 结论 BBP可能通过作用于Nrf-2/HO-1和NF-κB信号通路对LPS诱导的ALI发挥保护作用，为后续研究潜在的治疗ALI药物提供依据。

Abstract

Objective To investigate the mechanism that mediates the protective effect of bear bile powder (BBP) against lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) in mice. Methods Cultured RAW264.7 cells were pretreated with, different concentrations of BBP, or dexamethasone (Dex) for 1 h before LPS challenge. Sixty male C57BL/6 mice were randomized into 5 groups (n=12), including a control group, a LPS-induced ALI model group, a Dex treatment group, and two BBP treatment groups treated with low- (30 mg/kg) or high-dose (120 mg/kg) BBP. The levels of inflammatory factors and oxidative stress-related indicators in the cells and mouse lung tissues were determined, and mouse lung histopathology, wet/dry weight ratio, and BALF cell count were examined; the expressions of NF-κB and Nrf-2/HO-1 pathways were detected using qPCR, Western blotting, and immunohistochemistry. Results In LPS-stimulated RAW264.7 cells, BBP (12.5 μg/mL) significantly reduced the levels of TNF-α, COX-2, IL-1β, IL-6, MDA, NO and ROS, enhanced SOD activity, increased mRNA expressions of IκB-α, Nrf-2, and HO-1, and lowered mRNA expressions of TNF-α, IL-1β, Keap-1, and NF-κB (p65). The ALI mouse models showed severe lung pathologies and edema, increased BALF cell counts, and increased levels of TNF‑α, COX-2, IL-1β, IL-6, MDA, and NO, lowered SOD activity with reduced protein expressions of IκB-α, Nrf-2, and HO-1 and increased expressions of Keap-1 and p65. Treatment with high-dose BBP significantly ameliorated lung pathologies in the mouse models and improved the aberrant alterations in pulmonary expressions of inflammatory factors, oxidative stress-related indicators and the NF-κB and Nrf-2/HO-1 pathways. Conclusion BBP protects against LPS-induced ALI in mice possibly by targeting the Nrf-2/HO-1 and NF-κB pathways, suggesting its potential as a therapeutic agent for ALI.

Graphical abstract

关键词

熊胆粉 / 急性肺损伤 / NF-κB信号通路 / Nrf-2/HO-1 信号通路

Key words

natural bear bile powder / acute lung injury / nuclear factor-κB signaling pathway / Nrf-2/HO-1 signaling pathway

急性肺损伤（ALI）是一种由多种因素导致的肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损害的疾病，其特征为弥漫性肺间质及肺泡水肿，进而引发急性低氧性呼吸功能障碍^［1］。ALI的主要诱因包括内毒素引发的氧化应激和炎症反应以及脓毒症引起的肺部直接感染^［2］。其发病机制复杂，涉及以下几个方面：炎症反应、肺泡上皮和内皮细胞损伤^［3］、氧化应激、免疫反应及肺泡-血管屏障破坏等。炎症介质（如TNF-α、IL-1β等）会导致肺泡和小血管内皮细胞的损伤，增加肺泡通透性^［4］；活性氧（ROS）的过量产生会进一步加重细胞膜损伤和DNA损伤^［5］；免疫细胞（如中性粒细胞和巨噬细胞）的聚集则会导致炎症因子和酶的释放，形成恶性循环^［6］。此外，多个信号通路（如NF-κB通路、MAPK通路、Nrf-2信号通路、自噬等）共同调节ALI的发生和发展^{［7， 8］}。目前，临床上常采用抗缺氧、抗炎、止血以及胸腔穿刺等治疗方法，但这些方法存在局限性。糖皮质激素（如地塞米松，甲泼尼龙）是目前临床实践中最常用的抗炎药物。近年来，针对特定病理环节的靶向药物受到广泛关注，例如中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂西维来司他钠，已被专家共识推荐用于早期急性呼吸窘迫综合征患者，尤其对高炎症表型可能更具作用^［9］。然而，由于疾病的高度异质性，长期使用糖皮质激素可能诱发耐药性等问题^［10］。因此，探索新的药物以治疗ALI显得尤为重要。

熊胆粉（BBP）作为传统中医药中的珍贵动物药，含有胆汁酸类、胆固醇类、胆色素类和氨基酸类成分，具有清热解毒、清肝明目等作用^［11］。现代药理研究表明熊胆粉具有保肝^［12］、抗炎^［13］、抗癌^{［14， 15］}和降血压^{［16， 17］}等多种药理作用。朝医学理论认为，熊胆具有活血化瘀、清热解毒、发汗、驱逐肺之邪气的功效^［18］。朝医学经典著作《东医四象新编》中记载，熊胆被称为“肺元元帅”之药 ^［19］。研究发现，痰热清注射液由黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘等中药组成，用于风温肺热病中的痰热阻肺证候群的治疗^［20］；熊胆平贝口服液由熊胆粉、川贝母、杏仁水、蜂蜜、薄荷脑组成，适用于痰热咳嗽、咳痰不止、咯痰不爽等症状^［21］。此外，还发现BBP通过抑制CD14通路和改善肠道菌群来改善脂多糖（LPS）诱导的ALI^［22］。以上研究表明，熊胆粉对于肺部疾病可能具有一定的预防和治疗作用。然而，BBP抗ALI的作用和分子机制尚不清楚，有待进一步研究。鉴于此，本研究将结合ALI经典信号通路——NF-κB和Nrf-2/HO-1信号通路，从炎症反应、氧化应激及肺组织病理变化来探讨BBP对ALI的作用及作用机制，为后续BBP的开发和利用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料与试剂

BBP购于延边熊场。髓过氧化物酶（MPO）、Wright-Giemsa染色试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、ROS检测试剂盒、一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、环氧化酶-2（COX-2）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）等试剂盒（南京建成生物工程研究所）。LPS（Sigma）。Tli RNase H Plus试剂盒、Perfect Real Time试剂盒（Takara）。核因子κB（NF-κB）、人核因子κB抑制蛋白α（IκB-α）、kelch样ECH相关蛋白1（Keap-1）、核因子E2相关因子-2（Nrf-2）和血红素氧合酶-1（HO-1）抗体（赛默飞世尔科技公司）。HRP标记山羊抗兔二抗（Utibody Biotech）。NF-κB、IκB-α、IL-1β、Nrf-2、TNF-α、Keap-1、HO-1引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 实验动物

60只雄性C57BL/6小鼠（6~8周龄，体质量18~22 g）购自本校动物实验中心。实验动物在标准条件下饲养（温度25±2 ℃，湿度60%±5%，12 h光照/黑暗循环）。本研究动物实验已获得动物伦理委员会批准（伦理批号：YD20251014002）。

1.3 细胞培养

将小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW 264.7）（中国科学院细胞库）置于完全培养基中培养（含10%新生小牛血清和90% RPMI-1640培养基），并置于37 ℃、5%二氧化碳的环境中培养。

1.4 CCK-8法检测细胞活力

采用CCK-8法检测细胞毒性。将RAW 264.7细胞以5×10⁴/mL的密度接种于96孔板中，用不同浓度的（0~100 μg/mL）BBP处理24 h。加入10 μL/孔CCK-8溶液后，使用酶标仪测定A_{450 nm}，计算细胞活力。

RAW264.7细胞以5×10⁴/mL接种于96孔板中，孵育12 h。给予不同剂量的BBP（6.25~50 μg/mL）或地塞米松（Dex，25 μg/mL）预处理1 h后，用0.5 μg/mL LPS刺激细胞24 h。加入10 μL/孔CCK-8溶液，使用酶标仪处测定吸光度A_{450 nm}，计算细胞活力。

1.5 细胞中炎症因子和氧化产物含量的测定

按照上述方法培养细胞，造模，给药后，吸取细胞上清液，按试剂盒说明书检测TNF-α、COX-2、IL-1β、IL-6、MDA、SOD和NO含量。

1.6 ROS检测

将RAW264.7细胞以8×10⁵ /孔接种于6孔板中，孵育12 h。给予熊胆粉（6.25和12.5 μg/mL）或地塞米松（Dex，25 μg/mL）处理1 h，用0.5 μg/mL LPS刺激细胞24 h后。将细胞与10 μmol/L DCFH-DA在37 ℃孵育20 min。孵育结束后，弃上清，用PBS冲洗细胞2次。利用荧光显微镜对图像进行采集和分析。

1.7 细胞样本qRT-PCR分析

将细胞培养于6孔板中。按照上述方法培养，造模，给药24 h后，去除上清液。使用RNA提取试剂盒从细胞中提取RNA，并使用反转录试剂盒将RNA转录成cDNA。使用SYBR Green试剂盒进行扩增（p65、IκBα、TNF-α、IL-1β、Nrf-2、HO-1、Keap-1和GAPDH），得到Ct值。根据Ct值计算2^{-（∆∆Ct）}。引物序列（表1）。

1.8 动物分组及给药

将60只雄性C57BL/6小鼠随机分为：对照组、模型组、地塞米松组（Dex，5 mg/kg）、低剂量熊胆粉组（30 mg/kg）和高剂量熊胆粉组（120 mg/kg），12只/组。各组连续给药5 d，末次给药后1 h，除对照组外，所有小鼠气管滴注LPS（4 mg/kg，10 μL/20 g），16 h后麻醉处理，每组随机选择6只小鼠进行支气管肺泡灌洗液（BALF）收集。在麻醉开胸后，于左肺门处分离左主支气管及伴行血管，使用4-0无菌丝线进行牢固结扎。随后，经气管插管分3次注入并回收预冷的无菌PBS，灌洗液仅进入右肺。灌洗结束后，收集BALF样本。结扎线远端的左肺则被完整取下，置于冰上，进行后续肺组织湿/干质量比实验。其余6只小鼠左肺用于HE染色，右肺前叶用于试剂盒的检测，其余肺组织用于Western blotting分析。

1.9 BALF收集与分析

随机选取小鼠6只/组，使用1 mL注射器吸取PBS进行肺泡灌洗，反复灌洗3次，回收BALF。样品在4 ℃下，以3000 r/min离心10 min，获得上清液及沉淀。采用Wright-Giemsa染色试剂盒（Sangon Biotech）测定BALF沉淀液中的总细胞、中性粒细胞的数量。并采用二奎林甲酸蛋白检测试剂盒（BCA）检测BALF蛋白浓度。

1.10 MPO分析

MPO活力作为ALI的一个敏感和特异的标志物，可用于评估中性粒细胞在组织中聚集的数量，是中性粒细胞在肺中浸润的一个指标。对未进行BALF收集的6只小鼠进行处死，收集肺组织。取10 mg右肺前叶组织，按质量/体积比=1∶9加入组织研磨介质中制成10%组织匀浆液。严格按照试剂盒说明书操作，测定肺组织中MPO的含量。

1.11 肺组织湿/干质量比

对进行BALF收集的6只小鼠处死，取小鼠的左肺组织，用PBS缓冲液洗涤，用滤纸干燥，称重，得到肺组织的湿质量。然后将肺组织置于80 ℃培养箱中48 h，再次称质量，得到小鼠肺组织的干质量，并计算小鼠肺组织湿/干质量比，判断小鼠肺水肿程度。肺组织湿/干质量比=肺组织湿质量/肺组织干质量。

1.12 HE染色观察肺组织病理变化

对未进行BALF收集的6只小鼠的肺组织进行组织病理学检查。取未进行渗出物收集的小鼠新鲜的左肺组织置于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片（5 μm），用苏木精和伊红染色对组织进行染色，观察各组小鼠肺组织病理变化，并对肺组织损伤进行评分，以评价BBP对ALI小鼠的保护作用。评分标准包括4个指标：肺泡充血、出血、中性粒细胞在肺泡壁或血管壁浸润或聚集、肺泡壁增厚或透明膜形成。根据病变的严重程度评分为0~4分：0分，即没有病变或非常轻微的病变；1分，为轻度病变；2分，为中度病变；3分，为重度病变；4分，为极其严重的病变。总分为16分，4项评价得分之和为总分。

1.13 肺组织中炎性因子水平的测定

肺组织用冷PBS洗涤，称质量，剪碎，以1∶9的比例在PBS中研磨。将匀浆液进行冻融循环以进一步裂解细胞，并在4 ℃下以5000 r/min离心10 min，收集上清液，按照ELISA试剂盒的操作方法测定TNF-α、COX-2、IL-1β和IL-6的含量。

1.14 肺组织MDA、SOD和NO的含量测定

肺组织用冷PBS洗涤，称质量，剪碎，以1∶9的比例在PBS中研磨。将匀浆液进行冻融循环以进一步裂解细胞，并在4 ℃下以5000 r/min离心10 min，收集上清液，按照试剂盒的说明书测定氧化因子水平（MDA、SOD、NO）。

1.15 肺组织免疫组化分析

肺组织石蜡切片脱蜡。用3%过氧化氢处理10 min，阻断内源性过氧化物酶。肺组织用5% BSA封闭1 h，加入一抗稀释液：p65（1∶500）、IL-1β（1∶100）、Nrf-2（1∶100）和HO-1（1∶100）孵育（4 ℃过夜），清洗后加入HRP标记山羊抗兔二抗（1∶100）室温下孵育1 h。用PBS洗涤3次，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察切片，Image J 软件分析。

1.16 Western blotting检测肺组织中NF-κB和Nrf2/HO-1通路中相关蛋白的表达

将收集得到的肺组织置于培养皿中，剪碎，加入1 mL冷的RIPA裂解液，提取肺组织蛋白。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样本蛋白浓度。用10% SDS-PAGE分离蛋白，并转移到PVDF膜上。然后，将NC/PVDF膜放入5%脱脂奶粉封闭液中，摇床振荡1.5~2 h。封闭结束后，用TBST洗膜5 min×3次。将膜放入一抗稀释液中［IκBα（1∶1000）、p65（1∶1000）、Keap-1（1∶5000）、Nrf-2（1∶1000）、HO-1（1∶1000）、β-actin（1∶1000）］，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜5 min×3次。用HRP标记的二抗即山羊抗兔抗体（1∶5000）室温孵育1 h。最后，使用ECL试剂对条带进行可视化，并用Image J软件进行分析。β-actin作为内参进行半定量分析。

1.17 统计学分析

采用SPSS 21.0进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验进行两组间比较，3组及以上的比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 BBP减轻LPS诱导的RAW264.7细胞损伤及炎症反应

CCK-8检测结果显示，BBP（6.25~50 μg/mL）对RAW 264.7细胞活力无明显作用。BBP（75~200 μg/mL）对RAW 264.7细胞活力具有抑制作用（P<0.05，P<0.01，P<0.001，图1A）。通过LPS诱导建立了ALI的细胞模型，LPS处理后的RAW264.7细胞活力降低。给予不同浓度的BBP（12.5~50 μg/mL）处理后，细胞活力增加（P<0.01，图1B）。其中，BBP（12.5 μg/mL）组与BBP（25 μg/mL）组相比细胞活力无明显变化，而BBP（50 μg/mL）组细胞活力略有下降。基于细胞毒性和保护作用，选择6.25、12.5 μg/mL作为BBP的低、高剂量进行后续的细胞实验。

ELISA检测结果显示（图2），与对照组相比，模型组增加了细胞中TNF-α、IL-6、COX-2和IL-1β水平（P<0.001）。与模型组相比，BBP组（12.5 μg/mL）降低TNF-α、IL-6、COX-2和IL-1β水平（P<0.01）。

2.2 BBP对LPS诱导的RAW264.7细胞氧化应激的影响

试剂盒检测细胞SOD、MDA和NO水平结果显示（图3），与对照组相比，模型组MDA和NO水平升高，SOD水平降低（P<0.01）。然而，BBP（12.5 μg/mL）降低了LPS刺激的RAW264.7细胞MDA和NO活性，并增加了SOD活性（P<0.01，P<0.001）。

2.3 BBP对LPS诱导的RAW264.7细胞中ROS表达的影响

与对照组相比，模型组细胞中的ROS含量升高；而经BBP处理后，细胞中的ROS含量降低（图4）。

2.4 BBP通过调控Nrf-2/HO-1和NF-κB信号通路保护LPS诱导的RAW264.7细胞炎症和氧化应激损伤

qRT-PCR检测结果显示（图5），与对照组相比，模型组细胞中Keap-1、TNF-α、NF-κB（p65）和IL-1β的mRNA表达水平增加，而IκB-α、Nrf-2和HO-1的mRNA表达显著降低（P<0.01）。与模型组相比，BBP治疗后降低了Keap-1、TNF-α、NF-κB（p65）和IL-1β的mRNA表达水平，并增加IκB-α、Nrf-2和HO-1的mRNA表达水平（P<0.01）。

2.5 BBP对ALI小鼠肺组织病理学变化

HE染色结果显示，与对照组相比，模型组出现了明显的肺组织病理学改变，包括中性粒细胞浸润、肺泡损伤、出血和肺水肿（图6A）。给予BBP（120 mg/kg）处理后，LPS诱导的ALI小鼠肺组织病理学变化减轻。肺损伤评分结果也显示出相似的变化趋势。与对照组相比，模型组肺损伤评分增加，而BBP组（120 mg/kg）小鼠肺损伤评分降低（P<0.01，图6B）。测定各组肺湿/干质量比结果显示（图6C），与对照组相比，模型组LPS刺激上调了肺湿/干质量比，而经BBP（120 mg/kg）处理后降低。

2.6 BBP对ALI小鼠BALF中总细胞数、中性粒细胞数、蛋白含量及肺组织MPO活性的影响

与对照组相比，模型组LPS刺激增加了总细胞和中性粒细胞的数量（P<0.01）；与模型组相比，BBP组（120 mg/kg）小鼠总细胞和中性粒细胞的数量减少（P<0.05，图7A、B）。与对照组相比，LPS处理组小鼠BALF中的蛋白浓度增加；与模型组相比，BBP（120 mg/kg）组降低BALF中的蛋白浓度（120 mg/kg）蛋白浓度显著降低（P<0.05，图7C）。与对照组相比，模型组小鼠MPO活性升高；与模型组相比，BBP（120 mg/kg）降低MPO活性（P<0.05，图7D）。

2.7 BBP对LPS诱导的ALI小鼠炎症反应和氧化应激损伤的影响

ELISA检测结果显示（图8），与对照组相比，模型组小鼠肺组织中COX-2、IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高（P<0.01）。与模型组相比，BBP（120 mg/kg）组降低了COX-2、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平（P<0.05）。此外，与对照组相比，模型组小鼠肺组织中MDA和NO浓度升高，而SOD浓度降低（P<0.01）。然而，与模型组相比，BBP组（120 mg/kg）降低了MDA和NO的浓度，升高了SOD的浓度（P<0.01）。

2.8 BBP对LPS诱导ALI小鼠肺组织中Nrf-2/HO-1和NF-κB信号通路相关蛋白的表达的影响

免疫组化结果显示（图9），与对照组相比，模型组经LPS刺激后显著增加了肺组织中NF-κB（p65）、IL-1β的表达，降低Nrf-2、HO-1的表达（P<0.01）。而与模型组比较，BBP（120 mg/kg）组p65和IL-1β的表达水平降低，Nrf-2和HO-1的表达升高（P<0.05）。

Western blotting结果显示（图10），与对照组相比，模型组肺组织中NF-κB（p65）和Keap-1蛋白水平升高，IκB-α，Nrf-2和HO-1蛋白水平降低（P<0.01）。经BBP预处理后，ALI小鼠肺组织中p65和Keap-1蛋白水平降低，而IκB-α，Nrf-2和HO-1蛋白水平升高（P<0.05）。

3 讨论

ALI及其严重形式急性呼吸窘迫综合征是临床常见的危重的呼吸病症之一。其病理生理主要特征在于“失调的炎症反应”^［5］。主要病理变化包括中性粒细胞和巨噬细胞等免疫细胞在肺组织浸润、肺泡-毛细血管屏障破坏、肺水肿形成，以及支气管肺泡灌洗液（BALF）、血清和肺组织中TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎细胞因子水平显著升高等^［3］。熊胆粉作为传统中药，历来被用于治疗热证、惊风及多种炎症性疾病。现代药理学研究表明，熊胆粉富含胆汁酸、氨基酸及微量元素等活性成分，具有明确的抗炎、抗氧化、解热及抗癌等作用。但熊胆粉是否通过调控炎症反应和氧化应激发挥抗ALI的作用尚不清楚。本研究首先通过CCK-8毒性实验确定BBP在6.25~50 μg/mL对RAW264.7细胞无明显毒性，再通过LPS诱导的细胞损伤模型发现BBP在12.5 μg/mL时具有显著的保护作用，故选择6.25、12.5 μg/mL为细胞实验剂量；在动物实验中，根据人体每日摄取量及相关文献，并结合前期预实验剂量筛选结果，选择30、120 mg/kg为小鼠体内低、高剂量。本研究发现，BBP能显著改善LPS诱导的肺组织病理损伤，降低肺组织病理评分、肺湿/干重比、MPO活性及BALF中总蛋白浓度和总细胞数水平，并降低细胞及肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2等关键炎症因子水平。此外，值得注意的是，LPS激活的巨噬细胞能够产生大量的活性氧（ROS），引发氧化应激损伤，加重ALI的发生和发展。结果显示，BBP能有效抑制LPS刺激下细胞和组织中ROS、MDA和NO的水平，同时提升SOD活性。上述数据表明，BBP可能通过拮抗巨噬细胞主导的炎症反应和氧化应激损伤，对LPS诱导的ALI发挥保护作用。

NF-κB和Nrf-2 / HO-1信号通路作为炎症反应和氧化应激的关键调节机制，在ALI发生和发展中发挥着关键作用^［23-24］。一方面，当机体受到LPS刺激后，模式识别受体TLR4激活，通过IKK复合物磷酸化降解IκB-α，使NF-κB （p65）发生核转位，驱动TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子大量释放，放大炎症并加剧组织损伤^［25］。另一方面Nrf-2作为抗氧化反应的中心调节因子，在静息条件下与其抑制蛋白Keap-1结合，并在细胞质中发生泛素介导的降解。然而，当LPS进入机体，产生大量的ROS诱导氧化应激反应，使Nrf-2从Keap-1解离，转位进入细胞核，启动下游抗氧化基因如HO-1、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH–Px）的转录，从而增强细胞对氧化损伤的防御机制^［26］。此外，二者在ALI进程中存在紧密相互拮抗、相互调控的对话机制。首先，NF-κB可以直接或间接抑制Nrf-2通路。激活NF-κB通路，一方面可以驱动TNF-α、IL-1β、IL-6等因子大量释放，激活其下游信号如JNK、p38 MAPK通路，诱导Nrf-2蛋白磷酸化，加速其通过Keap-1泛素化降解，促进Nrf-2降解。另一方面，过度活化的NF-κB会与Nrf-2竞争转录共激活因子CBP/p300，调控Nrf-2介导ARE表达，导致Nrf-2中部分DNA结合结构域Neh1乙酰化，使其无法有效启动HO-1等抗氧化基因，从而削弱细胞的抗氧化能力。其次，Nrf-2通路对NF-κB通路具有负反馈作用。缺失的Nrf-2，导致细胞因子产量增强，使得IKKβ活性增强，增强了IκBα的磷酸化，加速其降解，致使NF-κB更容易被激活^［27］。Nrf-2的激活不仅可以抑制经典NF-κB信号，还能抑制NLRP3炎症小体的组装与激活。HO-1及其产物胆红素能有效清除ROS，而ROS是NLRP3炎症小体的关键激活剂。通过减少ROS间接阻止由炎症小体介导的caspase-1活化及IL-1β、IL-18的成熟，这是NF-κB下游的重要环节^［7］。值得注意的是，Keap-1是介导IKKβ泛素化的关键节点，表明在氧化应激条件下，当Nrf-2从Keap-1上解离时，被释放的Keap-1可以参与IKKβ的抑制，从而实现Nrf-2和NF-κB的调控，协同调节抗氧化和抗炎反应。因此，在制定ALI的治疗策略时，同时抑制NF- κB通路和激活Nrf-2通路不仅可以减轻过度的炎症反应，还可以增强组织抗氧化能力，从而为新型多靶点干预ALI奠定基础^［28］。研究表明，通过调控NF-κB和Nrf-2/ HO-1信号通路可以发挥抗ALI的作用。例如，黄皮酰胺类似物通过调节Keap1/Nrf-2/NF-κB通路减轻氧化应激和炎症，从而改善ALI^［29］；长春碱通过作用于Nrf-2 / NF-κB信号通路发挥抗ALI作用^［30］；β-石竹烯通过靶向ACE2/MasR轴和Nrf-2/HO-1/NF-κB轴减轻ALI引发的氧化应激和炎症反应^［31］。

熊胆粉中主要成分为胆汁酸类化合物，包括鹅去氧胆酸（CDCA）、熊去氧胆酸（UDCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）、牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）等，约占总成分的65%以上。有研究发现，BBP通过抑制CD14通路和改善肠道菌群，增加短链脂肪酸（SCFAs）的产生，改善LPS诱导的ALI。SCFAs具有调节全身性炎症和Nrf-2通路的作用^［32］；UDCA和CDCA通过调节AQP1、AQP5和凋亡蛋白（BAX、Caspase 3和BCL-2）表达，降低氧化应激，减弱NF-κB促炎活性，实现治疗ALI的目的^［33］；TUDCA通过调节TLR2/MAPK/NF-κB，改善ALI^［34］；UDCA通过调节FXR/ p38MAPK/NF-κB，改善ALI^［35］；UDCA通过激活NRF-2，诱导上皮向间充质的转变（EMT），增加糖酵解，并降低了卵巢癌细胞中氧化应激，发挥抗卵巢癌的作用^［36］。以上研究表明BBP及其成分能够通过作用于NF-κB、NRF-2及凋亡通路发挥药效作用。但关于BBP直接作用于Keap-1、Nrf-2或IKK等靶点发挥抗ALI的作用分子机制研究尚不完整。基于此，本研究通过qPCR检测发现，BBP可以显著降低细胞中TNF-α、IL-1β、Keap-1和NF-κB（p65）的mRNA表达水平，升高IκB-α、Nrf-2和HO-1的mRNA表达水平。免疫组化和Western blotting结果显示，BBP（120 mg/kg）可降低ALI小鼠肺组织中NF-κB和Keap-1的蛋白表达水平，增加IκBα、Nrf-2和HO-1的蛋白表达水平。表明BBP能够通过调节Nrf-2/HO-1和NF-κB信号通路发挥抗ALI的作用，与已有的研究成果相对应。

本研究首次发现，BBP可能通过从转录或翻译层面抑制Keap-1的合成，解除对Nrf-2的束缚，最终导致Nrf-2及其下游保护性蛋白HO-1的表达显著上调。与此同时，BBP通过下调p65并上调其抑制蛋白IκBα的表达，协同抑制NF-κB信号通路介导的炎症反应，从而重塑巨噬细胞功能从促炎（M1）表型向抗炎修复（M2）表型转化，有效缓解LPS诱导的急性肺损伤。此外，熊胆粉作为传统中医药中的珍贵动物药，与临床常用的抗炎药物相比具有独特的潜在优势。其一，地塞米松作为糖皮质激素，主要通过广泛抑制免疫细胞的活化发挥非特异性抗炎作用，长期使用易导致免疫抑制、耐药性、胃肠道损伤等不良反应。其二，地塞米松的抗氧化作用较弱，主要依赖抗炎效应间接减轻氧化应激；而BBP可直接激活Nrf-2/HO-1抗氧化通路，同时抑制NF-κB炎症通路，实现“抗炎-抗氧化”双重调控，更契合ALI级联发病机制。BBP作为天然药物，具有多成分、多靶点的特性。这种多靶点特性，不仅阐明了BBP发挥抗ALI作用及其机制，为朝药学中熊胆粉“驱肺之邪气”的传统功效作出了科学阐述。同时进一步验证了同时干预炎症和氧化应激这一治疗策略的可行性，为后续开发ALI治疗药物奠定基础。

综上所述，本研究采用体内外实验相结合的方法，验证BBP治疗ALI的作用及作用机制，结果发现，BBP可能通过作用于Nrf-2/HO-1和NF-κB信号通路，改善肺组织病理变化，抑制炎症反应及氧化损伤，从而治疗ALI，为后续BBP在治疗肺部疾病方面的提供前期的实验基础。

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