C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白通过抑制内质网自噬并增强内质网-线粒体互作促进肝细胞焦亡

CHOP promotes hepatocyte pyroptosis by downregulating endoplasmic reticulophagy and enhancing endoplasmic reticulum-mitochondria interaction

摘要

目的 探讨C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）在二硫苏糖醇（DTT）诱导的大鼠正常肝细胞（BRL-3A）内质网自噬（ER-phagy）中的作用，并分析其通过内质网-线粒体互作调控肝细胞焦亡的潜在机制。 方法 DTT作用于BRL-3A细胞0、12、36 h，Western blotting检测CHOP蛋白、内质网自噬、线粒体-内质网接触位点（MERCs）及焦亡相关蛋白的变化；DTT处理BRL-3A细胞36 h，采用染色质免疫共沉淀（ChIP）技术检测CHOP在ATG5、ATG12、LC3基因启动子区域的结合情况；使用自噬晚期抑制剂巴佛洛霉素A1（BafA1）预处理BRL-3A细胞，通过Hoechst 33342与碘化丙啶（PI）双染法测定细胞死亡水平，观察内质网自噬被抑制后对DTT诱导的肝细胞死亡的影响；采用过表达CHOP的慢病毒感染BRL-3A细胞，Western blotting检测CHOP基因过表达后各组细胞中内质网自噬、MERCs相关蛋白及焦亡相关蛋白的变化；免疫荧光双染观察过表达CHOP对内质网标志蛋白与自噬体标志蛋白共定位水平的影响；通过细胞器荧光探针，观察过表达CHOP对内质网与溶酶体及内质网与线粒体共定位水平的影响；检测过表达CHOP后线粒体内Ca²⁺浓度、线粒体膜电位及线粒体中焦亡蛋白GSDMD-N的变化。 结果 相较于0 h组，DTT处理BRL-3A细胞12 h后，CHOP蛋白表达无显著变化，而内质网自噬、MERCs相关蛋白及焦亡相关蛋白水平均上调；至36 h时，CHOP蛋白表达升高，MERCs相关蛋白及焦亡相关蛋白水平持续增加，而内质网自噬水平则有所下降（P<0.05）；ChIP结果显示，DTT处理细胞36 h后CHOP在自噬相关基因启动子区的富集减少（P<0.05）；采用自噬抑制剂预处理BRL-3A细胞后能显著增强DTT诱导的细胞死亡。过表达CHOP后，内质网自噬相关蛋白水平下调，而MERCs相关蛋白及焦亡相关蛋白水平上调（P<0.05）；激光共聚焦显微镜观察发现，过表达CHOP后内质网与自噬体及溶酶体的共定位区域减少，而内质网与线粒体的共定位区域增多并且线粒体内钙离子水平及GSDMD-N蛋白表达增加（P<0.05）；JC-1荧光染色实验证实，过表达CHOP后，线粒体跨膜电位降低（P<0.05）。 结论 CHOP蛋白通过抑制内质网自噬并增强内质网-线粒体之间的相互作用，导致从内质网转移到线粒体的Ca²⁺增多，进而促进肝细胞焦亡。

Abstract

Objective To investigate the role of C/EBP homologous protein (CHOP) in dithiothreitol (DTT)‑induced endoplasmic reticulophagy in murine hepatocytes cells and its mechanism for regulating hepatocytes pyroptosis through endoplasmic reticulum (ER)‑mitochondria interactions. Methods The changes in CHOP, endoplasmic reticulophagy, mitochondrial-ER contact sites (MERCs)-associated protein, and pyroptosis-associated proteins in DTT-treated BRL-3A cells were examined using Western blotting, and CHOP enrichment in the promoter regions of ATG5, ATG12 and LC3 genes was detected using ChIP assay. The effect of bafilomycin A1 (an autophagy inhibitor) pretreatment on DTT-induced BRL-3A cell death was assessed using Hoechst 33342 and propidium iodide staining. The effects of lentivirus-mediated CHOP overexpression in the hepatocytes on ER-phagy, MERCs-associated proteins, pyroptosis-associated proteins, and colocalizations of ER with the autophagosomes, lysosomes and mitochondria were examined using Western blotting and immunofluorescence double staining; the changes in intramitochondrial Ca²⁺, mitochondrial membrane potential and intramitochondrial GSDMD-N levels were also analyzed. Results DTT treatment for 12 h did not significantly affect CHOP protein expression but significantly upregulated ER-phagy, MERCs-associated proteins, and pyroptosis-associated proteins in BRL-3A cells. DTT treatment for 36 h markedly increased CHOP protein expression and further increased MERCs-associated proteins and pyroptosis-associated protein levels, but moderately decreased ER-phagy levels. DDT treatment significantly downregulated CHOP enrichment in the promoter regions of ATG5, ATG12 and LC3 genes in BRL-3A cells. Pretreatment with bafilomycin A1 significantly increased DTT-induced BRL-3A cell death. CHOP overexpression in BRL-3A cells downregulated the levels of endoplasmic reticulophagy-related proteins, upregulated MERCs- and pyroptosis-related proteins, and reduced the colocalization of ER with autophagosomes and lysosomes, and increased its colocalization with the mitochondria, resulting in also elevated intramitochondrial Ca²⁺ levels and GSDMD-N protein and decreased mitochondrial transmembrane potential. Conclusion CHOP promotes hepatocytes pyroptosis by suppressing ER-phagy and enhancing ER-mitochondrial interactions, which leads to increased Ca²⁺ shuttling from the ER to the mitochondria.

Graphical abstract

关键词

C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白 / 内质网自噬 / 内质网-线粒体相互作用 / 肝细胞焦亡

Key words

C/EBP homologous protein / endoplasmic reticulophagy / endoplasmic reticulum-mitochondria interactions / hepatocyte pyroptosis

内质网是蛋白质翻译后折叠与修饰的核心场所，同时它在钙离子存储及脂类、碳水化合物代谢中也扮演重要角色^{［1， 2］}。一旦机体出现病毒感染、钙离子紊乱和异常蛋白积累等有害因素侵袭时，内质网稳态即刻被打破，进而引发内质网应激（ERS）^［3］。此时，细胞可启动未折叠蛋白反应（UPR）抑制蛋白合成以减轻内质网压力，从而恢复内质网稳态^{［4， 5］}。有研究发现，细胞除了依赖UPR缓解内质网压力外，还可通过内质网相关蛋白降解途径降解异常聚集的蛋白，以恢复内质网稳态^［6］。而内质网自噬（ER-phagy）作为近年来新发现的选择性自噬，其可通过清除受损的内质网片段和异常蛋白，协助缓解ERS并恢复细胞稳态^［7］。

C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）是ERS过程中的重要转录因子之一^［8］。我们的前期研究发现^［9］，当ERS持续较长时间时，细胞可通过UPR上调CHOP蛋白的表达，过表达的CHOP可破坏内质网膜的完整性，使内质网中的Ca^{2 +}向胞质外流，最终导致细胞内钙超载及细胞凋亡的发生。此外，有研究发现^［10］，随着应激时间的延长，CHOP可在转录水平上抑制自噬相关基因的表达，使应激状态下的细胞难以恢复稳态，从而加速细胞死亡。然而，作为ERS中重要转录因子的CHOP是否通过其他机制调控肝细胞死亡，目前尚不明确。

内质网与线粒体作为真核细胞内体积较大的细胞器，两者并非彼此独立，而是依赖线粒体相关内质网膜，又称为线粒体-内质网接触位点（MERCs）实现功能性联系^［11］。MERCs由多种蛋白复合体组成，其中肌醇1，4，5-三磷酸受体1型（IP3R1）、葡萄糖调节蛋白75（GRP75）和电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）在内质网Ca²⁺向线粒体的转运中发挥重要作用。MERCs的功能失调可导致线粒体钙超载，进而引发线粒体膜电位丧失、活性氧生成增多等问题，这些变化与多种疾病的发生密切相关^{［12，13］}。因此，MERCs作为内质网应激与线粒体功能障碍间的重要连接点，其分子机制和调控网络的研究，对于解析细胞内稳态失调及细胞死亡的病理机制具有重要意义^［14］。

细胞焦亡作为一种新型的细胞死亡方式，广泛参于酒精性及非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎等肝脏疾病的病理进程^［15］。研究发现，线粒体功能损伤除了可引发细胞凋亡之外，还可以引起另一种重要的细胞死亡形式，即细胞焦亡。CHOP蛋白在细胞发生内质网应激期间可通过调控内质网Ca²⁺的释放，导致线粒体内Ca²⁺超载和线粒体功能紊乱，进一步通过释放线粒体DNA，激活NLRP3炎症小体，诱导细胞焦亡的发生^［16-18］。线粒体-内质网接触位点还是重要的炎症信号平台，能够参与NLRP3的招募与激活，形成成熟的炎症小体，进而推动细胞焦亡的发生^［19］。然而，在肝细胞中，CHOP是否可通过促进细胞焦亡加重肝细胞损伤，目前尚不清楚。

尽管CHOP介导的肝细胞凋亡被广泛证实，但细胞焦亡作为一种炎症性程序性死亡，与凋亡在病理及分子机制上存在显著差异。凋亡细胞以非炎症性崩解为特征，而焦亡依赖GSDMD裂解与促炎因子释放，是肝细胞应激微环境中炎症信号放大的关键环节。目前CHOP在DTT诱导的肝细胞焦亡中的调控作用尚未被阐明，揭示其在肝细胞焦亡中的分子调控机制能够为临床急慢性肝脏疾病治疗中保护肝细胞，减少肝细胞死亡提供新的治疗靶点。

本研究通过二硫苏糖醇（DTT）构建肝细胞内质网应激模型，并利用慢病毒感染技术过表达CHOP，探讨CHOP是否通过抑制内质网自噬，并增强内质网与线粒体的相互作用，进而影响内质网向线粒体的Ca²⁺转运，从而引发线粒体损伤，促进肝细胞焦亡的发生，旨在为内质网应激下CHOP调控肝细胞死亡模式提供新的理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠正常肝细胞BRL-3A（中国科学院典型细胞培养物保藏中心上海细胞库）；DMEM培养基（Biological Industries）；胎牛血清（Gibco）；胰酶、彩虹Marker、BCA蛋白定量试剂盒和DTT（北京索莱宝科技有限公司）；细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、ECL化学发光试剂盒（常州天地人和生物科技有限公司）；CHOP过表达的慢病毒（上海吉凯基因科技有限公司）；ATG5抗体、LC3抗体、IP3R1抗体、VDAC1抗体及β-actin抗体（Abcam），CHOP抗体（CST），CCPG1抗体（武汉三鹰），GRP75抗体、NLRP3抗体、GSDMD抗体、Cleaved-Caspase1抗体（杭州华安生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

以大鼠正常肝细胞株BRL-3A制备体外细胞模型，开展后续实验。该细胞系的完全培养基配方包含90% DMEM基础培养基、10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素混合抗生素。实验过程中，细胞培养环境参数设定为：恒温37 ℃，5% CO₂浓度。BRL-3A细胞具有贴壁生长特性，需每日通过倒置荧光显微镜监测其生长状况，培养基更换频率为2~3 d，当细胞融合率达到80%时，按1∶3比例进行传代培养。

1.2.2 ERS细胞模型的建立

根据前期预实验结果并结合相关文献报道^［21］，使用终浓度为2.0 mmol/L的DTT诱导BRL-3A细胞发生ERS，处理时间分别为 0、12、36 h，收集细胞样本用于Western blotting。

1.2.3 Hoechst 33342/PI双染法检测细胞死亡水平

采用0.5 nmol/L BafA1预处理BRL-3A细胞12 h后，加入2 mmol/L DTT持续作用12 h，弃上清，PBS洗涤，加入5 µL Hoechst染色液和5 µL PI染色液于500 µL缓冲液中混匀，配制好后加入皿中，37 ℃孵育20~30 min，孵育结束后弃去染色液，加入完全培养基，激光共聚焦显微镜进行观察。

1.2.4 染色质免疫共沉淀检测CHOP在ATG5、ATG12和LC3基因启动子区的富集情况

将BRL-3A细胞接种于10 cm培养皿，待密度达80%时用0、2 mmol/L DTT处理36 h。细胞经1%甲醛室温交联10 min，甘氨酸终止交联后，用预冷PBS洗涤并收集细胞沉淀。沉淀经裂解、超声破碎获得染色质片段，取10 μL上清作为Input对照并保存于-20 ℃。剩余上清与CHOP抗体（5 μL）或兔IgG阴性对照抗体（1 μL）在4 ℃孵育过夜，随后加入ChIP级蛋白A/G磁珠继续孵育2 h。磁珠经IP洗涤缓冲液1和缓冲液2分别洗涤3次、1次后，用1×IP洗脱缓冲液在65 ℃洗脱复合物40 min。洗脱产物与Input样品均经蛋白酶K消化、65 ℃解交联90 min，最后通过DNA纯化柱回收DNA，继续进行qPCR检测，反应体系及反应条件同1.2.6。ATG5、ATG12和LC3基因启动子区设计的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体如下：ATG5-F：AACCAAACCACCCC AATCACTC，ATG5-R：TGTTCCCGGTTGTCAGTT GTAG；ATG12-F：AGCGAGCCAAAGTTGCTGAG，ATG12-R：TTGTCTCCGGTGGACTGATTTC；LC3-F：TGGTGAAGGCGCTGTGAATTAC，LC3-R：ACGAT CGGCAAGCTTGTCTTTG。

1.2.5 CHOP慢病毒感染细胞

6孔板铺入BRL-3A细胞1×10⁵/孔，加入1 mL完全培养基，次日将空载病毒和过表达CHOP病毒原液稀释至1×10⁸ TU/mL，弃上清，PBS洗涤细胞两次，加入9940 µL完全培养基、40 µL P感染增强液以及20 µL稀释后的病毒，继续培养16 h后，弃上清，PBS轻柔洗涤细胞，加入1 mL完全培养基继续培养72 h，加入适量的嘌呤霉素对细胞进行筛选，使其终浓度为4 µg/mL，嘌呤霉素作用24 h后进行换液，即获得稳定株，加入完全培养基继续培养以进行后续实验。

1.2.6 RT-PCR检测

每组细胞弃上清后PBS轻柔洗涤细胞，加入500 µL的Buffer QLS裂解液于冰上裂解10 min，收集细胞裂解液提取RNA，测量每组样本的RNA浓度，以计算每组样本含1 μg RNA的体积，按照逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系：5×g DNA Clean Reaction Mix 4 µL，5×Evo M-MLV RT Reaction Mix 4 μL，RNA样品为含1 μg RNA的体积，RNase-free H₂O补足反应体系，反应条件为：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存，逆转录合成后的cDNA保存于-80 ℃待使用，然后按照说明书配制实时荧光定量PCR反应体系：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 µL，DNA Sample 2 µL，Primer F（10 μmol/L）0.4 µL，Primer R（10 μmol/L）0.4 µL，RNase free water 7.2 µL，反应条件为：95 ℃ 30 s循环1次，95 ℃ 5 s 循环40次，60 ℃ 30 s循环40次，65 ℃ 5 s，95 ℃ 1 min。实验所用CHOP基因的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，CHOP-F：CCTCGCTCTCCAGATTCCAGTC，CHOP-R：TCATTCTCCTGCTCCTTCTCCTTC。

1.2.7 Western blotting检测各组细胞中CHOP蛋白、内质网自噬相关蛋白、线粒体-内质网接触位点相关蛋白及焦亡相关蛋白的变化

收集各组细胞，经预冷PBS洗涤后，使用100 µL裂解液裂解并刮取细胞，离心后取上清获得蛋白样本。依据BCA法测定蛋白浓度，并统一以40 µg蛋白进行SDS-PAGE。电泳程序设置为：80 V持续30 min后120 V持续1 h。随后在300 mA恒定电流下通过湿转法持续1 h，将目的蛋白转移至PVDF膜上，最后用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1 h。将一抗与一抗稀释液按以下比例稀释：CHOP（1∶1000）、CCPG1（1∶500）、ATG5（1∶1000）、ATG12（1∶1500）、LC3（1∶1000）、GRP75（1∶1000）、VDAC1（1∶2000）、IP3R1 （1∶1000）、NLRP3（1∶1000）、GSDMD（1∶1000）、Cleaved-Caspase1（1∶2000）、β-actin（1∶2000），将相应的目标蛋白置于一抗中4 ℃孵育过夜。次日，取出PVDF膜并用TBST洗涤3次（5 min/次），再与羊抗兔IgG抗体（1∶10 000）于室温孵育1 h，TBST洗涤3次（5 min/次）。按1∶1配置ECL发光液，将PVDF膜浸泡于发光液中20 s后使用化学发光成像仪检测显影。使用Image J软件对Western blotting所获得的蛋白条带进行半定量分析。为标准化数据，将目标蛋白与内参蛋白（β-actin）的条带灰度值进行比较，以其比值代表目标蛋白的相对表达量。

1.2.8 免疫荧光双染检测 DTT、LV-NC（空载病毒组）、LV-CHOP（过表达CHOP 组）中内质网标志蛋白Calnexin与自噬体标志蛋白LC3的共定位水平

每组细胞弃上清，PBS轻柔洗涤细胞2次，4%多聚甲醛室温固定20 min，0.3% Triton X-100通透10 min，随后PBS轻柔洗涤细胞3次，5% BSA 37 ℃封闭1 h。加入一抗混合液（兔抗Calnexin 1∶200+鼠抗LC3 1∶200）4 ℃孵育过夜。次日，PBS轻柔洗涤细胞3次，荧光二抗混合液（Alexa Fluor 594标记山羊抗兔IgG 1∶500+Alexa Fluor 488标记山羊抗鼠IgG 1∶500）室温避光孵育2 h，随后PBS轻柔洗涤细胞3次，DAPI染核10 min，PBS 轻柔洗涤细胞3次，抗荧光淬灭封片后，通过激光共聚焦显微镜进行观察。

1.2.9 内质网荧光探针、溶酶体荧光探针及线粒体荧光探针检测过表达CHOP对内质网与溶酶体及内质网与线粒体共定位的影响

将内质网红色荧光探针（ER-Tracker Red）、溶酶体绿色荧光探针（Lyso-Tracker Green）及线粒体绿色荧光探针（Mito-Tracker Green）恢复至室温，瞬时离心，将2 µL ER-Tracker Red与0.4 µL Lyso-Tracker Green或者2 µL ER-Tracker Red与0.4 µL Mito-Tracker Green溶于2 mL DMEM中，充分混匀后在37 ℃水浴条件下进行预温育，移除培养皿中的培养基，PBS清洗2次，加入配制好的探针工作液，于37 ℃培养箱中避光孵育40 min，弃去工作液，PBS轻柔洗涤两次，通过激光共聚焦显微镜进行观察。

1.2.10 线粒体荧光探针与钙离子荧光探针检测过表达CHOP对线粒体内Ca²⁺浓度的影响

将0.4 µL线粒体绿色荧光探针Mito-Tracker Green与10 µL钙离子红色荧光Rhod-2 AM溶于2 mL DMEM中，在棕色管中混匀并于37 ℃水浴预热。细胞经PBS清洗2次后，加入配制好的探针工作液，于37 ℃培养箱中避光孵育40 min，弃去工作液，PBS轻柔洗涤2次，通过激光共聚焦显微镜进行观察。

1.2.11 JC-1染色法评估过表达CHOP对线粒体膜电位的影响

JC-1染料恢复至室温，各组细胞中加入10 µL JC-1染液，放入培养箱孵育25 min，每5 min涡旋混匀1次，结束后，每组细胞以400×g、4 ℃离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS重悬细胞，通过流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化。

1.2.12 线粒体荧光探针及GSDMD-N免疫荧光染色观察过表达CHOP对线粒体内GSDMD-N的影响

按照1∶1000的比例配制线粒体洋红色荧光探针Mito-Tracker Deep Red工作液，随后将1 mL配制好的Mito-Tracker Deep Red工作液加入培养皿中，置于细胞培养箱中37 ℃孵育25 min，孵育结束后，弃上清，PBS洗涤细胞2次，加入1 mL免疫染色固定液，室温固定10 min，吸弃免疫染色固定液，1 mL PBST在摇床上清洗3次（5 min/次）；弃掉PBST后，添加1 mL免疫染色封闭液，置于摇床上在室温条件下缓慢振荡封闭15 min。封闭完成后，去除封闭液，并加入经1∶100比例稀释的GSDMD-N抗体，置于4 ℃环境中进行过夜孵育；次日，用1 mL PBST在摇床上清洗5 min，重复3次；加入1∶200稀释的Goat Anti-Rabbit IgG（绿色荧光），于摇床上室温孵育1 h，弃去培养皿中的液体，1 mL PBST在摇床上重复清洗3次，使用激光共聚焦显微镜进行观察。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 9软件进行统计处理。所有实验至少独立重复3次，计量资料以均数±标准差表示。组间比较使用单因素方差分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DTT处理BRL-3A细胞对CHOP蛋白、内质网自噬、线粒体-内质网接触位点相关蛋白及细胞焦亡相关蛋白表达的影响

相较于0 h组，DTT处理细胞12 h时，CHOP蛋白的表达没有明显差异，而36 h时的表达水平较12 h明显增加（P<0.05，图1A）。内质网自噬相关蛋白CCPG1、ATG5、ATG12的表达水平以及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在12 h时有所增加，但在36 h时呈下降趋势（P<0.05，图1B）。与0 h组相比，DTT处理细胞12、36 h后线粒体-内质网接触位点相关蛋白GRP75、VDAC1、IP3R1及细胞焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Cleaved-Caspase1表达水平均逐渐升高（P<0.05，图1C、D）。

2.2 自噬抑制对DTT诱导的细胞死亡的影响

Hoechst 33342与碘化丙啶（PI）双染后通过激光共聚焦显微镜检测结果显示，存活细胞仅呈现Hoechst 33342的蓝色荧光，而死亡细胞则同时呈现PI与Hoechst 33342的叠加荧光（粉色）。与DTT单独处理组比较，联合BafA1处理组的细胞死亡率上升（图2）。

2.3 肝细胞发生内质网应激过程中CHOP在自噬相关基因启动子区的富集情况

琼脂糖凝胶电泳结果显示，在超声处理后，protein-DNA复合物片段的大小集中在200~1000 bp，符合实验要求。ChIP实验结果显示，DTT处理组相比于对照组，在自噬相关基因ATG5、LC3和ATG5启动子区域，CHOP的富集程度（%Input）有所下降（图3）。

2.4 LV-CHOP稳定株的过表达效率验证

RT-qPCR和Western blotting检测结果显示，慢病毒感染BRL-3A细胞后，LV-CHOP稳定株细胞中CHOP mRNA和蛋白水平均升高（P<0.01，图4）。

2.5 过表达CHOP对BRL-3A细胞中内质网自噬水平的影响

Western blotting检测结果显示，与DTT组和LV-NC+DTT组比较，过表达CHOP下调了内质网自噬相关蛋白CCPG1、ATG5、ATG12的表达。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值也明显降低（P<0.05，图5A）。免疫荧光双染检测内质网标志蛋白Calnexin与自噬体标志蛋白LC3的共定位水平，结果显示，过表达CHOP后，两者的共定位水平降低（P<0.05，图5B）。检测两者的共定位水平结果显示，过表达CHOP后，内质网与溶酶体的共定位水平降低，自噬溶酶体的形成受阻（P<0.05，图5C）。

2.6 过表达CHOP对BRL-3A 细胞中线粒体-内质网接触位点相关蛋白及内质网与线粒体共定位的影响

Western blotting检测结果显示，与DTT组和LV-NC+DTT组比较，过表达CHOP上调了线粒体-内质网接触位点相关蛋白GRP75、IP3R1、VDAC1的表达水平（P<0.05，图6A）。双色荧光标记技术检测二者的共定位情况，结果显示，过表达CHOP增强了内质网与线粒体的接触，其共定位水平较对照组升高（P<0.05，图6B）。

2.7 过表达CHOP对BRL-3A细胞线粒体中钙离子水平的影响

免疫荧光双染检测线粒体内Ca²⁺浓度变化，结果显示，过表达CHOP提高了线粒体内Ca²⁺含量，其共定位水平较对照组明显增加，差异具有统计学意义（P<0.01，图7）。

2.8 过表达CHOP对BRL-3A细胞中线粒体膜电位水平的影响

结果显示，CHOP过表达降低了BRL-3A细胞的线粒体膜电位（P<0.01，图8）。

2.9 过表达CHOP对BRL-3A细胞中焦亡相关蛋白及线粒体中GSDMD-N蛋白水平的影响

Western blotting检测结果显示，与DTT组和LV-NC+DTT组比较，过表达CHOP上调了焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD-N和Cleaved-Caspase1的表达水平（P<0.05，图9A）。过表达CHOP后，BRL-3A细胞中GSDMD-N蛋白的绿色荧光信号与线粒体的洋红色荧光共定位明显增多，GSDMD-N在线粒体中的表达水平升高（P<0.05，图9B）。

3 讨论

肝细胞的大量死亡是引发肝组织损伤的主要原因，并且在药物性肝损伤、病毒性肝炎、酒精性及非酒精性脂肪肝等多种肝病中发挥重要作用^{［20， 21］}。持续的细胞死亡不仅会导致肝细胞数量减少，还会加重炎症反应，促进肝纤维化进展，最终可能演变为肝硬化^［22］。因此，抑制过度的肝细胞死亡已成为改善肝功能、减轻肝损害的潜在策略之一。

有研究证实，内质网功能障碍在肝细胞死亡过程中发挥了重要的调控作用^［23］。内质网自噬是近年来新发现的一种针对内质网的选择性自噬过程，该过程通过促进内质网的片段化及对特定蛋白的选择性降解，从而有助于维持内质网稳态，并促进细胞存活^［24］。细胞周期进展基因1（CCPG1）编码的CCPG1蛋白是介导内质网自噬的重要受体之一。CCPG1蛋白可通过其自身的LC3相互作用区域与自噬体膜的关键蛋白LC3发生相互作用，从而诱导自噬体膜将内质网片段选择性隔离，包裹内质网片段的自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体，最终内质网片段被酸性的溶酶体酶降解，释放出氨基酸、脂质等物质供细胞再利用^［25-27］。因此，内质网自噬在帮助细胞适应环境变化，促进细胞存活方面发挥重要作用。如果内质网自噬被阻断，应激状态下细胞稳态将难以维持，最终导致细胞死亡。本研究发现，DTT处理细胞12 h可显著上调内质网自噬相关蛋白表达，而DTT处理细胞36 h后，内质网自噬相关蛋白表达较12 h有所下降。上述结果提示，在内质网应激的早期，肝细胞通过激活内质网自噬发挥代偿作用，试图恢复细胞的稳态，随着DTT处理时间延长，内质网自噬较12 h显著降低，此时内质网稳态无法维持，肝细胞死亡进一步增加。为进一步明确内质网自噬是否在肝细胞发生内质网应激的过程中发挥代偿作用，本研究通过Hoechst/PI双染法检测了自噬抑制剂巴弗洛霉素A1对DTT诱导的细胞死亡的影响。结果显示，联合BafA1处理组的细胞死亡水平较DTT单独处理组显著升高，提示抑制自噬加剧了内质网应激诱导的细胞损伤。

有研究发现，CHOP能够在基因转录水平上抑制与自噬相关的基因表达，从而促进细胞凋亡进程^［28］。为进一步阐明内质网应激状态下，CHOP对肝细胞内质网自噬的调控作用，本研究采用ChIP实验检测CHOP在内质网自噬相关基因启动子区域的富集情况。结果表明，DTT处理细胞后CHOP在自噬基因启动子区的富集水平降低，提示在持续的内质网应激状态下CHOP可抑制内质网自噬相关基因的转录。

近年来，细胞器间的相互作用对疾病进程的影响已成为研究热点。内质网与线粒体作为细胞内最大的膜性细胞器，其外膜间距通常维持在15~20 nm。这种相对较短的距离为两种细胞器之间的功能性相互作用提供了结构基础。研究发现，内质网膜上的锚定蛋白，如IP3R1，能够与线粒体外膜上的特定蛋白，如VDAC1，发生直接的分子间相互作用。这种连接内质网与线粒体的特殊膜接触区域被称之为线粒体-内质网接触位点（MERCs），该结构在细胞器之间的Ca²⁺转运中发挥重要作用，并进一步促进了线粒体钙超载及线粒体损伤^{［29， 30］}。有研究证实，线粒体损伤与细胞焦亡之间存在着密切的关联，线粒体损伤后产生的过量活性氧可以激活NLRP3炎症小体，进而激活Caspase-1，启动焦亡，GSDMD作为细胞焦亡的关键执行蛋白，当其被Caspase-1/4/5/11切割后，释放出的N端片段（GSDMD-N）会在细胞膜上成孔，进而引发细胞裂解与促炎因子（如IL-1β、IL-18）的释放，最终完成焦亡过程^［31］。本研究发现，在持续的内质网应激过程中，线粒体-内质网接触位点相关蛋白及细胞焦亡相关蛋白的表达水平显著升高，提示在持续的内质网应激过程中，通过内质网-线粒体之间的细胞器互作，进而促进线粒体损伤并引发肝细胞焦亡可能是导致肝损伤的机制之一。

C/EBP环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白（CHOP）是ERS过程中调控细胞死亡的重要转录因子之一。课题组前期研究发现^［32］，持续时间较长的ERS可通过上调CHOP蛋白的表达，进而导致细胞凋亡的发生。此外有研究表明，CHOP不仅在细胞凋亡中发挥作用，在细胞自噬过程中也具有调控作用^［33］。研究表明，在采用氨基酸饥饿诱导小鼠胚胎成纤维细胞发生ERS的过程中，随着应激时间的延长，CHOP可通过抑制自噬溶酶体的形成，使应激状态下的细胞难以恢复稳态，从而加速细胞死亡^［34］。然而，CHOP是否通过调控内质网自噬及内质网-线粒体之间的细胞器互作，进而影响肝细胞死亡，目前尚不明确。为证实上述猜想，本研究通过慢病毒感染BRL-3A细胞过表达CHOP后发现，CHOP显著抑制内质网自噬的发生，表现为CCPG1、ATG5、ATG12蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的下降。由于完整的自噬过程包括了自噬起始、自噬体形成以及自噬溶酶体形成3个阶段，为评估内质网应激状态下肝细胞中自噬流的通畅性，本研究通过免疫荧光双染检测内质网标志蛋白Calnexin与自噬体标志蛋白LC3的共定位水平，结果显示，CHOP过表达显著降低了两者的共定位信号，提示自噬体形成受阻。在此基础上，我们进一步利用特异性细胞器荧光探针对内质网和溶酶体进行共标记，通过观察二者的共定位情况，评估包裹内质网片段的自噬溶酶体的形成。实验结果表明，CHOP过表达显著下调了肝细胞内质网与溶酶体的共定位水平。上述结果提示，CHOP可通过抑制自噬体及自噬溶酶体的形成，导致自噬过程受阻，使内质网稳态失衡并加剧细胞损伤。

为进一步探讨CHOP是否参与调控内质网与线粒体之间的细胞器互作，进而影响线粒体功能，本研究通过慢病毒感染BRL-3A细胞过表达CHOP后，采用Western blotting检测线粒体-内质网接触位点相关蛋白GRP75、IP3R1、VDAC1的表达变化，并采用共聚焦显微镜观察内质网与线粒体的共定位水平，结果显示，过表达CHOP能显著上调线粒体-内质网接触位点相关蛋白的表达并增强内质网与线粒体的共定位。此外，过表达CHOP后线粒体内的Ca²⁺水平明显升高，而线粒体膜电位水平显著降低。提示CHOP参与了内质网-线粒体之间的细胞器互作，导致通过内质网（细胞内主要的Ca²⁺储存库）向线粒体过量转运Ca²⁺。线粒体中Ca²⁺超载会导致线粒体功能障碍并触发线粒体相关的细胞死亡。

有研究发现在脓毒症小鼠模型中，PERK/ATF4/CHOP信号通路的激活触发NLRP3/Caspase-1介导的焦亡和促炎细胞因子的产生 ^［35］。说明CHOP除了在细胞凋亡过程中发挥重要作用外，还可能对细胞焦亡过程发挥调控作用。为证实这一猜想，本研究采用Western blotting检测BRL-3A细胞中焦亡相关蛋白NLRP3、Cleaved-Caspase1、GSDMD-N的表达变化，结果显示，过表达CHOP可通过上调NLRP3炎症小体、促进GSDMD剪切，进而介导肝细胞焦亡。这一发现与CHOP经典的凋亡调控功能形成机制互补——既往研究明确CHOP是内质网应激下介导肝细胞凋亡的核心分子，而本研究首次在体外细胞模型中揭示，CHOP同样参与调控肝细胞焦亡进程，二者共同构成CHOP在肝细胞应激损伤中的双重作用模式。同时，共聚焦显微镜观察GSDMD-N在线粒体中的定位情况，发现CHOP过表达可上调线粒体中GSDMD-N的水平。这提示，GSDMD-N不仅在质膜上形成孔洞，还会转移至线粒体膜，造成线粒体内外膜的通透性增加。这一过程进一步导致线粒体功能障碍，包括活性氧生成增加以及跨膜电位丧失，从而形成恶性循环。

综上所述，本研究揭示了CHOP通过抑制内质网自噬并增强内质网-线粒体互作，促进线粒体功能障碍及肝细胞焦亡的机制。此外，本研究首次在体外细胞模型中明确CHOP是连接内质网应激与肝细胞焦亡的关键节点，为内质网应激相关肝脏疾病的体外机制研究提供了新的分子靶点。通过靶向抑制CHOP的焦亡调控功能，可减轻肝细胞应激引发的炎症反应，为后续深入探究内质网应激相关肝脏疾病的干预策略奠定了体外实验基础。

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