免疫细胞表型与梅尼埃病的因果关联：一项双向双样本孟德尔随机化分析与动物实验研究

Causal associations between immune cell phenotypes and Ménière's disease: a bidirectional two-sample Mendelian randomization study and validation in mice

摘要

目的 通过孟德尔随机化与动物实验探讨731种免疫细胞表型与梅尼埃病（MD）的因果关系。 方法 基于免疫细胞表型和MD的全基因组关联研究（GWAS）数据分别为暴露因素与结局变量，主要用逆方差加权法（IVW）分析，辅以MR-Egger、加权中位数等方法，并行异质性、多效性及留一法敏感性分析。动物实验中，将30只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组及抗CD20单抗组，10只/组。采用耳后皮下注射脂多糖（LPS）制备膜迷路积水模型，抗CD20单抗组造模前尾静脉注射药物干预。通过听性脑干反应（ABR）、水迷宫及旷场实验评估小鼠听觉及前庭功能；HE染色观察内耳组织病理变化；免疫荧光检测CD19、CD27、CD3、CD39等免疫细胞标志物；qPCR、Western blotting、免疫组化检测TLR4/NF-κB通路及AQP3、ZO-1表达；ELISA检测血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平。 结果 MR分析显示，CD19⁺B细胞亚群（OR=1.123~1.204）、CD27⁺IgD⁻CD38⁺B细胞（OR=1.248，95% CI：1.096~1.421，P=8.14×10^-4）、CD3⁺T细胞亚群（OR=1.089~1.123）为主要危险因素；CD39⁺ CD4⁺ T细胞（OR=0.902，95% CI：0.838~0.972，P=6.46×10^-3）为核心保护因素，敏感性分析提示结果稳健。且不存在异质性或水平多效性（P<0.05）或反向因果关系。动物实验中，模型组小鼠表现出明显听觉及前庭功能障碍；内耳膜迷路扩张积水；耳蜗组织中CD19、CD27、CD3表达增多，CD39、AQP3、ZO-1表达减少；TLR4/NF-κB通路激活，血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高（P<0.05）。抗CD20单抗组上述异常得到改善。 结论 MR分析与动物实验均证实免疫细胞表型异常与MD存在因果关联，B细胞异常活化介导的免疫失衡是MD的重要因素，其通过激活TLR4/NF-κB通路，引发内耳炎症，下调AQP3、ZO-1表达，致水液代谢及屏障功能异常，导致听觉与前庭功能损伤；抗CD20单抗通过耗竭异常活化B细胞，逆转免疫失衡及下游分子通路异常，改善MD小鼠病理损伤与功能障碍，为MD免疫靶向治疗提供新依据。

Abstract

Objective To explore the causal relationship between 731 immune cell phenotypes and Ménière's disease (MD) using Mendelian randomization (MR) analysis and experimental validation in mice. Methods Based on GWAS data and with immune cell phenotypes and MD as the exposure and outcome variables respectively, we conducted MR analysis using inverse variance weighting (IVW) supplemented by MR-Egger and weighted median methods. Heterogeneity, pleiotropy and leave-one-out sensitivity analyses were performed. Thirty C57BL/6 mice were randomly divided into control, model and anti-CD20 mAb groups, and in the latter two groups, endolymphatic hydrops models were established by LPS injection behind the ear; treatment with the anti-CD20 mAb was administered via tail vein injection before modeling. Auditory and vestibular functions of the mice were evaluated by auditory brainstem response (ABR), water maze and open field tests. HE staining, immunofluorescence, qPCR, Western blotting, immunohistochemistry and ELISA were used to examine inner ear pathology, expressions of immune markers, TLR4/NF-κB pathway, AQP3, and ZO-1, and serum levels of inflammatory factors. Results MR analysis identified CD19⁺B cells, CD27⁺IgD⁻CD38⁺B cells and CD3⁺T cells as the major risk factors, and CD39⁺CD4⁺T cells as the core protective factor. Sensitivity analysis confirmed robustness of the results without heterogeneity, pleiotropy or reverse causality. The mouse models of endolymphatic hydrops showed obvious auditory/vestibular dysfunction, endolymphatic hydrops, upregulated CD19, CD27 and CD3 expressions, downregulated CD39, AQP3 and ZO-1 expressions, activated TLR4/NF-κB pathway, and elevated serum levels of inflammatory factors. All these abnormalities were significantly improved in anti-CD20 mAb treatment group. Conclusion Immune cell phenotype abnormality is causally associated with MD, and B cell activation-mediated immune imbalance contributes to MD via the TLR4/NF-κB pathway, inducing inner ear inflammation and abnormal fluid/barrier function. Anti-CD20 mAb ameliorates MD pathology and dysfunction by depleting activated B cells, which provides new evidence for MD immunotherapy.

Graphical abstract

关键词

免疫细胞表型 / 梅尼埃病 / 孟德尔随机化 / 因果关联

Key words

immune cell phenotype / Ménière's disease / Mendelian randomization / causal association

梅尼埃病（MD）是一种以膜迷路积水为核心病理特征的内耳疑难病。因其频繁眩晕发作、渐进性听力丧失、耳鸣及耳闷胀感，严重影响患者生活质量与心理健康^{［1， 2］}。全球该病患病率10~150/10万人，我国患者群体已超千万例，年均医疗支出可达普通人群的3~5倍^［3］。临床治疗以倍他司汀联合糖皮质激素对症缓解症状为主，但难以实现病因性根治^{［4， 5］}。难治性病例手术治疗虽有一定效果，但手术成本高且术后易引发感音神经性耳聋^{［6， 7］}。MD发病机制复杂，具体调控网络尚未完全明确，目前认为与遗传易感性^［8］、免疫炎症反应^［9］、内耳水液代谢紊乱^［10］等多种因素相关。近年来，免疫功能紊乱在MD发病中的作用备受关注，临床研究发现MD患者外周血及内耳组织中存在免疫细胞亚群失衡、自身抗体阳性及炎症因子异常升高现象，提示免疫细胞表型异常可能是MD发生发展的关键驱动因素^［11］。免疫细胞作为机体免疫应答的核心执行者，其亚群组成及功能状态直接影响局部微环境稳态。B细胞通过分泌抗体、呈递抗原参与体液免疫调控，T细胞亚群则主导细胞免疫及免疫耐受维持。然而，现有研究多聚焦于单一免疫细胞或因子与MD的相关性分析，缺乏对多种免疫细胞表型与MD因果关联的系统探究^{［12， 13］}，且免疫紊乱如何具体介导膜迷路积水及内耳功能损伤的机制仍不明确。此外，针对MD免疫病理机制的靶向治疗手段有限，临床亟需明确有效治疗靶点以改善患者预后。

孟德尔随机化（MR）是一种用于流行病学研究的数据分析技术^［14］，该技术使用与暴露因子密切相关的遗传变异作为工具变量（IV）来评估暴露因子和结局之间的因果关系^［15］。其核心优势可有效规避观察性研究中的混杂偏倚与反向因果问题，为揭示暴露因素与疾病的因果关系提供强有力证据^［16］。本研究基于全基因组关联研究（GWAS）数据，采用MR方法系统分析免疫细胞表型与MD的因果关系；结合动物实验进一步探讨免疫细胞表型和MD的关系，旨在揭示MD的免疫调控机制，为疾病的早期预警及靶向治疗提供新的理论依据与实验支撑。

1 材料和方法

1.1 研究设计

MR总体设计（图1）。为保证MR结果的可靠性须满足3个核心假设^［17］：关联性假设，即选定的工具变量必须与暴露因素显著相关。独立性假设，即工具变量必须与可能影响暴露或结局的潜在混杂因素无显著相关性。排他性假设，即工具变量只能通过“工具变量→暴露→结局”这一条路径对结局产生影响。

1.2 资料来源

731个免疫细胞表型数据来自其基因组关联研究（GWAS）数据（PMID32929287），并涵盖了3757人的信息，提供了全面的免疫特征数据。MD的GWAS数据，来自已发表的欧洲人群数据（PMID34594039），涵盖了大规模的样本和丰富的单核苷酸多态性信息。数据在进行研究前经过了严格的筛选和处理，保证数据的质量和可靠性。

1.3 研究方法

本研究的工具变量SNP的筛选标准如下：暴露GWAS中SNP的P<1×10^-5作为筛选条件；排除了处于连锁不平衡（r² <0.001的SNP，且每2个基因之间的物理距离>10 000 kb）的SNP。然后，再根据筛选出的SNP提取结局GWAS数据。同时，计算F统计量以评估弱工具变量偏倚。当F<10时，提示所使用的遗传变异是弱工具变量，可能对结果产生一定偏倚，进而将其剔除，避免对结果造成影响。F统计量具体计算公式如下：F=beta²/se²，其中，beta为等位基因效应值，se为等位基因标准误。此外，研究还去除MAF小于0.01以及对结果解释大于暴露的SNP，以满足MR的假设。

1.4 统计学分析

1.4.1 双向两样本孟德尔随机化分析

采用多种两样本MR方法评估免疫细胞对MD发病影响的因果效应，包括：逆方差加权法（IVW）、MR-Egger法、加权中位数法、简单模式、加权模式。有研究表明^［18］，IVW方法在某些条件下比其他方法略强；其特点是回归时不考虑截距项的存在，并且用结局方差的倒数作为权重来进行拟合。因此，在没有多效性存在的情况下，无论有无异质性存在，本研究均以IVW法作为主要的MR分析法，其他四种方法作为补充（异质性存在时采用IVW随机效应模型）。当多效性存在时，再使用MR-Egger法计算结果。最后采用TwoSampleMR包自带的Steiger方向性检验判断因果的方向。

1.4.2 敏感性分析

为了验证MR分析结果的可靠性，本研究采用了异质性检验、多效性检验和逐个剔除检验等多种方法对分析结果进行敏感性分析，具体如下：异质性检验：采用Cochran Q检验评估各个SNP估计值之间的异质性，Cochran Q检验具有统计学意义，则证明分析结果具有显著异质性。使用IVW的Cochran Q检验作为异质性检验结果，高度异质性的结果采用IVW的随机效应模型评估因果效应大小。多效性检验：采用MR-Egger方法对工具变量进行多效性检验。如果MR-Egger's截距的P<0.05，则表明遗传变异存在显著的水平多效性。逐个剔除（leave-one-out）检验：通过逐次剔除单个SNP计算剩下工具变量的MR结果，以评估该SNP是否影响免疫细胞表型和MD之间的关联。若剔除某个工具变量后的MR效应估计和合计效应估计结果差异较大，说明MR效应估计结果对该SNP敏感。

所有数据计算和统计分析均使用R编程（https：//www.r-projec t.org/4.3.1版本）进行，采用TwoSampleMR包开展MR分析，应用Cochran Q检验与leave-one-out分析方法评估结果的稳健性和可靠性，采用MR-Egger截距法开展遗传多效性检验，应用TwoSampleMR包自带的Steiger方向性检验判断因果的方向。在进行暴露对结局的MR分析时，采用评价指标为比值比（OR）和95%置信区间（CI）。所有的统计P值均为双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.5 动物实验

1.5.1 主要试剂与仪器

主要试剂包括：TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；CD19、CD27、CD3、CD39、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB、AQP3、ZO-1一抗、抗荧光淬灭封片剂（含DAPI）（Servicebio）；抗CD20单克隆抗体及其同型对照抗体IgG2c（BioXcell）；脂多糖（上海源叶生物科技有限公司，S11060）戊巴比妥钠（Sigma）。

主要仪器包括：酶标仪（伯腾）；石蜡包埋机、生物组织冷冻台（金华市益迪医疗设备）；切片机（徕卡）；自动脱水机（HESTION）；成像系统（尼康）；常温离心机（湘潭湘仪仪器有限公司）；蛋白电泳仪及转膜仪（上海天能）；实时荧光定量 PCR 仪（赛默飞）；M8数字切片扫描成像系统（Precipoint），光谱型激光扫描共聚焦显微镜系统（FV10i）；动物运动轨迹跟踪系统（北京诺达思信息技术有限责任公司）。

1.5.2 实验动物

8周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠30只（体质量18~25 g），由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物质量许可证号：［SCXK（辽）2020-0001］。动物饲养于辽宁中医药大学实验动物中心，室温22±4 ℃，相对湿度50%±10%，明暗循环时间12 h/12 h，自由饮食饮水。本实验经辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：21000062024144）。

1.5.3 动物实验分组及干预方法

将30只8周龄雄性SPF级C57BL/6小鼠（体质量18~25 g）采用随机数字表法平均分为对照组（Control）、模型组（Model）、抗CD20单抗组（Anti-CD20 mAb），10只/组。模型组采用耳后皮下注射脂多糖（LPS）法制备MD膜迷路积水小鼠模型^［19］：将LPS溶于PBS配制成1 mg/kg浓度，每侧耳后皮下注射50 μL，连续注射3 d；抗CD20单抗组造模方法同模型组，于造模前48 h给予抗CD20单抗尾静脉注射（抗体浓度0.5 mg/mL，注射体积250 μL，单只剂量250 μg）。对照组在相同时间点、以相同方式耳后皮下注射等量PBS，同时尾静脉注射等量同型对照抗体IgG2c。所有小鼠造模及干预结束后，继续常规饲养1周，随后依次进行听觉脑干反应（ABR）检测及行为学测试（Morris水迷宫实验、旷场实验）。实验结束后，实验小鼠禁食但不禁水12 h，采用腹腔注射戊巴比妥钠法（10 mg/mL，50 mg/kg）进行麻醉处理，眼球摘除采取血液样本并分离血清。取小鼠耳蜗，使用4%多聚甲醛固定液固定，用于病理学检测。

1.5.4 听性脑干反应（ABR）检测

于造模及干预结束后，评估各组小鼠听觉功能。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液（10 mg/mL，50 mg/kg）麻醉后，俯卧固定于隔音屏蔽箱内，安置电极：记录电极插入颅顶正中皮下，参考电极插入双侧耳廓背面靠近乳突处，接地电极插入鼻尖皮下。刺激声为短声（click），带通滤波设置为100~3000 Hz，重复率11次/s，叠加1024次，扫描时程10 ms。在8 kHz测试频率下，以Ⅲ波的出现或消失为听阈判断标准^［20］。

1.5.5 行为学检测

1.5.5.1　旷场实验

采用旷场实验对小鼠的眩晕程度进行测评。将小鼠置于旷场箱（40 cm×100 cm×100 cm）中央区域，摄像机位于旷场箱中央上方200 cm，记录5 min内小鼠的运动轨迹总长度及活动参数。实验期间保持环境安静、光线柔和，每只小鼠实验后清理箱内排泄物，避免交叉干扰。使用EthoVisionXT17行为学软件对采集数据进行分析。

1.5.5.2　Morris 水迷宫实验

采用Morris水迷宫对小鼠的眩晕程度进行测评。实验所用装置为圆形水池，控制水温在（23±2）℃。水池中央正上方200 cm处架设摄像机，实时捕捉小鼠的行为轨迹，并记录2 min内小鼠爬上平台的时间（LP）、爬上平台前总距离（DP）。对小鼠进行为期3d的空间记忆训练，将小鼠面向池壁分别从4个象限中点放入水中，记录LP。若小鼠入水后2 min内未能找到平台，需将其引导至平台上，并停留15 s，此时记录时间为120 s；每个象限训练时间间隔为5 min。单次训练后将小鼠重新放回饲养笼。使用EthoVisionXT17行为学软件对采集数据进行分析。

1.5.6 组织病理检测

取固定后的耳蜗组织，依次进行脱水、石蜡包埋。以5 μm厚度连续切片，经二甲苯脱蜡、水化后，进行苏木精染色，伊红复染2 min。切片再经脱水透明，中性树胶封片，于M8数字切片扫描成像系统下观察内耳蜗轴、前庭器等结构的组织形态。

1.5.7 免疫荧光法检测

取耳蜗组织石蜡切片，经脱蜡、水化及PBS漂洗后，采用柠檬酸钠缓冲液进行微波抗原修复，5%山羊血清封闭1 h后滴加一抗（CD19 1∶200、CD27 1∶500、CD3 1∶300、CD39 1∶400），4 ℃湿盒孵育过夜。PBS清洗后滴加相应荧光二抗（1∶400），室温避光孵育1 h。采用抗荧光淬灭剂封片。于光谱型激光扫描共聚焦显微镜系统下观察，采用ImageJ软件分析CD19、CD27、CD3、CD39的荧光强度。

1.5.8 实时荧光定量PCR法检测

取50 mg耳蜗组织，经TRIZOL裂解、氯仿萃取、异丙醇沉淀、75%乙醇洗涤提取总RNA，检测RNA浓度及纯度^［15］，以总RNA为模板反转录为cDNA。以cDNA为模板，扩增目的基因TLR4、NF-κB、AQP3、ZO-1。扩增条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15s、60℃ 60 s 延伸60 s，40个循环。以GAPDH为内参，2^-ΔΔCt法计算TLR4、NF-κB、AQP3、ZO-1 mRNA的相对表达量。引物序列（表1）。

1.5.9 Western blotting检测

取50 mg耳蜗组织，加入500 μL RIPA裂解液，于冰浴条件下进行研磨，裂解30 min，4 ℃、3000 r/min，离心15 min，取上清液为总蛋白。BCA法检测蛋白浓度，5×上样缓冲液，95 ℃变性8 min。冷却后，总蛋白经SDS-PAGE电泳分离后，在恒流200 mA条件下，通过湿转法转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗TLR4（1∶1000）、NF-κB p65（1∶1000）、p-NF-κB（1∶1000）、AQP3（1∶1000）、ZO-1（1∶1000）、GAPDH（1∶3000）4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，10 min/次，加入稀释度为1∶3000的二抗室温孵育1 h，TBST洗涤3次，10 min/次。使用ECL发光液进行显影，采集条带，Image J进行分析，目的蛋白的相对表达量为其灰度值与内参蛋白GAPDH灰度值的比值，p-NF-κB/NF-κB的比值作为NF-κB的磷酸化程度。

1.5.10 免疫组化法检测

取耳蜗组织石蜡切片，经脱蜡、水化及PBS漂洗后，采用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，自然冷却。滴加 3% H₂O₂室温孵育15 min以阻断内源性过氧化物酶活性，5%山羊血清封闭 30 min。滴加一抗AQP3（1∶200）、ZO-1（1∶200），4 ℃湿盒孵育过夜。次日PBS清洗后滴加HRP标记二抗（1∶200），37 ℃孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片。于M8数字切片扫描成像系统下观察并采集图像，采用ImageJ软件分析AQP3与ZO-1蛋白在内耳组织中的表达水平。

1.5.11 ELISA检测小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β表达

小鼠血液样本经离心（3000 r/min，4 ℃，15 min）分离血清，严格按照TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪测定各孔吸光度A_{450 nm}。根据标准曲线计算血清中各炎症因子的含量。

1.5.12 统计学分析

采用 GraphPad Prism10.1软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，所有数据均行正态性及方差齐性检验，满足正态分布。多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两比较采用LSD检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫细胞与梅尼埃病之间的关系

2.1.1 正向工具变量

本研究对731种免疫细胞表型的GWAS数据进行了IVs筛选，所有IVs的F值均大于10，且不存在微弱的工具变量偏倚。所有阳性结果筛选的SNP数量（表2）。

2.1.2 免疫细胞对梅尼埃的影响

IVW分析结果（图2）表明，44种免疫细胞表型与MD存在显著因果关联（P<0.05），其中23种为风险因素（OR>1），21种为保护因素（OR<1）。包含B细胞组9种、T细胞成熟阶段组13种、调节性T细胞组3种、TBNK组9种、髓系细胞组4种和常规树突状细胞（CDC）组6种。

B细胞相关表型中多项呈现显著因果关联，其中CD19在4类B细胞亚群的表达均为风险因素（OR=1.123~1.204），CD27⁺IgD⁻CD38⁺B细胞（OR=1.248，95% CI：1.096~1.421，P=8.14e-04）为最强风险因素。T细胞相关表型为本研究中关联最多的类别，其中CD3⁺T细胞亚群（OR=1.089~1.123）等为核心风险因素，CD39⁺ CD4⁺ T细胞（OR=0.902，95% CI：0.838~0.972，P=6.46e-03）等为核心保护因素。整体提示B细胞异常活化是MD的核心免疫风险驱动因素，T细胞表型失衡参与疾病调控。

2.1.3 正向敏感性分析

敏感性分析结果显示，绝大多数用于MD的MR分析的免疫细胞表型不存在显著异质性（q检验为P>0.05）与水平多效性（MR-Egger's intercept法为P>0.05），逐一剔除分析后效应量和显著性未发生明显波动，表明结果稳健，未受单个遗传工具变量驱动影响（表3）。

2.1.4 反向工具变量

本研究将与MD强关联的 SNP 用作暴露因子，将正向MR分析获得的44种免疫细胞表型作为结局变量，进行了反向MR分析。

2.1.5 梅尼埃对免疫细胞的影响

根据现有数据，筛选条件为P<0.05，未发现免疫细胞表型显著与MD正相关或负相关。

2.2 MD模型的建立及免疫炎症变化

2.2.1 听觉功能变化

ABR检测结果显示，与对照组相比，模型组小鼠ABR阈值显著升高（P<0.05）；与模型组相比，抗CD20单抗组小鼠ABR阈值明显降低（P<0.05，图3）。

2.2.2 前庭功能变化

旷场实验：与对照组相比，模型组小鼠总运动距离显著减少，自发活动时间显著减少（P<0.05）；与模型组相比，抗CD20单抗组小鼠总运动距离增加，自发活动时间增加（P<0.05，图4）。

Morris水迷宫实验：小鼠在经过3 d训练后，LP逐渐减少；与对照组相比，模型组小鼠LP与DP均增加（P<0.05）；与模型组相比，抗CD20单抗组小鼠LP与DP均明显减少（P<0.05，图5）。

2.2.3 组织病理学变化

HE染色结果显示，对照组的耳蜗中阶形态结构保持正常，前庭膜平坦无形变，细胞排列均匀整齐，这表明耳蜗内部结构未受到任何损伤或干扰。与对照组相比，模型组的耳蜗中阶出现了明显的形态结构变化，前庭膜向前庭阶方向膨出或甚至断裂。前庭膜厚度不均，局部上皮细胞层增厚且基底膜胶原纤维排列紊乱，前庭阶及鼓阶间质水肿，HE染色呈淡粉染疏松区域，并伴有大量炎性细胞浸润。

与模型组相比，抗CD20单抗组的前庭膜虽然也出现了变形，但其膨出程度大大减轻，炎性浸润减轻（图6）。

2.2.4 各组小鼠耳蜗组织CD19、CD27、CD3、CD39平均荧光强度变化

免疫荧光结果显示，与对照组相比，模型组小鼠内耳组织中 CD19、CD27、CD3平均荧光强度显著升高，CD39平均荧光强度显著降低（P<0.05），与MR分析结论完全一致；与模型组相比，抗CD20单抗组小鼠CD19、CD27、CD3平均荧光强度明显降低，CD39平均荧光强度明显升高（P<0.05，图7）。

2.2.5 抗CD20单抗对MD模型小鼠TLR4/NF-κB通路及AQP3、ZO-1表达的影响

qPCR结果显示，与对照组相比，模型组小鼠TLR4、NF-κB的mRNA表达量显著升高（P<0.05），AQP3、ZO-1的mRNA表达量显著降低（P<0.05）；与模型组相比，抗CD20单抗组小鼠TLR4、NF-κB的mRNA表达量明显降低，AQP3、ZO-1的mRNA表达量明显升高（P<0.05，图8）。

Western blotting结果与mRNA表达趋势一致，与对照组相比，模型组小鼠TLR4的蛋白表达及p-NF-κB/NF-κB比值升高（P<0.05），AQP3、ZO-1的蛋白表达降低（P<0.05）；与模型组相比，抗CD20单抗组小鼠TLR4的蛋白表达及p-NF-κB/NF-κB比值明显降低（P<0.05），AQP3、ZO-1的蛋白表达明显升高（P<0.05，图9）。

免疫组化结果在qPCR、Western blotting基础上，补充空间定位证据，AQP3主要表达于小鼠耳蜗血管纹、螺旋韧带及螺旋神经节区域，ZO-1主要表达于耳蜗血管纹内皮细胞及基底膜区域。与对照组相比，模型组小鼠上述部位AQP3、ZO-1阳性表达降低（P<0.05），提示内淋巴积水状态下内耳水通道蛋白表达显著下调、内耳血-迷路屏障完整性受损；与模型组相比，抗CD20单抗组小鼠内耳损伤部位AQP3、ZO-1表达明显升高，内耳水液代谢、屏障结构相关蛋白表达得到明显恢复，说明干预的有效性（P<0.05，图10）。

2.2.6 各组小鼠耳蜗组织TNF-α、IL-6、IL-1β水平变化

ELISA检测结果显示，与对照组相比，模型组小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β浓度升高（P<0.05）；与模型组相比，抗CD20单抗组小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显下降（P<0.05，图11）。

3 讨论

MR分析以遗传变异为工具变量，整合GWAS汇总数据，可有效降低混杂因素干扰，是推断暴露因素与疾病间因果关系的可靠方法^［21］，为探究免疫细胞表型与MD的关联机制提供了关键技术支撑。本研究通过MR分析发现44种免疫细胞表型中，23种风险因素，21种保护因素，直接揭示免疫细胞表型与MD的因果关系。其中，B细胞相关表型与MD的关联最为显著，是MD发病的核心免疫影响因素，这与既往研究发现B细胞异常活化可通过分泌自身抗体、释放炎症因子参与内耳免疫损伤的结论一致^［22］。B细胞表面功能分子CD19、CD27的异常高表达均为MD的重要危险因素，且CD27⁺IgD⁻CD38⁺B细胞的表达为本研究中关联度最高的表型（OR=1.248，95% CI：1.096~1.421，P=8.14×10^-4），CD19在B细胞的表达也呈强关联（OR=1.123~1.204），提示B细胞亚群失衡是MD免疫紊乱的重要特征。CD19作为B细胞活化的核心共刺激分子，其高表达可促进B细胞增殖、活化并分泌自身抗体，引发异常体液免疫应答^［23］；CD27是记忆B细胞的特异性标志物，其在IgD^-CD38⁺ B细胞高表达提示记忆B细胞异常活化，可导致内耳组织发生持续性、不可逆的免疫炎症损伤^［24］。这一结果明确了B细胞异常活化及其表面功能分子的异常表达是MD免疫病理过程的核心环节，也为后续动物实验选择抗CD20单抗靶向干预B细胞提供了直接的遗传学依据。T细胞亚群及表面分子表型亦与MD存在密切因果关联，其中CD39⁺CD4⁺ T细胞为核心保护因素（OR=0.902，95% CI：0.838~0.972，P=6.46×10^-3），而CD3（OR=1.089~1.123）等T细胞表面分子为危险因素。CD39作为T细胞表面的关键免疫抑制分子，可通过水解腺苷三磷酸调节免疫微环境，抑制效应T细胞活化，维持免疫耐受^［25］；CD39⁺CD4⁺ T细胞的保护作用提示，其免疫抑制功能缺陷可能致MD患者内耳免疫微环境失衡，加重炎症反应。而CD3的异常表达则可促进T细胞活化、分化，进一步调控B细胞的异常增殖，形成恶性循环，共同参与MD的发病过程^［26］。

基于MR分析揭示B细胞表型与MD的密切关联，为进一步验证MD模型中免疫细胞及炎症变化情况，本研究采用耳后皮下注射LPS建立膜迷路积水小鼠模型，采用抗CD20单抗靶向干预B细胞^［27］，验证其免疫调控机制。模型组小鼠出现明显的听觉及前庭功能障碍，耳蜗组织呈现膜迷路积水、前庭膜扩张，印证了模型构建的有效性。且耳蜗中CD19、CD27、CD3表达显著上调，CD39表达显著下调，与MR分析结论一致，证实MD膜迷路积水状态与免疫细胞表型异常存在因果关联。而抗CD20单抗干预后，小鼠的听觉阈值显著降低，眩晕行为学指标明显改善，耳蜗膜迷路积水病理损伤减轻，同时核心免疫分子的异常表达得到显著逆转，直接验证了MR分析的因果结论，证实靶向抑制B细胞活化可有效改善MD的病理生理和功能异常，为抗CD20单抗作为MD免疫靶向治疗药物提供了实验依据。

为进一步阐明抗CD20单抗干预MD的分子机制，本研究围绕TLR4/NF-κB炎症通路、水液代谢及内耳屏障功能展开探究，结果显示TLR4/NF-κB通路的异常激活是连接B细胞异常活化与MD膜迷路积水的关键桥梁。模型组小鼠耳蜗组织中TLR4/NF-κB通路相关分子表达显著升高，血清TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子水平明显增加，提示B细胞异常活化可通过激活内耳TLR4/NF-κB炎症通路，引发持续性的免疫炎症反应^［28］；同时AQP3、ZO-1表达显著降低，AQP3作为内耳重要的水通道蛋白，其表达异常可导致内淋巴液重吸收障碍^［29］，ZO-1作为紧密连接核心蛋白，其低表达可破坏内耳屏障完整性^［30］，二者共同作用导致内淋巴液蓄积，最终形成膜迷路积水。免疫组化结果进一步证实，AQP3、ZO-1的表达异常主要发生于内耳水代谢与屏障功能的关键部位。抗CD20单抗通过靶向耗竭异常活化的B细胞，有效抑制了TLR4/NF-κB炎症通路的激活，减少了促炎因子的释放，从而减轻内耳免疫炎症损伤；同时逆转了AQP3、ZO-1的异常表达，恢复了内耳水液代谢平衡和屏障完整性，促进内淋巴液正常重吸收，最终缓解膜迷路积水，改善小鼠的听觉和前庭功能。这一结果揭示了MD免疫发病新机制，明确了抗CD20单抗干预的分子靶点和作用路径。

既往已有研究探讨了免疫细胞表型与MD间的因果关系^［31］，本研究与之相比，二者在表型数量、分型分布及部分风险/保护属性上存在差异，但核心结论高度一致。分型分布上，本研究在T细胞成熟阶段组、髓系细胞组、cDC组鉴定出更多表型，而既往研究在B细胞组、Treg组表型数量更具优势；风险/保护属性方面，两项研究均证实 CD39⁺CD4⁺T细胞、CD127⁺CD28⁻CD8⁺T细胞为核心保护性表型，CD27⁺IgD⁻CD38⁺B细胞、CD3⁺效应记忆 CD8⁺T细胞、CD45RA⁻CD4⁺T细胞为关键风险性表型，且反向MR分析均证实免疫细胞表型失衡是MD的病因学因素，而非疾病继发结果。上述差异的核心原因在于研究设计的细微不同：样本特征上，本研究采用广泛欧洲人群数据，而既往研究聚焦遗传背景更均一的撒丁岛人群，导致部分低频关联表型未被检出，这是其鉴定表型总数少于本研究的重要原因；而本研究的人群异质性更高，能检测到更多与MD相关的免疫细胞表型。工具变量筛选中，既往研究额外排除了自身免疫病相关混杂SNP，虽降低偏倚但可能剔除了MD免疫机制相关重叠靶点，而本研究仅排除与MD直接相关的混杂因素，保留了更多潜在关联SNP，使得鉴定的表型范围更广泛。统计方法上，既往研究采用FDR校正使结果更保守，本研究未进行额外多重检验校正，更易检测到弱关联表型，但可能存在轻微假阳性风险，需结合动物实验进一步验证。本研究的核心创新点在于将MR分析与动物实验有机结合：通过MR分析从遗传学层面明确了免疫细胞表型与MD的因果关联，筛选出B、T细胞等关键免疫靶点；进而通过动物实验验证了这些靶点的病理意义，并证实了靶向干预有效性，形成 “遗传学筛选－实验验证－机制解析” 的完整研究链条，弥补了既往研究仅遗传学分析、缺乏实验验证的局限性，同时通过与同类研究的横向对比，提炼出共识性核心靶点，为MD的免疫发病机制提供了更全面的循证依据。

尽管本研究取得了重要发现，但仍存在一定局限性：首先，MR分析采用的 GWAS数据均来自欧洲人群，而免疫细胞表型的遗传特征与疾病关联存在种族差异^［32］，导致结果对中国人群的直接指导价值受限。未来需优先构建中国人群相关GWAS数据库，或纳入亚洲人群数据进行验证，以提高结果的普适性。其次，缺乏部分核心靶点验证，未来将开展CD39过表达、CD27基因敲除小鼠构建等实验，通过单独靶向调控核心靶点，直接证实CD39⁺T细胞的保护作用及CD27⁺B细胞等的致病作用。最后，本研究采用C57BL/6小鼠构建MD模型验证MR结果，但小鼠与人类在内耳解剖、免疫谱、炎症反应及疾病相关遗传和环境因素上存在种属差异，缺乏临床样本直接验证，研究结论的临床转化依据不足。不过小鼠模型可避免人体有创操作、符合伦理，且实验周期短、遗传背景均一，便于快速验证因果关系与深入解析分子机制，是临床研究难以替代的重要环节。未来将联合临床开展前瞻性队列研究，通过流式细胞术、ELISA检测核心免疫细胞比例及炎症因子水平，并通过单细胞RNA测序精细解析免疫细胞亚群的组成，分析其与疾病严重程度及预后的相关性；收集术中内耳组织样本验证核心靶点表达，实现“MR分析-动物实验-临床样本”的三级验证。

综上所述，本研究通过 MR分析与动物实验证实了免疫细胞表型与MD存在因果关联，B细胞异常活化介导的免疫失衡是MD发病的关键因素，其通过激活TLR4/NF-κB炎症通路，引发内耳炎症损伤，导致水液代谢及屏障功能异常，最终形成膜迷路积水。抗CD20单抗可通过靶向耗竭异常活化的B细胞，逆转免疫细胞表型失衡，抑制TLR4/NF-κB通路激活，改善MD小鼠的病理损伤和功能障碍，为MD的免疫靶向治疗提供了新的理论依据和实验支撑。

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