丁香酸甲酯通过抑制MAPK通路调控肠上皮细胞凋亡减轻葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎

Methyl syringate alleviates DSS-induced colitis in mice by suppressing intestinal epithelial cell apoptosis via inhibiting the MAPK signaling pathway

摘要

目的 探讨丁香酸甲酯（MS）对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎的保护作用及机制。 方法 将24只C57BL/6小鼠随机分为对照组（Con组）、造模组（DSS组）、药物处理组（MS组，100 mg/kg），8只/组。通过检测小鼠体质量、疾病活动度（DAI）评分、结肠长度、HE与AB-PAS染色及组织学评分，评估MS对结肠炎的治疗效果。采用ELISA和RT-qPCR检测结肠炎症因子IL-6、TNF-α和IL-10的表达，免疫组化检测髓过氧化物酶（MPO）在结肠组织中的表达，免疫荧光和Western blotting检测紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1的表达与分布，TUNEL染色检测结肠凋亡细胞。体外采用1% DSS诱导NCM460细胞构建凋亡模型，给予MS（50 μmol/L）干预后，通过流式细胞术检测细胞凋亡。采用网络药理学预测和Western blotting检测分析MS的作用机制。 结果 MS处理改善了DSS引起的小鼠体质量下降、结肠缩短、DAI评分和组织学评分升高，减轻肠绒毛结构损伤，增加杯状细胞数量（P<0.05）。同时MS可下调小鼠肠黏膜组织中IL-6、TNF-α和MPO的表达，并上调IL-10的表达（P<0.05）。免疫荧光与Western blotting表明MS可恢复紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1的表达与分布。TUNEL、流式细胞术及Western blotting结果一致表明，MS在体内外均能显著降低肠上皮细胞的凋亡比例，上调抗凋亡蛋白Bcl-2和XIAP，下调促凋亡蛋白C-Caspase3（P<0.05）。KEGG富集分析提示MAPK通路可能与MS疗效相关。Western blotting进一步证实MS能抑制体内外模型中p-JNK、p-ERK、p-p38的磷酸化水平（P<0.05）。 结论 MS通过减少肠上皮细胞凋亡和改善肠屏障损伤来缓解DSS诱导的小鼠结肠炎，其机制可能与抑制MAPK信号通路的表达有关。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of methyl syringate (MS) against dextran sodium sulfate (DSS)‑induced colitis in mice and the underlying mechanism. Methods Twenty-four C57BL/6 mice were random and equally into control group, DSS model group, and MS (100 mg/kg) treatment group. The therapeutic effect of MS on colitis was assessed by measuring changes in body weight, disease activity index (DAI) score and colon length and histopathological examinations with HE and AB-PAS staining. ELISA and RT-qPCR were used to detect the expressions of IL-6, TNF-α, and IL-10 in the colon tissue, and immunohistochemistry, immunofluorescence staining, Western blotting and TUNEL staining were used to detect the expressions of myeloperoxidase (MPO), tight junction proteins ZO-1 and claudin-1, and MAPK pathway proteins as well as cell apoptosis in the colon. In cultured NCM460 cells treated with 1% DSS, the effects of MS (50 μmol/L) treatment on cell apoptosis and expressions of poptosis-related proteins and MAPK pathway proteins were evaluated using flow cytometry and Western blotting. Results MS treatment significantly ameliorated DSS-induced body weight loss, colon shortening, increased DAI score and histological inflammation score, and intestinal pathologies in mice. MS downregulated IL-6, TNF-α, and MPO, upregulated IL-10, and restored the expression and distribution of ZO-1 and claudin-1 in the colon tissue of the mice. In the mouse and cell models, MS treatment significantly reduced apoptosis rate of intestinal epithelial cells, upregulated Bcl-2 and XIAP, and downregulated cleaved caspase-3 expressions. KEGG enrichment analysis suggested a possible association of MAPK pathway with the therapeutic effect of MS, which was confirmed by lowered phosphorylation levels of p-JNK, p-ERK, and p-p38 in both the MS-treated mouse and cell models. Conclusion MS alleviates DSS-induced colitis in mice by reducing intestinal epithelial cell apoptosis and improving intestinal barrier damage possibly by inhibiting the MAPK signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

炎症性肠病 / 丁香酸甲酯 / 凋亡 / 肠屏障 / MAPK通路

Key words

inflammatory bowel disease / methyl syringate / apoptosis / intestinal barrier / MAPK signaling pathway

炎症性肠病（IBD）是一类以慢性、复发性肠道炎症为特征的特发性疾病，分为溃疡性结肠炎和克罗恩病，其发病率在全球范围内呈上升趋势，严重损害患者生活质量^［1-3］。目前，IBD的病因尚未完全阐明，临床治疗主要以抑制异常免疫反应和控制炎症为核心^［4-6］。常规药物如5-氨基水杨酸类、糖皮质激素和免疫抑制剂等虽能一定程度缓解症状，但存在疗效不稳定、不良反应明显、易复发等局限^［7-9］。因此寻找安全有效的新型治疗策略是该领域的重要方向。研究表明，肠上皮细胞过度凋亡是IBD肠道黏膜屏障损伤的核心机制之一^［10］。在炎症微环境中，多种刺激因素可激活细胞内凋亡信号通路，导致上皮细胞过早、过量死亡，紧密连接结构破坏，肠黏膜通透性增加，从而促进细菌及抗原易位，进一步放大炎症反应，形成“炎症-屏障损伤-炎症加重”的恶性循环^{［11， 12］}。因此，靶向抑制肠上皮细胞异常凋亡、修复上皮屏障功能，成为阻断IBD进展的重要策略。在IBD患者肠道组织及实验性结肠炎模型中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路常被多种炎性介质激活，其磷酸化产物p-JNK、p-ERK及p-p38可通过调控下游转录因子，促进TNF-α、IL-6等促炎因子表达，并诱导肠上皮细胞凋亡^{［13， 14］}。抑制MAPK通路活化能显著减轻肠道炎症、减少上皮细胞凋亡并改善屏障功能，提示该通路是IBD干预的潜在关键靶点。天然来源的酚类化合物因其多靶点、低毒性的特点，在IBD治疗研究中备受关注^［15-17］。丁香酸甲酯（MS）是从传统中药两面针中分离得到的一种酚类单体，已有研究证实其具有显著的抗氧化与抗菌活性^［18-20］。虽然MS在炎症性肠病中的作用尚未见报道，但其结构类似物丁香酸能减轻葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎，并改善肠道屏障蛋白表达^［21］，提示酚类单体可能通过保护肠道屏障功能发挥抗IBD作用。近年来研究表明，酚类化合物改善IBD的核心作用机制以抑制肠上皮细胞凋亡为主，稳定肠道屏障结构，间接缓解肠道炎症，发挥抗IBD效应^{［22， 23］}。结合MS的抗氧化活性^［18-20］及结构类似物的作用特点^［21］，推测MS可能通过抑制肠上皮细胞过度凋亡发挥抗IBD作用。本研究采用DSS诱导的小鼠结肠炎模型、体外肠上皮细胞凋亡模型，并结合网络药理学预测，系统探讨MS主要通过抑制肠上皮细胞过度凋亡来发挥保护肠屏障的作用，为IBD的药物治疗提供新的候选分子与理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物

本研究选用24只健康雄性的C57BL/6小鼠（SPF级，江苏集萃药康生物科技股份有限公司），体质量20~24 g，周龄6~8周。小鼠处于恒温、恒湿、12 h明暗交替的SPF级动物房进行分笼饲养，自由摄食灭菌标准饲料以及无菌饮用水。所有小鼠在实验前均适应性饲养7 d。本实验所有实验操作均经蚌埠医科大学实验动物伦理委员会审批通过（伦理批号：伦动科批字［2025］第396号）。

1.1.2 试剂

Methyl syringate（纯度：99.69%，上海陶术生物科技股份有限公司）；DSS（MP Biomedicals）；HE染色试剂盒、AB-PAS染色试剂盒和二甲基亚砜（DMSO）（北京索莱宝）；ELISA试剂盒（武汉博士德）；PCR引物（上海生工）；PI凋亡试剂盒，PCR试剂盒（南京诺唯赞）；CCK-8试剂，TUNEL凋亡试剂盒（武汉塞维尔）；兔抗闭锁小带蛋白-1（ZO-1）抗体，鼠抗紧密连接蛋白-1（Claudin-1）抗体，兔抗c-Jun氨基末端激酶（JNK）抗体，兔抗细胞外调节蛋白激酶（ERK）抗体，兔抗p-38丝裂原活化蛋白激酶（p-38）抗体，兔抗磷酸化的c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）抗体，兔抗磷酸化的细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）抗体，兔抗磷酸化的p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38）抗体，山羊抗小鼠IgG H&L（FITC），山羊抗兔IgG H&L（Alexa Flour®555）抗体（Abcam）；兔抗B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）抗体，兔抗活化型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（C-caspase3）抗体，兔抗X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）抗体，兔抗髓过氧化物酶（MPO）抗体（武汉三鹰）；小鼠抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体，HRP标记山羊抗鼠IgG，HRP标记山羊抗兔IgG，DAB显色试剂盒，兔二步法试剂盒（北京中杉金桥）；RIPA裂解液，RPMI 1640培养基（上海李记生物）；胎牛血清（FBS，Gibco）；流式细胞仪（BD FACSCanto）；荧光倒置显微镜（徕卡DMI8）；实时荧光定量PCR仪（QuantStudio DX）；全自动化学发光成像系统（ChemiDoc MP）；玻片扫描仪（Olympus VS200）；精密电子天平（赛多利斯BSA124S-CW）；组织匀浆器（北京天根公司）。

1.2 方法

1.2.1 DSS诱导的小鼠结肠炎模型的建立及实验分组 将24只小鼠按照完全随机设计（随机数字表法）分为3组（n=8）：对照组（Con组）、造模组（DSS组）、药物处理组（MS组，100 mg/kg）。DSS组和MS组小鼠自由饮用含2.5%DSS的无菌水每2 d更换1次（48 mL/笼），持续7 d。从造模开始前3 d，MS组小鼠灌用1%DMSO和生理盐水溶解的MS（100 mg/kg）100 μL进行处理，给药1次/d，持续10 d。Con组和DSS组每日灌胃等体积的含1%DMSO的生理盐水。每日下午3时称取3组小鼠体质量并观察小鼠状态，评估肠炎情况。在MS干预后第10天，使用2%的异氟烷麻醉小鼠后采用颈椎脱臼法处死，在冰上迅速剖取小鼠结肠组织，所有结肠组织测量长度并拍照后沿纵轴剖开结肠，用预冷的PBS轻轻清洗结肠。一半使用福尔马林固定72 h，一半放于-80 ℃冰箱保存用于后续实验。

1.2.2 小鼠结肠炎症状评估

每日下午3时使用精密电子天平称取小鼠体质量（g）；疾病活动指数（DAI）根据小鼠体质量、粪便性状、便血情况进行评估，评分标准如下，体质量减轻的评分标准如下：0分（<1%），1分（≥1%且<5%），2分（≥5%且<10%），3分（≥10%且<15%），4分（≥15%）。便血情况：黄棕色便为0分；黑便为2分；严重血便为4分。粪便性状：正常颗粒状为0分；粪便软黏，无肛周粘连为1分；粪便软黏，肛周粘连为2分；粪便半稀糊状，肛周粘连为3分；稀便，肛周粘连为4分。DAI计算如下：（小鼠体质量评分+粪便性状评分+便血情况评分）/3，分数越高代表肠炎越重^［24］。

1.2.3 HE染色和AB-PAS染色评估小鼠结肠病理改变 小鼠结肠在福尔马林中固定72 h后，TBST清洗4 h，用直尖镊子夹住肛门端，绒毛向内进行卷曲，制备成“瑞士卷”后进行脱水。使用旋转切片机将结肠组织切成3 μm厚度的切片。HE染色和AB-PAS染色严格按照试剂盒说明书进行操作。染色结束后用中性树脂进行封片，经显微镜扫描后观察进行组织学评分，该评分根据炎症细胞浸润程度、损伤范围和隐窝损伤程度进行评估：炎症细胞浸润程度分级如下：0分为炎症细胞无浸润，1分为轻度且散在的炎症细胞浸润，2分为中度炎症细胞浸润并可见细胞聚集，3分为广泛的炎症细胞浸润导致组织结构丧失。损伤范围评分如下：0分为无损伤，1分为黏膜损伤，2分为黏膜和黏膜下层损伤，3分为全层损伤。隐窝损伤程度分为：0分为隐窝完整，1分为基底部1/3损伤，2分为基底部2/3损伤，3分为仅残留表层上皮细胞完整，4分为隐窝和上皮细胞完全丧失。组织学评分是这3个单项评分的总和，分数越高代表结肠组织的炎症与损伤越重^［25］。

1.2.4 ELISA检测小鼠结肠炎症因子蛋白的表达水平 取小鼠结肠组织并称重，按每1 mg组织加入10 μL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，使用组织研磨仪充分研磨2次。将研磨后的组织匀浆置于4 ℃裂解30 min，随后于4 ℃，12 000 r/min离心10 min，收集上清。取适量上清，用样品稀释液稀释3倍，每孔加样100 μL，设置3个复孔，盖上封板膜后37 ℃孵育90 min，孵育结束后甩去板内液体，每孔加入100 μL相应抗体工作液，覆膜后37 ℃孵育60 min。随后使用1×洗涤缓冲液洗板3次，每孔加入100 μL ABC工作液，覆膜后37℃孵育30 min，洗板5次，每孔加入90 μLTMB显色液，37℃避光孵育15 min，最后每孔加入100 μL终止液终止反应，使用酶标仪测定各孔吸光度A_{450 nm}，并根据试剂盒说明书提供的标准曲线计算结肠组织中白细胞介素-6（IL-6），肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-10（IL-10）的蛋白含量。

1.2.5 RT-qPCR检测小鼠结肠组织的mRNA表达水平 向小鼠结肠组织中加入1 mL Trizol，使用组织研磨仪充分研磨成组织匀浆，加入200 μL氯仿。12 000 r/min，4 ℃离心10 min，吸取上清，提取总RNA后测量浓度按照反转录试剂盒操作，获得cDNA。使用TB Green Premix Ex Taq II试剂盒检测IL-6、TNF-α、IL-10的mRNA的水平。PCR反应过程：预变性30 s（95 ℃）、变性5 s（95 ℃）、退火30 s（60 ℃），重复40个循环，以GAPDH为内参，通过2^-ΔΔct相对定量分析法计算目的基因表达。RT-qPCR引物均由上海生工生物合成。IL-6上游引物：5'-CAACGATGATGCACTTGCAGA-3'，下游引物：5'-GTGACTCCAGCTTATCTCTTGGT-3'；TNF-α上游引物：5'-ACCCTCACACTCACAAACCA-3'，下游引物：5'-ATAGCAAATCGGCTGACGGT-3'；IL-10上游引物：5'-GCATGGCCCAGAAATCAAGG-3'，下游引物：5'-ACACCTTGGTCTTGGAGCTTATTA-3'；GAPDH上游引物：5'-CAGGAGAGTGTTTCCTCGTCC-3'，下游引物：5'-GATGGGCTTCCCGTTGATG A-3'。

1.2.6 免疫荧光检测小鼠结肠组织紧密连接蛋白表达情况

取结肠组织石蜡切片，经70 ℃烤片2 h，脱蜡水化，纯水洗涤后，采用柠檬酸钠抗原修复液蒸煮1 h，修复完成后自然冷却至室温，用PBS清洗3次，每次5 min。使用5%BSA在室温下封闭1 h，分别加入抗体：兔抗ZO-1抗体（1∶200）、鼠抗Claudin-1抗体（1∶400），置于4 ℃湿盒中孵育过夜。第2天，待恢复室温，PBS清洗3次，加入山羊抗兔IgG H&L（FITC；1∶1000）、山羊抗鼠IgG H&L（Alexa Flour®555；1∶1000）、DAPI（1∶1000）室温避光孵育1.5 h。PBS清洗3次后使用抗荧光淬灭剂封片，于徕卡倒置荧光显微镜下进行图像采集。最后通过Image J软件对图像进行3D分析及平均荧光强度分析。

1.2.7 免疫组化检测小鼠结肠组织MPO的表达水平

取小鼠结肠组织石蜡切片，经70 ℃烤片2 h，随后依次进行脱蜡水化及纯水洗涤，采用柠檬酸钠抗原修复液蒸煮30 min，修复完成后自然冷却至室温，并用PBS清洗3次，每次5 min。随后进行内源性过氧化物酶阻断30 min，PBS清洗3次，再用10%山羊血清室温封闭30 min。加入抗体：兔抗MPO抗体（1∶200），置于4 ℃湿盒中孵育过夜。次日将切片恢复至室温，PBS清洗3次，滴加HRP标记的山羊抗兔孵育1 h。DAB（按1滴DAB浓缩液+1 mL DAB底物液比例配制）进行显色，显色后PBS清洗2次，苏木素染色10 min、1%盐酸酒精分化1~2 s，1%氨水返蓝10 s。最后依次通过梯度酒精及二甲苯进行脱水透明处理，以中性树脂封片。使用Olympus玻片扫描仪获取全片图像。每组随机选取3张视野图片，通过Image J软件进行相对IOD值分析。

1.2.8 TUNEL染色观察MS对小鼠肠上皮细胞凋亡的影响

石蜡切片经脱蜡水化处理后滴加蛋白酶K（20 μg/mL），于37 ℃孵育20 min，PBS清洗3次，滴加平衡缓冲液（Equilibration Buffer）室温孵育10 min，加入重组TdT酶（1 μL）、TMR-5-dUTP 标记液（5 μL）、平衡缓冲液（50 μL）的混合液37 ℃孵育1 h，加入用PBS稀释的DAPI（1∶1000）室温避光8 min，染色结束后用抗荧光淬灭剂进行封片。每组随机选取3张图片，通过Image J对总细胞和凋亡细胞进行计数，计算凋亡细胞比例。

1.2.9 NCM460细胞培养

NCM460细胞用含89%1640、10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的培养基在37 ℃、5%CO₂的培养箱中进行培养。每48 h更换一次培养基，待细胞长至70%~80%密度时，经胰蛋白酶消化和重悬，进行传代和后续实验。

1.2.10 CCK-8检测MS对NCM460细胞活性的影响

取对数生长期的NCM460细胞，以1×10⁴/孔的密度接种在96孔板，待细胞长至60%~70%密度时，弃培养基，用PBS清洗2次，加入含不同浓度MS（200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L）的培养基（100 μL/孔），每个浓度设置5个复孔。经MS处理24 h后，每孔加入1 μL的CCK-8试剂在37℃、5%CO₂的培养箱中避光孵育4 h。使用酶标仪测定吸光度A_{450 nm}，设置空白组，对照组，不同浓度MS处理组，实验独立重复3次。细胞活力按以下公式计算：细胞活力（%）=（A_处理组-A_空白组）/（A_对照组-A_空白组）×100%。

1.2.11 流式细胞术检测细胞凋亡

NCM460细胞经消化并离心后，用12 mL RPMI 1640完全培养基重悬，随后均分为3组，每组设置4个复孔。具体分组及处理如下：对照组（Con组）：正常培养不做任何处理。模型组（DSS组）：向培养基中加入0.04 g DSS至终浓度为1%。MS干预组（MS组）：加入1% DSS和50 μmol/L MS。将所有分组细胞置于37 ℃培养箱孵育10 h后，用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞，细胞经预冷的PBS洗涤2次，于300 g离心5 min，弃上清，每管加100 μL含PI和Annexin V-APC染液的1×Binding Buffer，室温避光染色10 min。染色结束后每管加400 μL的1×Binding Buffer，重悬细胞，并于1 h内上机进行流式细胞术检测。

1.2.12 Western blotting

向小鼠结肠组织和NCM460细胞中加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，放入4℃裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，BCA定量蛋白浓度。每400 μL的蛋白上清液加入100 μL的蛋白上样缓冲液，100 ℃煮10 min。按照蛋白的相对分子质量制备分离胶，200 V电泳35 min分离蛋白。采用三明治转膜装置将蛋白转至甲醇激活的PVDF膜上，400 mA，转膜60 min。用TBST配置5%脱脂牛奶封闭1 h，加入抗体：兔抗ZO-1抗体（1∶1000）、鼠抗Claudin-1抗体（1∶1000）、兔抗XIAP抗体（1∶1000）、兔抗Bcl-2抗体（1∶1000）、兔抗C-Caspase-3抗体（1∶1000）、兔抗p38抗体（1：1000）、兔抗ERK抗体（1∶1000）、兔抗JNK抗体（1∶1000）、兔抗p-p38抗体（1∶1000）、兔抗p-ERK抗体（1∶1000）、兔抗p-JNK抗体（1∶1000）、鼠抗β-actin抗体（1∶3000）4 ℃孵育过夜。次日经TBST清洗3次，每次5 min。室温孵育辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶3000）和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（1∶3000）1 h，TBST清洗3次，每次5 min。加入ECL发光液后采集图片，用Image J对目的蛋白条带进行灰度值分析。

1.2.13 网络药理学分析

通过使用在线平台CHEMBL获得丁香酸甲酯（Methyl syringate）的化学结构式。将该化学结构式输入到SEA、SWISS、INDEX数据库，经Uniprot数据库将得到的基因ID转换成统一标识，在excel表格上筛选合并去重后得到药物预测靶点。以疾病模型“inflammatory bowel diseases”为研究对象，在GeneCards、CTD数据库中分别获得疾病靶点，再经合并去重后得到IBD预测靶点。通过在线平台Venny2.1.0，系统分析药物预测靶点与IBD预测靶点的关联得到交集靶点。将筛选得到的交集靶点输入STRING数据平台，生成蛋白质互作网络（PPI）。在DAVID数据库中导入交集靶点，进行KEGG和GO富集分析，将富集的数据导出在微生信在线平台整理进行结果可视化处理。

1.3 统计学分析

实验数据的统计学处理通过GraphPad Prism 9.5.0软件完成。计量资料以均数±标准差表示，组间差异比较采用单因素方差分析或t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义，每组实验重复3次。通过预实验测得主要指标（如结肠长度、IL-6水平）的效应大小与标准差。设定双侧α=0.05，检验效能1-β=0.80，计算得每组至少需要7只动物。考虑到实验过程中可能因造模失败、动物死亡等原因造成样本流失，最终每组纳入8只小鼠，总样本为24只，满足统计学检验效能要求。

2 结果

2.1 MS缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症状

与对照组相比，DSS组小鼠的体质量下降，DAI评分升高和结肠组织缩短，经MS干预后，小鼠的体质量升高（图1A），DAI评分由2.87±0.59降至1.75±0.66（图1B，P<0.05），小鼠结肠长度增加至7.39±0.44 cm，血便症状亦得到改善（图1C、D，P<0.05）。

2.2 MS缓解DSS引发的小鼠肠黏膜炎性损伤

小鼠结肠组织HE染色结果显示，MS组可以改善DSS导致的小鼠隐窝和肠绒毛结构紊乱，减少炎症细胞的浸润（图2A），降低组织学评分（图2B，P<0.05）。AB-PAS染色结果显示，MS组相较于DSS组杯状细胞的数量显著增加（图2C、D，P<0.05）。

2.3 MS能降低DSS引发的小鼠肠道炎症介质的表达

ELISA和RT-qPCR结果表明，与DSS组相比，MS组可显著降低促炎因子IL-6、TNF-α的蛋白及mRNA水平，增加抗炎因子IL-10的蛋白及mRNA水平（图3A、B，P<0.05）。根据免疫组化染色及相对定量分析结果，与对照组相比，DSS组小鼠结肠组织中MPO表达水平显著升高，而MS干预可有效降低MPO的表达（图3C、D，P<0.05）。

2.4 MS改善DSS诱导的小鼠肠屏障紧密连接蛋白紊乱

免疫荧光分析显示，MS可显著改善DSS诱导的小鼠结肠组织ZO-1，Claudin-1的表达与分布（图4A~C，P<0.05）。Western blotting检测结果显示，与DSS组相比，MS组小鼠结肠组织中ZO-1和Claudin-1蛋白的表达水平显著升高（图4D、E，P<0.05）。

2.5 网络药理学分析结果

通过SEA、SWISS、INDEX在线平台，获取药物丁香酸甲酯作用靶点668个。在CTD、Gene cards网站检索IBD疾病靶点，获取IBD疾病靶点4631个。将数据导入Venny2.1.0在线平台获取MS与IBD的376个交集共同作用靶点（图5A），交集靶点经String数据库构建药物与疾病交集靶蛋白PPI图（图5B）。将交集靶点导入到DAVID数据库进行KEGG和GO分析（图5C、D），结果表明MS治疗IBD与细胞凋亡及MAPK通路相关。

2.6 MS对NCM460细胞活性的影响

CCK-8结果显示，在MS浓度达到200 μmol/L时对NCM460细胞仍无明显毒性（图6）。

2.7 MS可抑制DSS诱导的小鼠肠上皮细胞凋亡

TUNEL染色结果显示，MS可改善DSS导致的小鼠肠上皮细胞凋亡（图7A、B，P<0.05）。根据Western blotting检测结果，与DSS组相比，MS组中抗凋亡蛋白XIAP与Bcl-2的表达水平显著升高，而促凋亡蛋白C-caspase3的表达则明显降低。（图7C、D，P<0.05）。

2.8 MS可抑制DSS诱导的NCM460细胞凋亡

流式检测结果表明，与DSS组相比，MS可下调NCM460细胞凋亡比例，包括早期凋亡和晚期凋亡细胞比例（图8A、B，P<0.05）。Western blotting结果显示，MS可上调XIAP、Bcl-2的蛋白水平，下调C-caspase3的蛋白水平（图8C、D，P<0.05）。

2.9 MS处理对MAPK信号通路的影响

小鼠肠黏膜组织Western blotting结果显示，在DSS组中，MAPK通路中关键蛋白ERK、JNK、p38磷酸化水平较对照组显著升高，而MS组中p-ERK、p-JNK、p-p38的含量较DSS组显著下降（图9A、B，P<0.05）。

NCM460细胞Western blotting结果显示，与DSS组相比，MS组中p-ERK、p-JNK、p-p38的蛋白含量明显下降（图9C、D，P<0.05）。

3 讨论

天然植物单体因其显著的抗炎活性，在炎症相关性疾病包括IBD的治疗中展现出重要的药理潜力^［26］。中药两面针具活血化瘀、行气止痛、祛风通络、解毒消肿之效，现代药理证实其有显著镇痛、抗炎、止血作用，可用于跌打损伤、牙痛、风湿痹痛等症，还能抑制肿瘤细胞增殖、保护心脑缺血损伤^{［18， 27］}。酚类化合物丁香酸甲酯作为从两面针干燥根中提取的药物活性成分。秦星等人研究发现丁香酸甲酯为天然酚类分子，低毒低成本，可作为漆酶介质增强黄曲霉毒素 B1 的降解能力，还具有抗菌、调节食欲等生物活性^［28］。本研究证实，MS可缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症状，具体表现为改善小鼠体质量下降、增加结肠长度、降低DAI和组织学评分，并显著提升肠粘膜中杯状细胞数量。既往文献报道，DSS诱导的结肠炎模型中促炎介质表达升高，抗炎介质表达降低^{［21， 29］}。与本研究的观察一致，与DSS组相比，MS组的小鼠肠粘膜中抗炎介质IL-10表达升高，促炎介质IL-6、TNF-α表达降低。这些结果共同表明，MS对DSS诱导的小鼠结肠炎具有明确的改善作用。

肠屏障功能的修复是MS发挥治疗作用的关键环节。本研究发现，MS能够有效上调紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的表达，并改善其在肠黏膜中的分布紊乱，从而增强肠上皮物理屏障的完整性。该发现与某些结构类似的酚类化合物已报道的屏障保护作用相一致。例如，丁香脂素减轻DSS诱导的溃疡性结肠炎模型中的炎症反应和肠道通透性^［30］。本研究则首次揭示了MS在DSS结肠炎模型中发挥出肠屏障修复与抗炎效应，为酚类化合物在黏膜保护方面的作用提供了新的实验支持。

为了深入阐释MS缓解结肠炎的作用途径及机制，本研究结合网络药理学预测分析，发现其治疗作用可能与抑制肠上皮细胞凋亡及调节MAPK信号通路有关。肠上皮细胞凋亡与肠屏障功能密切相关，生理状态下适度的凋亡有助于维持肠上皮更新稳态，而过度凋亡则直接导致屏障损伤^{［10， 31］}。为验证MS是否通过抑制肠上皮细胞凋亡治疗结肠炎，本研究通过TUNEL染色、Western blotting、流式细胞术多种方法进行验证，结果显示MS处理DSS诱导的小鼠肠粘膜和DSS诱导的NCM460细胞，凋亡细胞比例和促凋亡蛋白C-Caspase3表达明显下降，抗凋亡蛋白Bcl-2和XIAP表达升高。这些结果表明，MS可通过抑制肠上皮细胞过度凋亡来发挥治疗作用。

进一步的KEGG富集分析提示，MAPK信号通路可能参与MS的抗凋亡作用。既往研究表明，MAPK通路在IBD中被多种炎症因子激活，并通过调控炎症介质表达、免疫细胞活化及上皮细胞凋亡等过程影响疾病进展^{［13， 14， 32］}。MAPK通路主要包含ERK1/2（ERK）、JNK和p38，已有研究证实这些亚基在IBD模型中可发生激活^{［33， 34］}。该通路的激活机制主要依赖于上述亚基的磷酸化修饰，即通过将ERK、JNK及p38分别磷酸化生成其活化形式p-ERK、p-JNK、p-p38，进而启动下游炎症信号的传导。本研究通过Western blotting实验证实，MS能显著抑制DSS诱导的肠黏膜及NCM460细胞中p-ERK、p-JNK和p-p38的蛋白表达水平，表明MS可能通过抑制MAPK通路的异常活化，进而发挥抗肠上皮细胞凋亡的作用。

本研究价值主要体现在临床与科研两方面。临床方面，MS具备来源广、制备简便、成本低的特点，有望成为资源有限地区IBD患者的高可及性治疗药物。其通过修复肠屏障、抑制异常凋亡实现“保护性治疗”，契合“黏膜修复-免疫稳态重建”的新趋势，可改善长期预后与生活质量。研究首次系统阐明MS在DSS结肠炎中的保护作用，创新性将其机制与“MAPK-凋亡-屏障”轴关联，为IBD药物研发提供了机制明确的天然化合物候选，拓展了酚类化合物的应用前景，并为针对肠上皮凋亡的多靶点治疗策略提供了实验与理论依据。本研究还存在以下不足，实验动物数量不足，体外实验使用DSS诱导结肠炎与实际IBD患者症状不完全一致。只研究了MS通过下调MAPK通路抑制肠上皮细胞凋亡来治疗IBD，但不能排除MS通过其他信号通路、途径发挥作用。

综上所述，本研究证实MS可以下调MAPK信号通路磷酸化蛋白的表达，有效减轻肠上皮细胞凋亡、改善肠屏障功能，达到缓解DSS诱导的实验性结肠炎的作用。这一发现为IBD的药物研发提供了新的实验依据与理论支持。

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