大肠杆菌外膜囊泡依赖靶细胞内吞抑制大鼠胶质瘤细胞增殖

Escherichia coli outer membrane vesicles inhibit rat glioma proliferation through cell endocytosis

摘要

目的 探讨大肠杆菌外膜囊泡（E. coli-OMVs）抑制胶质瘤增殖及其机制。 方法 采用 CCK-8 检测不同浓度 E. coli-OMVs 对C6胶质瘤细胞活力的影响，设置PBS对照组及2.5、5、10、20 μg/mL E. coli-OMVs组。设置PKH67-E. coli-OMVs组及2.5、5、10、20 μmol/L 氯丙嗪（CPZ）+PKH67-E. coli-OMVs组，观察CPZ对细胞摄取OMVs的影响。设置PBS对照组、10 μg/mL E. coli-OMVs 组及2.5、5、10 μmol/L CPZ+10 μg/mL E. coli-OMVs组，采用EdU掺入实验评价细胞增殖能力。基于上述结果，选择PBS对照组、10 μg/mL E. coli-OMVs组及10 μmol/L CPZ+10 μg/mL E. coli-OMVs组，采用qRT-PCR、Western blotting、免疫细胞化学和流式细胞术检测PCNA/Ki67表达及细胞周期分布。设置PBS对照组、10 μg/mL E. coli-OMVs组、CHIR99021组及CHIR99021+10 μg/mL E. coli-OMVs组，检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白β-catenin、Cyclin D1和c-Myc的表达。建立SD大鼠原位胶质瘤模型，经鼻腔给予PBS或0.25、0.5、1.0 mg/kg E. coli-OMVs，动态监测肿瘤生长，并结合HE染色及PCNA、Ki67免疫组化评价其抗肿瘤作用。 结果 2.5~10 μg/mL E. coli-OMVs可不同程度抑制C6细胞活力（P<0.05）。CPZ可减弱细胞对 OMVs的摄取，其中 20 μmol/L CPZ对细胞活力产生明显影响。2.5、5、10 μmol/L CPZ均可不同程度减弱OMVs的抗增殖作用，其中10 μmol/L CPZ干预效果最明显。与PBS组相比，10 μg/mL E. coli-OMVs可降低EdU阳性率（P<0.001），下调PCNA和 Ki67 的 mRNA（P<0.01）及蛋白表达（P<0.001），增加G0/G1期细胞比例并降低S期细胞比例（P<0.001）；与 E. coli-OMVs组相比，10 μmol/L CPZ共处理可显著回升PCNA mRNA（P<0.01）、PCNA蛋白（P<0.01）、Ki67 mRNA（P<0.05）及 Ki67 蛋白表达（P<0.001），G0/G1期细胞比例下降，S期细胞比例回升（P<0.001）。10 μg/mL E. coli-OMVs可下调β-catenin、Cyclin D1和c-Myc表达（P<0.001），而CHIR99021可部分恢复上述蛋白水平（P<0.001）。动物实验显示，0.25、0.5、1.0 mg/kg E. coli-OMVs鼻腔给药均可降低原位胶质瘤相对荧光信号，减缓肿瘤生长（P<0.001），并减少肿瘤组织中PCNA和Ki67的表达（P<0.001）。 结论 E. coli-OMVs可抑制胶质瘤细胞增殖并延缓原位胶质瘤生长，其作用可能与肿瘤细胞对OMVs的内吞摄取、Wnt/β-catenin 信号通路抑制及细胞周期阻滞有关。

Abstract

Objective To investigate the inhibitory effect of Escherichia coli outer membrane vesicles (E. coli-OMVs) on glioma proliferation and the underlying mechanism. Methods CCK-8 assay and EdU incorporation assay were used to determine the optimal concentrations of E. coli-OMVs and chlorpromazine (CPZ) for cell treatment. C6 glioma cells treated with 10 μg/mL E. coli-OMVs and 10 μmol/L CPZ were examined for PCNA and Ki67 expressions and cell cycle distribution using qRT-PCR, Western blotting, immunocytochemistry and flow cytometry. The expressions of β-catenin, cyclin D1, and c-Myc proteins in C6 cells were detected following treatment with OMVs in the presence or absence of CHIR99021. In a SD rat model bearing orthotopic glioma, the effects of intranasal PBS or OMVs (0.25, 0.5, 1.0 mg/kg) administration on tumor growth and PCNA and Ki67 expressions were observed using fluorescence imaging and immunohistochemistry. Results E. coli-OMVs within the concentrations of 2.5-10 μg/mL dose-dependently inhibited C6 cell viability, and such inhibitory effect was attenuated by 2.5, 5, and 10 μmol/L CPZ, which was the most effective at 10 μmol/L. The OMVs at 10 μg/mL significantly reduced EdU-positive cells, downregulated mRNA and protein expressions of PCNA and Ki67, and increased G0/G1-phase and decreased S-phase cell populations. These alterations were largely reversed by 10 μmol/L CPZ. Treatment with OMVs downregulated cellular expressions of β‑catenin, Cyclin D1, and c-Myc, which were partially restored by application of CHIR99021. In the tumor-bearing mice, intranasal OMVs administration dose-dependently decreased the relative fluorescence signals, slowed tumor growth, and reduced PCNA and Ki67 expressions. Conclusion E. coli-OMVs inhibit glioma cell proliferation and delay orthotopic tumor growth in rats likely via endocytic uptake of the OMVs to cause suppression of Wnt/β-catenin signaling and cell cycle arrest.

Graphical abstract

关键词

大肠杆菌 / 外膜囊泡 / 胶质瘤细胞 / 内吞作用 / PCNA / Ki67

Key words

Escherichia coli / outer membrane vesicles / glioma cells / endocytosis / PCNA / Ki67

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤之一，具有生长速度快、侵袭性强、易复发和预后差等特征^{［1， 2］}。尽管目前临床上采用以手术切除联合放化疗为主的综合治疗方案，但由于肿瘤细胞高度侵袭性和对治疗的耐受性，患者的总体生存期仍然有限^{［3， 4］}。大量研究表明，肿瘤细胞持续而失控的恶性增殖是推动胶质瘤快速进展和复发的核心病理基础^［5］，因此，有效抑制胶质瘤细胞的增殖能力被认为是抗胶质瘤治疗的重要靶点之一^［6］。

细菌外膜囊泡（OMVs），具有天然的细胞摄取能力以及可携带多种生物活性分子^{［7， 8］}。研究表明，大肠杆菌（Escherichia coli）来源的OMVs可直接发挥抗肿瘤的生物学效应，例如在肝癌^［9］、结肠癌^［10］和乳腺癌^［11］等多种肿瘤模型中，E. coli-OMVs能够显著抑制肿瘤细胞增殖，主要通过下调增殖相关分子PCNA和Ki67的表达水平，干扰DNA复制过程并阻滞细胞周期进程，最终抑制肿瘤生长^［12-14］。

然而，E. coli-OMVs对胶质瘤细胞增殖的直接调控作用、其是否依赖细胞摄取过程，以及相关分子机制尚未得到充分阐明。基于此，本研究以大鼠C6胶质瘤细胞和SD大鼠原位胶质瘤为模型，验证E. coli-OMVs是否可通过内吞作用被细胞摄取从而调控胶质瘤细胞增殖，通过 Wnt/β-catenin 通路相关蛋白检测，初步分析 E. coli-OMVs 调控胶质瘤细胞增殖的可能机制，并在体内验证E. coli-OMVs对原位胶质瘤的抑制作用，为细菌囊泡的精准抗胶质瘤策略提供新的见解和实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与菌株

大鼠C6-Luc胶质瘤细胞系购自丰晖生物（WZ01017）。大肠杆菌BL21标准菌株购自中国微生物菌种库（Bio-118783）。

1.1.2 实验动物

实验选用健康SD雄性大鼠，6~8周龄，体质量200~250 g，由重庆华溯同捷生物科技有限公司购入。

1.1.3 主要试剂

DMEM培养基和0.25%胰蛋白酶（Gibco）；胎牛血清（CLARK Bioscience）；非程序性无血清细胞冻存液（Servicebio）；CCK-8试剂盒和EdU细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；免稀释快速BCA蛋白定量检测试剂盒（增强型）（广东易优生物医药有限公司）；FuturePAGETM蛋白预制胶（ACE Biotechnology）；LB肉汤和LB琼脂（青岛海博生物公司）；兔抗PCNA单克隆抗体、兔抗Ki67单克隆抗体及HRP标记的羊抗小鼠/兔IgG二抗（Abcam）；兔抗LaminB1单克隆抗体（成都正能生物技术有限责任公司）；Animal Total RNA Isolation Kit（Foregene）；5× All-In-One MasterMix和EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-No Dye（abm）。

1.1.4 主要仪器

超速离心机（Beckman Coulter， Optima XPN-100），纳米颗粒跟踪分析仪（Particle Metrix），透射电子显微镜（Hitachi），二氧化碳培养箱（Thermo Fisher Scientific， Heracell 150i），酶标仪（BioTek， Epoch），流式细胞仪（CyoFLEX），荧光玻片扫描仪（Nikon， Eclipse Ti2），实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD CFX Connect）。

1.2 方法

1.2.1 E. coli-OMVs的提取与表征

挑取大肠杆菌 BL21单菌落接种于 LB 液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养至平台期。5000×g离心收集上清液，依次用0.45 μm和0.22 μm滤膜过滤。将滤液在 4 ℃以150 000×g 超高速离心 3 h，沉淀用 PBS 重悬后再次150 000 ×g超高速离心 3 h进行洗涤。最终将沉淀以用PBS 重悬，-80 ℃保存备用。通过BCA 法测定总蛋白浓度，纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测粒径分布；透射电镜（TEM）观察形态学特征；通过Western blotting检测外膜蛋白 OmpA、OmpC 以验证 OMVs 的来源和样本纯度。

1.2.2 细胞培养

C6细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，置于37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养箱内常规培养，按70%~80%融合度进行传代。

1.2.3 CCK-8筛选E. coli-OMVs最佳作用条件

将 C6 细胞消化并计数后调整为均一细胞悬液，以5×10³/孔的密度接种于96孔板。细胞过夜贴壁后，显微镜观察确认各孔细胞贴壁良好、分布均匀，未见明显脱落，并随机选取视野评估各孔初始细胞数量一致性，随后加入不同浓度 E. coli-OMVs（0、2.5、5、10、20 μg/mL），作用12、24、48 h。各时间点加入CCK-8工作液，37 ℃孵育2 h，检测吸光度A_{450 nm}。细胞存活率计算公式为：细胞存活率（%）=［（A_实验组－A_空白组）/（A_对照组－A_空白组）］×100%。

1.2.4 氯丙嗪（CPZ） 细胞活力检测与内吞抑制浓度筛选将

C6 细胞消化、计数后制备成均一细胞悬液，并以5×10³/孔的密度接种于96孔板。细胞过夜贴壁后，显微镜观察确认各孔细胞贴壁良好、分布均匀，未见明显脱落，并随机选取视野评估各孔初始细胞数量一致性。随后分别加入PBS或不同浓度CPZ（2.5、5、10、20 μmol/L）处理。处理24 h后，每孔加入CCK-8 试剂，避光孵育后检测吸光度A_{450 nm}。以 PBS 组作为对照，计算各组细胞相对活力。将C6细胞接种在24孔板中，待细胞贴壁后分别采用2.5、5、10、20 μmol/L CPZ预处理。随后加入荧光标记的 E. coli-OMVs 与细胞共孵育。孵育结束后，弃去培养液，PBS 轻柔洗涤以去除未被摄取的游离 OMVs，4%多聚甲醛常温固定15 min，PBS清洗2次，滴入DAPI试剂染色10 min，PBS清洗2次，最后用荧光显微镜观察。

1.2.5 胶质瘤细胞对E. coli-OMVs的摄取

将C6细胞接种在24孔板中，加入PKH67标记的E. coli-OMVs分别培养0、2、4 h，去除培养基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛常温固定15 min，PBS清洗2次，滴入DAPI试剂染色10 min，PBS清洗2 次，最后用荧光显微镜观察。

1.2.6 EdU染色检测细胞增殖能力

将 C6 细胞接种于细胞培养板中，待细胞贴壁后进行处理。实验设置PBS 对照组、E. coli-OMVs 组、2.5 μmol/L CPZ+E. coli-OMVs组、5 μmol/L CPZ+E. coli-OMVs组和10 μmol/L CPZ+E. coli-OMVs 组。其中，E. coli-OMVs 浓度为 10 μg/mL；CPZ 预处理浓度分别为2.5、5、10 μmol/L。CPZ 预处理1 h后，加入E. coli-OMVs，并分别与 C6 细胞共孵育12、24、 48 h。各组在孵育结束前 2 h 加入 EdU工作液，使EdU终浓度为 10 μmol/L。孵育结束后，按照EdU检测试剂盒说明书进行细胞固定、通透、Click 反应及细胞核染色。染色完成后，采用荧光显微镜观察并采集图像，统计EdU 阳性细胞数和总细胞数，计算 EdU 阳性细胞比例。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测胶质瘤细胞中PCNA和Ki67 mRNA的表达水平

收集对照组、10 μg/mL E. coli-OMVs孵育24 h组及10 μmol/L CPZ+E. coli-OMVs组细胞，使用Animal Total RNA Isolation Kit提取总RNA，测定纯度和浓度后，按说明书逆转录合成cDNA。采用EvaGreen MasterMix进行qPCR扩增，以GAPDH作为内参基因，采用2^-ΔΔCt法计算PCNA和Ki67 mRNA的相对表达量。

1.2.8 蛋白质免疫印迹检测胶质瘤细胞中PCNA的蛋白表达水平

分别收集对照组、10 μg/mL E. coli-OMVs孵育24 h组及10 μmol/L CPZ+E. coli-OMVs组的细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白。经BCA法定量后，取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，并转移至PVDF膜。采用PCNA（1∶1000）和LaminB1（1∶2000，内参）一抗4 ℃孵育过夜，次日用HRP标记二抗（1∶2000）室温孵育1 h，ECL显色，使用ImageJ软件分析条带灰度值，计算相对表达量。

1.2.9 免疫荧光检测胶质瘤细胞中Ki67的蛋白表达水平

将C6细胞接种在24孔板中，实验分组为对照组、E. coli-OMVs孵育24 h组及10 μmol/L CPZ+E. coli-OMVs阻断剂组，处理结束后，使用4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100透化，3% BSA封闭。加入Ki67（1∶200）一抗4 ℃孵育过夜，次日加入相应荧光标记二抗（FITC 1∶200）避光孵育1 h。DAPI染核并封片，于荧光显微镜下观察并记录图像。

1.2.10 流式细胞术检测细胞周期分布

将 C6 细胞接种于细胞培养板中，待细胞贴壁后进行分组处理。实验设置PBS对照组、E. coli-OMVs 组和 10 μmol/L CPZ+E. coli-OMVs 组。E. coli-OMVs 组加入10 μg/mL E. coli- OMVs 处理；10 μmol/L CPZ+E. coli-OMVs 组先采用 10 μmol/L CPZ 预处理，随后加入10 μg/mL E. coli-OMVs。各组细胞共孵育 24 h 后收集细胞。处理结束后，弃去培养液，PBS 清洗细胞，胰酶消化后收集细胞沉淀。细胞经 PBS 重悬清洗后，加入预冷 70% 乙醇固定，并于4 ℃保存。固定结束后离心去除乙醇，PBS清洗细胞，随后按照细胞周期检测试剂盒说明书加入RNase A和PI染色液，避光孵育。染色完成后，采用流式细胞仪检测细胞周期分布，并分析 G0/G1 期、S期和G2/M期细胞比例。每组设置 3 个生物学重复。

1.2.11 Western blotting检测 Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白表达

将 C6 细胞接种于细胞培养板中，待细胞贴壁后进行分组处理。实验设置 PBS 对照组、E. coli-OMVs组、CHIR99021组和CHIR99021+E. coli-OMVs组。PBS对照组加入等体积 PBS；E. coli-OMVs组加入10 μg/mL E. coli-OMVs；CHIR99021 组加入 5 μmol/L CHIR99021；CHIR99021+E. coli-OMVs组先加入 5 μmol/L CHIR99021 预处理，随后加入10 μg/mL E. coli-OMVs。各组处理 24 h 后收集细胞。处理结束后，弃去培养液，PBS清洗细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，并采用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品经 SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜。膜经封闭后，分别加入β-catenin、cyclin D1、c-Myc（1∶1000） 及内参蛋白（1∶2000）一抗，4 ℃孵育过夜。次日加入相应二抗孵育（1∶2000），采用化学发光法显色并采集条带图像。采用 ImageJ 软件对蛋白条带进行灰度分析，以内参蛋白作为归一化标准，计算各组蛋白相对表达水平。

1.2.12 SD大鼠原位胶质瘤模型建立、鼻腔给药及活体成像

用C6-Luc细胞构建 SD 大鼠原位胶质瘤模型。本动物实验已通过重庆医科大学实验动物管理和使用委员会的伦理审查（伦理批号：IACUC-CQMU-2026-03157）。造模成功后，动物随机分为4组（n=3）：PBS 对照组、E. coli-OMVs 低剂量组（0.25 mg/kg）、中剂量组（0.5 mg/kg）和高剂量组（1 mg/kg）。各给药组按设定剂量经鼻腔给药，PBS 对照组给予等体积 PBS。给药期间每日记录各组大鼠体质量变化。分别于给药第 1 天、第 4 天和第 7 天进行脑内胶质瘤活体成像，采集各时间点肿瘤区荧光信号值。以给药第1天荧光值作为基线，分别计算第4天和 第7天的相对荧光值，用于评价各组肿瘤生长速度。给药结束后处死动物，取脑组织固定、脱水、石蜡包埋并连续切片。部分切片行 HE染色观察肿瘤组织形态学改变；部分切片行免疫组织化学染色，检测增殖相关蛋白PCNA和Ki67的表达水平。显微镜下观察并采集图像，对阳性表达进行半定量分析。

1.2.13 统计学分析

采用GraphPad Prism 10.0软件进行统计分析，两组间比较采用配对t检验，多组比较前先进行Levene 方差齐性检验；当方差齐时采用 ordinary one-way ANOVA 结合 Tukey 多重比较；当方差不齐时采用 Welch's ANOVA 结合 Games-Howell 多重比较。对于涉及两个因素的实验，采用双因素方差分析。计量资料以均数±标准差表示，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E. coli-OMVs的提取与表征

TEM观察到成功提取得到典型的纳米级双层膜囊泡结构（图1A）。NTA检测显示，囊泡粒径约105.2±36.2 nm，粒径峰值约89.2 nm（图1B）。Western blotting结果提示，大肠杆菌特征外膜蛋白OmpA与OmpC在囊泡中均有明显表达，相对分子质量分别约为36 000和38 000（图1C）。

2.2 E. coli-OMVs对胶质瘤细胞活力的影响

在0、2.5、5、10 μg/mL的浓度范围内，随E. coli-OMVs浓度升高，细胞活力逐渐下降。10 μg/mLE. coli-OMVs细胞活力下降最强（P<0.01，P<0.001，图2）。

2.3 CPZ对胶质瘤细胞摄取E. coli-OMVs的影响

与 PBS 组相比，2.5、5、10 μmol/L CPZ 处理后 C6 细胞活力与对照 PBS组差异无统计学意义（P>0.05），而20 μmol/LCPZ 组细胞活力降至（73.69±6.27）%，较PBS组下降约25.62%（P<0.001，图3A）。

荧光显微镜结果示示，随着 CPZ浓度由2.5、5 μmol/L 增加至 10 μmol/L，细胞内 E. coli-OMVs 荧光信号逐渐减弱。进一步升高CPZ浓度至20 μmol/L 时，虽然囊泡荧光信号进一步减弱，但细胞数量明显减少（图3B）。

在此基础上，进一步观察 10 μmol/L CPZ 对 C6 细胞摄取 E. coli-OMVs 的影响。荧光显微镜结果显示，0 h 时细胞周围几乎未见E. coli-OMVs荧光信号；作用 2 h 后，可观察到E. coli-OMVs在细胞核周围出现散在荧光点；至4 h时，核周荧光信号进一步增强并呈聚集趋势（图3C），说明E. coli-OMVs可逐渐被C6细胞内吞摄取。加入CPZ预处理后，同一时间点（2、4 h）核周囊泡荧光信号均明显减弱，囊泡聚集显著减少（图3D）。

2.4 CPZ对E. coli-OMVs抑制胶质瘤细胞体外增殖的影响

EdU 染色结果显示，与对照组相比，E. coli-OMVs 处理后 12 h（图4A）、24 h（图4B） 和 48 h（图4C）各时间点 EdU 阳性细胞比例均明显降低（P<0.001）。其中 E. coli-OMVs 在 24 h 时抗增殖效应最明显，因此后续实验均采用E. coli-OMVs与C6 细胞共孵育24 h。

CPZ 预处理后，EdU 阳性细胞比例较E. coli-OMVs 组不同程度回升，且随 CPZ 浓度升高恢复幅度增加。与 E. coli-OMVs组相比，2.5、5、10 μmol/L CPZ处理组在12 h 分别回升0.46%、3.03% 、5.57%（图4A、D，P<0.01，P<0.001）；在24 h 分别回升 4.16%、8.78%、15.28%（图4B、E，P<0.01，P<0.001）；在48 h 分别回升2.20%、3.60%、7.19%（图4C、F，P<0.05，P<0.001）。其中 10 μmol/L CPZ 在12、24、48 h 均表现出最大的恢复幅度，因此后续实验采用 10 μmol/L CPZ 作为内吞阻断实验浓度。

2.5 CPZ对E. coli-OMVs调控胶质瘤细胞PCNA与Ki67转录水平的影响

qPCR 结果显示（图5），与PBS对照组相比，10 μg/mL E. coli-OMVs 作用 24 h 后，PCNA 和 Ki67 mRNA 相对表达水平均明显降低（P<0.001，P<0.01）。CPZ 预处理后可部分逆转E. coli-OMVs对PCNA-mRNA和Ki67-mRNA的下调作用（P<0.01，P<0.05）。PCNA mRNA 表达较 E. coli-OMVs 组增加约 62.9%。Ki67 mRNA 表达较 E. coli-OMVs 组增加约 121.1%。

2.6 CPZ对E. coli-OMVs调控胶质瘤细胞PCNA与Ki67蛋白表达的影响

Western blotting结果显示（图6），PCNA 蛋白表达明显下调。与 PBS 对照组相比，E. coli-OMVs 组下降约 48.2%（P<0.001）。CPZ 预处理后，PCNA 表达回升较 E. coli-OMVs 组增加约 62.9%（P<0.01）。

免疫荧光定量结果显示（图7），与 PBS 对照组相比，E. coli-OMVs 组 Ki67 荧光强度下降约 57.0%（P<0.001）。CPZ预处理后，Ki67荧光强度回升，较E. coli-OMVs 组增加约 76.6%（P<0.001）。

2.7 CPZ对E. coli-OMVs 调控胶质瘤细胞周期分布的影响

流式细胞术结果显示（图8），与 PBS 对照组相比，10 μg/mL E. coli-OMVs处理后，G0/G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低。CPZ预处理后，G0/G1期细胞比例比E. coli-OMVs组下降16.90%；S期细胞比例回升 6.65%。

2.8 E. coli-OMVs调控胶质瘤细胞增殖与Wnt/β-catenin 信号通路相关

Western blotting检测 β-catenin 及其下游增殖相关蛋白 cyclin D1、c-Myc 的表达结果如图9，与 PBS 组相比，E. coli-OMVs 处理后 β-catenin 蛋白表达水平显著降低，同时 cyclin D1 与 c-Myc 表达亦明显下调。CHIR99021 单独处理后，β-catenin 水平上调，并伴随 cyclin D1、c-Myc 表达升高。在CHIR99021+E. coli-OMVs挽救组中，与 E. coli-OMVs 组相比，β-catenin、cyclin D1与c-Myc的表达水平显著回升，但整体仍低于CHIR99021组。灰度定量结果与条带变化一致：与 PBS组相比，E. coli-OMVs 组上述蛋白表达下调（P<0.001）；与 OMVs 组相比，挽救组表达回升（P<0.001）。

2.9 E. coli-OMVs抑制大鼠原位胶质瘤的增殖

2.9.1 E. coli-OMVs 鼻腔给药对大鼠原位胶质瘤生长的影响

与 PBS 对照组相比，E. coli-OMVs 各给药组肿瘤荧光信号增长速度减慢。进一步以 Day4/Day1 和 Day7/Day1 计算相对荧光值后发现，各剂量组相对荧光值均低于 PBS 组，且随给药剂量升高而逐渐降低（P<0.01，P<0.001，图10A、B）。

各组大鼠体质量均未见明显异常波动，不同组间体质量变化无明显差异，提示在本实验剂量范围内 E. coli-OMVs 鼻腔给药对动物整体状态未见明显影响（P>0.05，图10C）。

2.9.2 E. coli-OMVs 鼻腔给药对大鼠原位胶质瘤组织形态及增殖相关蛋白表达的影响

HE 染色结果显示（图11），PBS 组脑组织内可见明显肿瘤细胞浸润，细胞排列致密、核深染。与 PBS 组相比，E. coli-OMVs 给药组肿瘤细胞数量减少，排列相对疏松，浸润程度减轻。免疫组织化学结果显示（图12），与 PBS 组相比，E. coli-OMVs 各给药组肿瘤组织中 PCNA 和 Ki67 阳性表达降低（P<0.001）。

3 讨论

本研究以大鼠C6胶质瘤细胞为模型，系统评估了E. coli-OMVs对肿瘤细胞增殖的影响，明确了其在抑制细胞增殖、下调增殖标志物PCNA和Ki67方面的作用特点，同时引起 G0/G1 期细胞比例升高、S 期细胞比例降低，并证实了该效应与囊泡内吞过程密切相关。并以SD大鼠原位胶质瘤为模型，初步在体内验证E. coli-OMVs对大鼠胶质瘤生长的抑制作用。

EdU掺入实验可评估细胞增殖能力。EdU是胸苷类似物，细胞在 S 期进行 DNA 复制时可将其掺入新合成的 DNA 中；利用点击化学反应将 EdU 与荧光探针特异性偶联，从而在显微镜下识别并统计在标记时间窗内发生 DNA 合成的细胞比例^［15］，因此EdU阳性率反映的是该时间窗内细胞群体的DNA合成水平及S期细胞占比。EdU阳性率降低说明DNA 复制过程受到抑制，细胞增殖能力下降^［16］。本研究结果表明，大鼠胶质瘤C6细胞在10 μg/mL E. coli-OMVs孵育12~48 h条件下，EdU阳性细胞的比例均显著下降，说明E. coli-OMVs能够有效抑制胶质瘤细胞的增殖活性；这一结果与CCK-8的结果相互印证，表明E. coli-OMVs既能够有效抑制胶质瘤细胞的细胞活力，又有效抑制胶质瘤细胞的增殖能力，从两个维度相互呼应，共同支持E. coli-OMVs对胶质瘤细胞具有明确的体外抗增殖效应。

为进一步研究体外抗增殖效应与囊泡摄取之间的关系，采用常用的网格蛋白介导内吞抑制剂CPZ来验证，通过干扰网格蛋白组装包被结构和包被小窝形成，从而抑制细胞内吞摄取^［17］。CPZ 浓度筛选结果显示，2.5、5、10 mol/L CPZ 对C6细胞活力无明显影响，而20 μmol/L CPZ 处理后细胞活力明显下降，提示较高浓度 CPZ 本身可能产生细胞毒性。因此，后续实验选择 10 μmol/L以下 浓度的CPZ，能够在不明显影响细胞活力的前提下观察其对 E. coli-OMVs 摄取和功能效应的影响。荧光摄取实验显示，E. coli-OMVs 可随孵育时间延长逐渐在细胞核周围聚集，而 CPZ 预处理后细胞内囊泡荧光信号明显减弱，提示 CPZ 可降低 C6 细胞对 E. coli-OMVs 的摄取水平。

CPZ 预处理能够减弱 E. coli-OMVs 的抑制增殖效应，进一步说明抗增殖效应与囊泡摄取环节存在关联^{［18， 19］}。本研究发现，CPZ 预处理可在一定程度上恢复 EdU 掺入水平，E. coli-OMVs 对细胞增殖的抑制作用出现不同程度减弱。与 E. coli-OMVs 组相比，2.5、5 和 10 μmol/L CPZ 在 12 、24、48 h 均使 EdU阳性率出现不同程度的回升。这一结果与不同浓度 CPZ 对 E. coli-OMVs 内吞荧光信号的抑制趋势一致，说明E. coli-OMVs 的细胞摄取水平与其抗增殖效应之间存在一致变化关系。

从分子层面来看，PCNA 和 Ki67 是最常用的增殖相关指标^［20］。PCNA是 DNA 聚合酶 δ 的辅助因子，参与 DNA 复制与修复^［21］。Ki67则在G1、S、G2及 M 期均可表达，常用于表示细胞群体的增殖指数^［22］。本研究结果显示，胶质瘤细胞与 E. coli-OMVs 共孵育后，细胞中的PCNA与Ki67在mRNA和蛋白水平均出现明显下调。CPZ预处理后，PCNA和Ki67表达出现不同程度恢复。结果说明，E. coli-OMVs 被胶质瘤细胞摄取是其发挥增殖抑制作用的重要环节——当内吞过程受到干预时，DNA 复制活性与增殖相关标志物的改变随之减弱。

细胞周期结果也支持上述判断。E. coli-OMVs 与细胞共孵育后，C6 细胞 G0/G1 期比例升高，S 期比例降低，提示细胞由 G1 期进入 S 期的过程受到影响。CPZ 预处理后，G0/G1 期细胞比例较 E. coli-OMVs 组下降，S 期细胞比例回升。结合 EdU、PCNA 和 Ki67 结果可以看出，E. coli-OMVs 对 C6 细胞增殖的抑制并不是单一指标的变化，而是表现为 DNA 合成减少、增殖标志物下调以及细胞周期分布改变等多个层面的共同变化。

Wnt/β-catenin 通路与细胞增殖和细胞周期推进密切相关^［23］。其下游靶蛋白 cyclin D1 和 c-Myc 可参与 G1/S 期转换和增殖相关基因表达调控。已有研究提示，Wnt/β-catenin 通路异常激活与胶质瘤细胞增殖及恶性进展密切相关，同时该通路也可作为外源性刺激（包括微生物来源组分或囊泡样结构）调控肿瘤细胞增殖行为的潜在作用靶点^［24］。本研究结果显示，E. coli-OMVs处理后β-catenin、Cyclin D1 和 c-Myc 蛋白表达均明显降低；CHIR99021 单独处理可上调上述蛋白表达；而在 CHIR99021+E. coli-OMVs组中，β-catenin、cyclin D1和c-Myc表达较E. coli-OMVs组回升。该结果提示，E. coli-OMVs 对胶质瘤细胞增殖相关蛋白的抑制与 Wnt/β-catenin 信号通路调控有关。

E. coli-OMVs 被细胞摄取后如何去影响细胞内信号通路与增殖网络，目前本研究还处在初步探索阶段。E. coli-OMVs 本身含有多种生物活性成分，包括外膜蛋白、脂多糖、脂蛋白、核酸及小RNA等^［25］，也可能携带代谢酶、毒力相关分子等活性成分^［26］。这些成分进入细胞后可能通过多条信号通路共同影响细胞周期和增殖状态^［27］。因此，Wnt/β-catenin 通路可能是其中重要机制之一，但并不能排除 NF-κB、MAPK、p53/p21 等其他通路共同参与^{［28， 29］}。

本研究中CPZ并未完全恢复所有效应，也说明除网格蛋白介导内吞外，可能仍存在其他摄取途径，如小窝/洞蛋白介导内吞^［30］，借助巨胞饮形成更大尺度的膜褶皱吞入囊泡^［31］或特定膜微区进行膜融合等^［32］。

在体内实验中，本研究采用 C6-Luc 原位胶质瘤模型进行活体成像监测。C6-Luc 细胞稳定表达荧光素酶，在给予底物后可产生生物发光信号，其发光强度在一定范围内与体内存活肿瘤细胞数量及肿瘤负荷呈正相关。因此，通过连续检测同一动物不同时间点的荧光信号变化，可实现对脑内肿瘤生长过程的无创、动态监测^［33］。考虑到原位成瘤模型中不同动物初始肿瘤负荷可能存在个体差异，本研究进一步采用 Day4/Day1 和 Day7/Day1 的相对荧光值进行分析，从而在一定程度上减少初始荧光差异对结果判读的影响，更适合反映各组肿瘤生长速度的变化。结果显示，E. coli-OMVs 各给药组相对荧光值均低于 PBS 对照组，且随给药剂量增加而逐渐降低，提示 E. coli-OMVs 可减缓原位胶质瘤的生长，其中高剂量组抑制作用最明显。

鼻腔给药是本研究体内实验的一个重要设计。对于中枢神经系统疾病而言，鼻腔给药具有操作相对简便、侵袭性较低，并有望通过鼻-脑通路提高脑部递送效率等优势^［34］。原位胶质瘤位于脑内，常规外周给药方式易受血脑屏障限制，而鼻腔给药为 E. coli-OMVs 进入脑部并发挥局部抗肿瘤作用提供了可能。本研究结果显示，不同剂量 E. coli-OMVs 鼻腔给药均可在一定程度上抑制脑内肿瘤生长，说明该给药方式具有一定可行性。与此同时，给药期间各组大鼠体重未见明显差异，提示在本研究给药剂量和观察周期内，E. coli-OMVs 鼻腔给药总体耐受性较好，未引起明显的全身状态恶化。

HE 染色及免疫组织化学结果进一步从组织学层面对活体成像结果进行了验证。HE 染色显示，PBS 组脑组织内可见明显肿瘤组织，肿瘤细胞排列较致密；E. coli-OMVs 给药组肿瘤组织中细胞密度降低、排列相对疏松，且随剂量增加上述变化更为明显。与此同时，免疫组化结果显示，E. coli-OMVs 给药后肿瘤组织中 PCNA 和 Ki67 阳性表达降低，其中高剂量组下降更为明显。PCNA和Ki67是经典的增殖相关标志物，前者与DNA复制密切相关，后者反映细胞增殖活性。本研究中二者在体内水平的下降，与体外实验中E. coli-OMVs下调PCNA、Ki67的结果一致，说明E. coli-OMVs对胶质瘤的抑制作用主要表现为对肿瘤细胞增殖能力的削弱。

结合体外实验结果可以看出，E. coli-OMVs 对胶质瘤的抑制作用在体内外具有较好一致性。体外实验中，E. coli-OMVs可降低EdU阳性率、下调PCNA和 Ki67 表达并影响细胞周期分布；体内实验中，则表现为脑内肿瘤生长减缓及肿瘤组织中 PCNA、Ki67 表达降低。

但是本研究主要观察了短期给药后肿瘤生长抑制及体质量变化，尚未对 E. coli-OMVs 在体内的分布、代谢过程、长期安全性、免疫反应、最佳给药频率以及生存获益进行系统评价。后续仍需进一步结合体内示踪、安全性评价、药代动力学及生存分析，系统阐明 E. coli-OMVs 鼻腔给药用于胶质瘤治疗的应用潜力。

综上，本研究表明，E. coli-OMVs 可被 C6 胶质瘤细胞摄取，并通过降低 EdU 阳性率、下调 PCNA 和 Ki67 表达、改变细胞周期分布，抑制胶质瘤细胞体外增殖。CPZ 可减弱 E. coli-OMVs 的细胞摄取及其抗增殖效应，说明囊泡进入细胞是其发挥作用的重要环节。进一步结果提示，E. coli-OMVs 对胶质瘤细胞增殖的调控与 Wnt/β-catenin 信号通路及其下游cyclin D1、c-Myc 表达变化有关。另外，E. coli-OMVs 鼻腔给药可在体内抑制原位胶质瘤生长，并降低肿瘤组织中增殖相关蛋白 PCNA 和 Ki67 的表达，为 E. coli-OMVs 作为潜在抗胶质瘤生物治疗策略提供了实验依据。

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