六味地黄丸通过CLCF1/NFATc1调控破骨细胞膜融合治疗小鼠绝经后骨质疏松症

Liuwei Dihuang Pill regulate osteoclast membrane fusion to improve postmenopausal osteoporosis in mice: the CLCF1/NFATc1 signaling axis as a therapeutic target

摘要

目的 探讨六味地黄丸（LWDHW）通过心肌营养蛋白样细胞因子1（CLCF1）/活化T细胞核因子1（NFATc1）调控破骨细胞膜融合治疗绝经后骨质疏松症（PMOP）的作用机制。 方法 将C57小鼠分为假手术组、模型组、治疗组，10只/组，去势模拟绝经后骨质疏松症并灌胃六味地黄丸治疗。将RAW264.7细胞分为对照组（空白血清）、模型组（核因子κB受体活化因子配体（RANKL）+空白血清）、治疗组（RANKL+六味地黄丸含药血清），用RANKL诱导为破骨细胞并用六味地黄丸含药血清干预。si-CLCF1慢病毒转染敲低细胞中CLCF1表达，将细胞分为空载体（si-NC）组、si-NC+LWDHW组、si-CLCF1组、si-CLCF1+LWDHW组。骨密度分析系统检测各组小鼠骨密度；抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）染色观察各组破骨细胞和胫骨组织中破骨细胞成熟情况；鬼笔环肽免疫荧光观察计算各组细胞膜融合效率及纤丝状肌动蛋白（F-actin）环形成；实时聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹试验检测各组胫骨组织和细胞中CLCF1、NFATc1、树突状细胞特异性跨膜蛋白（DC-STAMP）、破骨细胞刺激跨膜蛋白（OC-STAMP）和空泡型ATP酶V0结构域2（ATP6V0D2）基因和蛋白表达。 结果 六味地黄丸治疗可增加PMOP小鼠骨密度，减少破骨细胞成熟，降低破骨细胞融合效率（P<0.05），减少F-actin环形成。与模型组相比，六味地黄丸干预可升高胫骨组织和细胞中CLCF1基因和蛋白表达（P<0.05），降低NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2基因和蛋白表达（P<0.05）。与si-CLCF1组相比，si-CLCF1+LWDHW组六味地黄丸含药血清干预后破骨细胞融合效率下降（P<0.05），F-actin环形成减少，NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2基因和蛋白表达降低（P<0.05）。 结论 六味地黄丸可通过上调CLCF1表达，下调NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2表达，调节破骨细胞膜融合防治绝经后骨质疏松症。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Liuwei Dihuang Pill (LWDHW) for improving postmenopausal osteoporosis (PMOP). Methods Thirty female C57BL/6 mice were randomized equally into sham-operated group, PMOP model group, and LWDHW treatment group. The mice in the latter two groups underwent ovariectomy to simulate PMOP, followed by gavage of normal saline and LWDHW (twice daily) for 60 days, respectively. Bone mineral density (BMD) of the mice was detected, and TRAP staining was used to observe osteoclast and osteoclast maturation in the tibia tissue. In RANKL-induced RAW264.7 cells with or without lentivirus-mediated CLCF1 knockdown, the effects of incubation with normal rat serum or LWDHW-medicated rat serum on cell membrane fusion rate and F-actin loop formation were observed using immunofluorescence staining with phalloidin peptide; the mRNA and protein expressions of CLCF1, NFATc1, DC-STAMP, OC-STAMP and ATP6V0D2 were detected using RT-qPCR and Western blotting. Results In PMOP mice, LWDHW treatment significantly increased BMD, reduced osteoclast maturation, osteoclast membrane fusion rate, and F-actin ring formation, upregulated the mRNA and protein expressions of CLCF1 in tibial tissues, and lowered the expressions of NFATc1, DC-STAMP, OC-STAMP and ATP6V0D2. In RANKL-induced RAW264.7 cells with CLCF1 knockdown, treatment with LWDHW-medicated rat serum significantly decreased osteoclast membrane fusion rate, F-actin ring formation, and the expressions of NFATc1, DC-STAMP, OC-STAMP and ATP6V0D2. Conclusion LWDHW improves PMOP in mice by regulating osteoclast membrane fusion through upregulating CLCF1 expression and downregulating NFATc1, DC-STAMP, OC-STAMP and ATP6V0D2 expressions.

Graphical abstract

关键词

六味地黄丸 / 绝经后骨质疏松症 / 破骨细胞 / 膜融合

Key words

Liuwei Dihuang Pill / postmenopausal osteoporosis / osteoclasts / membrane fusion

绝经后骨质疏松症（PMOP）是常见于中老年女性的代谢性骨病，临床表现为骨痛、关节畸形和局部红肿痛或叩击痛等症状^［1］，严重者在日常提重物活动甚至剧烈咳嗽都可能引发骨折^［2］。其病理机制是由于女性绝经后导致雌激素水平骤降引发骨吸收-形成失衡，引发骨脆性增加、骨量减少和骨微结构破坏^{［3， 4］}。从微观层面看，该病发展与破骨细胞对骨组织的骨侵蚀作用密不可分^［5］，现代医学研究揭示，破骨细胞的骨侵蚀能力可反映在细胞核的数量，由多个单核或多核破骨前体细胞经膜融合形成的多核破骨细胞极大增强了破骨活性，膜融合是破骨前体细胞分化为成熟破骨细胞的重要生理过程^［6］。课题组前期研究表明，心肌营养蛋白样细胞因子1（CLCF1）与破骨细胞的破骨活性增强相关^［7］，敲除小鼠破骨前体细胞中CLCF1会减少骨密度^［8］。活化T细胞核因子1（NFATc1）可通过调节细胞膜融合相关因子促进膜融合从而增强破骨活性加快PMOP病理进程^［9］，但其是否受CLCF1调控从而影响破骨细胞膜融合的调控机制尚未完全阐明。

中医学将PMOP其归因于“肾精亏虚，髓枯骨痿”的阴阳失衡状态。六味地黄丸作为滋阴补肾的经典方剂，其“三补三泻”的组方思想不仅契合“肾主骨”理论，更通过多靶点调控展现出独特的治疗优势。近年来研究发现，该方能降低破骨活性，从而改善骨代谢紊乱^［10］，但其是否可通过调控膜融合影响PMOP病理进程尚未可知。基于此，本文从细胞膜融合角度阐述CLCF1/NFATc1信号轴调控破骨细胞分化的具体机制及六味地黄丸的干预作用，为中医药治疗PMOP提供新思路。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞和动物

小鼠巨噬细胞RAW264.7购买于上海赛百慷公司（批号：2024073001）。含药血清制备用12周龄SPF级雄性SD大鼠20只，体质量250~290 g，动物实验用4周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠30只，体质量18~20 g，实验动物购自北京华埠康生物科技股份有限公司［许可证号：SCXK（京）2019-0008］，本实验方案通过福建省中医药科学院实验动物管理委员会伦理审查（伦理批号：FJATCM-IAEC2023012）。

1.1.2 药物与试剂

六味地黄丸浓缩丸（同仁堂）；胎牛血清（Sigma）；高糖DMEM培养基（Gibco）；si-CLCF1慢病毒载体构建（上海吉凯基因科技有限公司）NFATc1抗体、二抗、鬼笔环肽CoraLite594-Phalloidin、DAPI染色液（武汉三鹰生物科技）；树突状细胞特异性跨膜蛋白（DC-STAMP）抗体（Sigma）；CLCF1抗体（Affinity）；破骨细胞刺激跨膜蛋白（OC-STAMP）抗体（Immunoway）；空泡型ATP酶V0结构域2（ATP6V0D2）抗体（Novus Biologicals）；RANKL/TNFSF11蛋白（MCE）；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒（索莱宝科技）；逆转录试剂盒、QPCR试剂盒（诺唯赞生物技术）；引物合成（福州尚亚生物技术）。

1.1.3 仪器

荧光倒置显微镜（Leica）；实时荧光定量基因扩增仪、化学发光成像系统、梯度PCR仪（Bio-Rad）；高速低温离心机（艾本德）；酶标仪（Thermo fisher）；蓝箭快转仪（广州道一科学技术）；骨密度分析系统（KUBTEC）；正置显微镜（重庆奥特）；石蜡切片机（德国徕卡）。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清制备

将大鼠随机分为空白血清组和六味地黄丸含药血清组，10只/组。六味地黄丸含药血清组给药参照“人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值”^［11］，生药浓度为1.8 kg/L水溶液灌胃，空白血清组则灌胃等量的生理盐水，两组均每日灌胃2次，末次灌胃2 h后用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠并进行腹主动脉采血，3000 r/min离心15 min分离血清并置于水浴锅56 ℃灭活30 min后0.22 μm针头滤器过滤备用。将血清制备成含20%空白血清DMEM高糖培养基和含20%六味地黄丸含药血清DMEM高糖培养基，用于后续细胞培养。

1.2.2 动物实验

将C57BL/6小鼠分为假手术组、模型组、治疗组（LWDHW组），10只/组。假手术组打开腹腔切除卵巢周围脂肪组织，模型组和治疗组打开腹腔行卵巢切除术模拟绝经后骨质疏松症，造模后每只小鼠每天注射2万U青霉素预防感染，连续注射3 d，4周后用骨密度分析系统鉴定PMOP模型是否成功。模型鉴定成功后灌胃治疗，治疗组灌胃六味地黄丸，浓度为1.8 kg/L，假手术组和模型组灌胃等量的生理盐水，灌胃2次/d，连续灌胃60 d后进行后续实验检测。

1.2.3 骨密度测定

小鼠灌胃60 d后，小鼠禁食不禁水饲养12 h，用三溴乙醇诱导麻醉后，采用动物双能X线骨密度分析仪进行全身骨密度（BMD）测量，每只小鼠检测3次取平均值作为最终实验结果。

1.2.4 CLCF1慢病毒转染预实验

根据吉凯慢病毒使用手册，将细胞分为常规培养、A转染增强液和P转染增强液3种方式，每种方式分别设置3个不同浓度病毒对应MOI=10、50、100，转染12 h后继续培养48 h，根据荧光显微镜下EGFP荧光蛋白表达占比达80%以上确定合适的CLCF1慢病毒转染浓度和转染增强液。而后根据预实验结果用Western blotting检测si-CLCF1-1、si-CLCF1-2、si-CLCF1-3 3种慢病毒对CLCF1表达的敲低效果。

1.2.5 细胞分组及干预

实验一：将细胞分为对照组，模型组，治疗组（LWDHW），模型组和治疗组用RANKL100 ng/mL干预3 d，而后对照组和模型组加入20%空白血清干预24 h，治疗组加入20%六味地黄丸含药血清干预24 h，各组用对应方式干预后进行后续实验室检测。实验二：将细胞分为si-NC组（si-NC+RANKL+空白血清）、si-NC+LWDHW组（si-NC+RANKL+六味地黄丸含药血清）、si-CLCF1组（si-CLCF1+RANKL+空白血清）、si-CLCF1+LWDHW组（si-CLCF1+RANKL+六味地黄丸含药血清），其中si-NC组和si-NC+LWDHW组转染si-NC阴性对照病毒，si-CLCF1组和si-CLCF1+LWDHW组转染si-CLCF1病毒敲低CLCF1表达，转染条件根据预实验结果设置。转染后各组用RANKL100 ng/mL诱导3 d，而后si-NC组和si-CLCF1组用20%空白血清干预24 h，si-NC+LWDHW组和si-CLCF1+LWDHW组用20%六味地黄丸含药血清干预24 h，各组用对应方式干预后进行后续实验室检测。

1.2.6 TRAP染色

细胞：将细胞用TRAP染色固定液固定，经PBS缓冲液漂洗后加入TRAP孵育液并置于37 ℃恒温箱孵育1 h，PBS漂洗后置于倒置相差显微镜观察拍照。动物组织：将胫骨固定后脱钙30 d，而后进行石蜡包埋并切片，脱蜡复水后进行TRAP染色，清洗后染苏木素并流水冲洗返蓝，封片后镜下拍照。

1.2.7 鬼笔环肽免疫荧光

将细胞用4%多聚甲醛固定液室温固定1 h，0.5%曲拉通室温通透细胞20 min，鬼笔环肽CoraLite594-Phalloidin孵育液避光孵育1 h，PBS清洗细胞后加入抗荧光猝灭剂（含DAPI），而后荧光倒置显微镜下拍摄，Image J分析细胞膜融合效率及F-肌动蛋白环形成情况，膜融合率计算公式为融合事件总数/视野内所有细胞核总数，融合事件总数=Σ（Ni）-Nsym，其中Ni为多核细胞中的细胞核数，Nsym为视野内多核细胞的数量，多核细胞为胞内≥3个细胞核^［12］。

1.2.8 Real-time PCR检测膜融合相关基因表达情况

Tizol法提取各组细胞和胫骨组织总RNA，紫外分光光度计检测RNA纯度260 nm/280 nm的比值在1.8~2.0表示RNA纯度较为良好，逆转录试剂盒逆转为cDNA，而后进行定量聚合酶链反应，条件为：95 ℃预变性10 s；95 ℃，5 s，60 ℃，20 s，持续40个循环。以GAPDH为内参，用2^-∆∆ct法计算各指标相对表达。引物序列见表1。

1.2.9 Western blotting检测膜融合相关蛋白表达情况

各组细胞和胫骨组织用RIPA裂解提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶电泳分离各指标蛋白，半湿转至PVDF膜，室温封闭1 h，过夜孵育各指标抗体，各抗体浓度分别为CLCF1（1∶500）、NFATc1（1∶2000）、DC-STAMP（1∶1000）、OC-STAMP（1∶500）、ATP6V0D2（1∶500）、GAPDH（1∶1000），洗涤后孵育二抗1 h，洗涤后用ECL显影液曝光显影，用Image Lab对条带进行统计分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料满符合正态分布用单因素方差分析进行统计，方差齐使用LSD检验进行两两比较，方差不齐使用Games-Howell检验进行比较，结果用均数±标准差表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 六味地黄丸对骨密度及破骨细胞活性的影响

与假手术组相比，模型组中骨密度降低，Trap染色显示胫骨中破骨细胞着色明显增多，骨小梁变细、变稀疏，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，治疗组骨密度上升，破骨细胞着色明显减少，骨小梁变粗、变密集，差异具有统计学意义（P<0.05，图1、表2）。

2.2 六味地黄丸对胫骨中膜融合相关基因和蛋白表达的影响

与假手术组相比，模型组中CLCF1mRNA和蛋白表达下降，NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP-6V0D2 mRNA和蛋白表达上升，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，治疗组CLCF1mRNA和蛋白表达上升，NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2 mRNA和蛋白表达下降，差异均具有统计学意义（P<0.05，图2、3）。

2.3 TRAP染色观察破骨细胞的成熟情况

对照组未见多核破骨细胞形成及TRAP染色着色。与对照组相比，模型组可见较大破骨细胞形成，F-actin环面积上升，多核细胞内核数增多，融合事件发生率上升（P<0.05），有明显TRAP染色着色，说明RANKL可诱导破骨细胞。与模型组相比，治疗组破骨细胞生成减少，F-actin环面积下降，多核细胞内核数减少，融合事件发生率下降（P<0.05），且TRAP染色着色减少，说明六味地黄丸含药血清可降低膜融合率，减少破骨细胞形成，减缓破骨细胞成熟（图4、5）。

2.4 六味地黄丸对破骨细胞膜融合相关基因和蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组中CLCF1mRNA和蛋白表达下降，NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP-6V0D2 mRNA和蛋白表达上升，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与模型组相比，治疗组CLCF1mRNA和蛋白表达上升，NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2 mRNA和蛋白表达下降，差异均具有统计学意义（P<0.05，图6、7）。

2.5 CLCF1敲低慢病毒转染细胞有效条件及表达敲低验证

CLCF1敲低慢病毒转染RAW264.7细胞，加入病毒及相应转染增强液转染12 h后，更换为完全培养基，继续培养48 h时荧光显微镜下观察。在常规培养和使用转染液P且MOI=10、50、100，转染效率均不足80%，使用A转染液且MOI=10、50，转染效率均不足80%。而当使用A转染增强液且MOI=100时，转染效率可达80%以上。所以CLCF1敲低慢病毒的有效转染条件为MOI=100，添加转染增强液A，转染后换液时间为12 h，继续培养时间为48 h（图8）。

Western blotting结果显示，与si-NC组相比，si-CLCF1-1组、si-CLCF1-2组、si-CLCF1-3组的CLCF1蛋白表达都有所下降，但si-CLCF1-1组差异无统计学意义（P>0.05），si-CLCF1-2组和si-CLCF1-3组差异有统计学意义（P<0.05）；与si-CLCF1-2组相比，si-CLCF1-3组CLCF1蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）。最后选用si-CLCF1-2组慢病毒用于CLCF1表达敲低（图9）。

2.6 CLCF1敲低表达对破骨细胞膜融合率的影响

与si-NC组比较，si-NC+LWDHW组多核细胞内核数减少，F-actin环面积下降，膜融合事件发生率降低，差异具有统计学意义（P<0.05），si-CLCF1组多核细胞内核数增多，F-actin环面积上升，膜融合事件发生率上升，差异具有统计学意义（P<0.05）。与si-NC+LWDHW组相比，si-CLCF1+LWDHW组多核细胞内核数增多，F-actin环面积上升，膜融合事件发生率升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。与si-CLCF1组相比，si-CLCF1+LWDHW组多核细胞内核数减少，F-actin环面积降低，膜融合事件发生率降低，差异具有统计学意义（P<0.05，图10、11、12）。

2.7 CLCF1敲低表达对膜融合相关基因和蛋白表达的影响

与si-NC组比较，si-NC+LWDHW组NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2 mRNA和蛋白表达降低，si-CLCF1组NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2 mRNA和蛋白表达升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。与si-NC+LWDHW组相比，si-CLCF1+LWDHW组NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2 mRNA和蛋白表达升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。与si-CLCF1组相比，si-CLCF1+LWDHW组NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2 mRNA和蛋白表达降低，差异均具有统计学意义（P<0.05，图13、14）。

3 讨论

PMOP是表现为骨量降低、骨脆性增加、骨微结构损坏的一种全身性慢性骨骼疾病，是在生物学、力学等因素共同作用下导致成骨破骨偶联失衡的结果^［13］。破骨前体细胞膜融合为破骨巨细胞使得骨侵蚀增强可加快PMOP病理进程。细胞膜与细胞膜之间发生融合发生在许多细胞和组织中，包括巨噬细胞谱系，如破骨细胞和异物巨细胞，以及胎盘、精子和卵子、成肌细胞^{［14， 15］}。在骨微环境中骨髓源单核巨噬细胞游离在关节腔中，在受到细胞因子刺激的情况下，聚集融合成破骨前体细胞，并逐渐分化为成熟的破骨细胞，膜融合过程涉及到多条信号通路的调控^［16］。单核巨噬细胞对骨组织的分解代谢十分有限，经过膜融合后多个单核巨噬细胞或多核细胞融合成为含有数个至数十个细胞核的破骨前体细胞，发展为成熟破骨细胞后其降解骨组织的能力极大增强^{［17， 18］}。小鼠的破骨细胞平均拥有5个细胞核，而在骨质疏松环境下破骨细胞的数量以及每个破骨细胞内的核数均上升，多核化是破骨细胞分化的核心，这一表现使得骨组织的降解加速^［19］。根据TRAP染色结果可以看出RANKL诱导的破骨细胞或小鼠去势诱导后的胫骨组织出现明显着色，而经过六味地黄丸含药血清干预或灌胃后明显着色减少，说明抗酒石酸酸性磷酸酶的生成减少，侧面反映出破骨细胞减少，即六味地黄丸可减缓破骨细胞成熟。从F-actin荧光图亦可以看出经过六味地黄丸含药血清干预后细胞F-actin环面积减少，膜融合率降低，说明了六味地黄丸可能通过减少膜融合抑制破骨细胞分化成熟。破骨细胞减少可有效减少骨丢失，骨密度测量结果显示六味地黄丸治疗后的小鼠骨密度相比于模型组更高，同时胫骨组织Trap染色显示治疗组的骨小梁粗细及密度均优于模型组，体现出六味地黄丸对POMP有较好的疗效。

NFATc1是破骨发生的重要转录因子，可受RANKL信号传导的激活，在破骨细胞逐渐成熟发生融合过程中是必要的，具有明显的组织特异性^［20］。激活蛋白-1在受到RANKL的激活后与NFATc1的启动子区域结合，诱导NFATc1的表达^{［21， 22］}，同时NFATc1也可通过本身的扩增而出现级联效应从而不断增多^［23］，相关研究表明NFATc1沉默后可减弱DC-STAMP和ATP6V0D2的表达及破骨细胞融合，而DC-STAMP和ATP6V0D2的过表达又可重现破骨细胞的多核化表型^［24］，同时通过基因芯片发现NFATc1又可以直接结合到OC-STAMP上的结合位点影响OC-STAMP的表达从而影响膜融合，在巨噬细胞中给药FK506（NFATc1抑制剂），可完全抑制OC-STAMP的表达^［25］，说明NFATc1、OC-STAMP、DC-STAMP和ATP6V0D2是调控破骨细胞融合的关键影响因子，且可受到RANKL诱导^［26］。CLCF1是一种与绝经后骨质疏松症相关的免疫相关因子，其表达降低与骨量减少相关，在绝经后骨质疏松症模型小鼠体内注射CLCF1可有效提升骨密度和改善骨微结构，在RANKL刺激的RAW264.7中添加CLCF1可以剂量依赖的方式显著抑制破骨细胞的分化^［27］。根据实验结果可以看出，经过RNAKL诱导的破骨细胞或小鼠去势诱导后的模型组胫骨组织中，CLCF1基因和蛋白表达减少NFATc1、OC-STAMP、DC-STAMP和ATP6V0D2基因和蛋白表达增多，膜融合率升高，破骨细胞细胞核明显增多，细胞膜融合率上升，说明膜融合率升高介导的细胞核增多在破骨细胞成熟中具有重要作用。经过六味地黄丸干预后，CLCF1基因和蛋白表达增多，NFATc1、OC-STAMP、DC-STAMP和ATP6V0D2基因和蛋白表达下降，与之对应的破骨细胞内核数量明显减少，膜融合率降低，说明了六味地黄丸对破骨细胞膜融合因子有调控作用，从而发挥治疗POMP的作用。

课题组前期研究表明CLCF1基因调节破骨细胞的形成又与调控RANKL/OPG比值有关^［28］，同时NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2的表达又受到RANKL信号传导的影响。故而CLCF1与NFATc1可能作为信号分子影响破骨细胞膜融合。结合本研究实验结果，经过CLCF1敲低病毒干预后NFATc1表达明显上升，说明CLCF1可调控RANKL诱导下的破骨细胞膜融合因子，从而影响破骨细胞成熟，这与Yokota等^［27］学者的研究结果相似。在CLCF1敲低表达后，与阴性病毒组别相比，CLCF1敲低后NFATc1、OC-STAMP、DC-STAMP和ATP6V0D2在CLCF1表达上升，说明CLCF1可通过NFATc1调控下游膜融合相关因子，膜融合率上升和F-actin环面积增加则侧面印证了CLCF1可调控破骨细胞膜融合。相较于阴性病毒组别中六味地黄丸含药血清的干预作用，CLCF1敲低病毒组别中经过六味地黄丸含药血清干预处理后膜融合相关因子NFATc1、OC-STAMP、DC-STAMP和ATP6V0D2表达下降幅度减少，说明六味地黄丸含药血清对CLCF1/NFATc1信号轴的调控有一定依赖作用，但CLCF1/NFATc1信号轴并不是唯一途径，此结论与中药多靶点的情况一致，也侧面体现了中药复方治疗PMOP多层次的复杂作用机制。

综上所述，六味地黄丸可通过上调CLCF1表达，下调NFATc1、DC-STAMP、OC-STAMP和ATP6V0D2表达，调节破骨细胞膜融合减轻绝经后骨质疏松症。本课题组后续将以此为基础继续探索六味地黄丸治疗PMOP的作用机制。

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基金资助

国家自然科学基金(82374483)

国家自然科学基金(82274563)

国家中医药管理局高水平中医药重点学科建设项目(zyyzdxk-2023106)

福建中医药大学中医骨伤科学学科开放课题(XGS2023011)

福建省省属公益类科研院所基本科研专项项目(2024R1003008)

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