无忧汤通过激活Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡减轻慢性睡眠剥夺模型大鼠海马神经元损伤并改善突触可塑性

Wuyou Decoction alleviates hippocampal neuronal injury and improves synaptic plasticity in rats with chronic sleep deprivation by inhibiting ferroptosis via activating the Nrf2/HO-1 pathway

摘要

目的 探讨中药方剂无忧汤对慢性睡眠剥夺（CSD）模型大鼠抑制铁死亡改善海马神经元损伤，保护突触可塑性的作用机制。 方法 将50只SD大鼠随机分为正常组，模型组及无忧汤低、中、高剂量组，10只/组。除正常组外，其余各组大鼠通过水平台睡眠剥夺法建立CSD模型，包括7 d适应性造模及21 d正式造模，并于正式造模开始同步灌胃给药28 d。之后使用莫里斯水迷宫评估认知功能，通过HE染色、尼氏染色和高尔基染色以及免疫荧光评估海马病理学和突触结构。使用透射电子显微镜、铁测定法和生化试剂盒定量铁和氧化应激标志物Fe²⁺、超氧化物歧化酶、丙二醛、谷胱甘肽（GSH）、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）。通过蛋白质印迹法检测参与铁调节和铁死亡蛋白铁蛋白重链1、转铁蛋白受体1、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、谷胱甘肽过氧化物酶4、核因子E2相关因子2（Nrf2）、血红素加氧酶1（HO-1）的表达，采用分子对接技术探索无忧汤成分与铁死亡相关蛋白之间的相互作用。 结果 与正常组相比，模型组大鼠水迷宫逃避潜伏期增加，平台穿越次数及目标象限停留时间均缩短（P<0.01）。神经元结构变差，数目减少，突触结构受损（P<0.01）。增加氧化应激水平及铁沉积，同时上调Nrf2、HO-1的表达（P<0.01）。与模型组相比，无忧汤中剂量组改善了CSD大鼠的空间学习和记忆能力，莫里斯水迷宫中逃逸时间更短和平台穿越次数更高（P<0.01）。无忧汤中剂量组减轻了神经元退化，恢复了突触结构，并减少了海马体中的线粒体损伤（P<0.01，P<0.05）。无忧汤中剂量组减少铁的积累并缓解了CSD大鼠模型中的氧化应激（P<0.01），提高铁死亡相关标志物的表达，并上调Nrf2、HO-1基因表达（P<0.01，P<0.05）。 结论 无忧汤通过抑制铁死亡、减少神经元损伤以及通过激活Nrf2/HO-1信号通路增强突触修复，减轻了慢性睡眠剥夺引起的认知障碍，而中剂量效果最佳，这可能由于低剂量达不到作用阈值，高剂量超过阈值后，疗效反而可能减弱或出现不良反应有关。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of Wuyou Decoction (WYD) for ameliorating hippocampal neuron damage and protecting synaptic plasticity in rats with chronic sleep deprivation (CSD). Methods Fifty SD rats were randomly divided into normal control group, CSD model group, and low-, medium-, and high-dose WYD treatment groups (n=10). Except for those in the control group, all the rats were subjected to CSD modeling using the horizontal platform method. Cognitive function of the rats was assessed with Morris water mazetest, and hippocampal pathology, synaptic structure, iron content, oxidative stress markers, and ferroptosis-related protein expressions were evaluated. Molecular docking study was performed to explore the interactions between WYD components and ferroptosis-related proteins. Results CSD induced significant cognitive impairment and neuronal and synaptic damage in the rat models, causing also increased oxidative stress and iron deposition and upregulated Nrf2 and HO-1 expressions. Treatment with WYD, especially at the medium dose, significantly improved learning and memory abilities of the rat models, alleviated neuronal degeneration, restored synaptic structure, reduced iron accumulation and oxidative stress, and upregulated ferroptosis-related markers as well as Nrf2 and HO-1 expressions. Conclusion WYD, optimally at the medium dose, alleviates CSD-induced cognitive impairment in rats by inhibiting ferroptosis, reducing neuronal damage, and enhancing synaptic repair via activation of the Nrf2/HO-1 signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

无忧汤 / 慢性睡眠剥夺 / 神经元损伤 / 铁死亡 / Nrf2/HO-1信号通路

Key words

Wuyou Decoction / chronic sleep deprivation / neuron damage / ferroptosis / Nrf2/HO-1 signaling pathway

睡眠对于健康和认知功能至关重要，失眠或长期睡眠剥夺会对身体和心理健康造成严重影响。有研究表明，慢性睡眠剥夺不仅导致认知功能下降、情绪异常等问题还会增加患阿尔茨海默病的风险^{［1， 2］}。目前，认知行为疗法被认为是治疗睡眠障碍相关认知损害的一种有效策略，但现有药物仍无法完全解决这一问题^{［3， 4］}。因此，深入研究慢性睡眠障碍（CSD）的发病机制并开发更有效的治疗方案，对提升整体健康水平具有关键意义。

铁死亡是一种以铁依赖性脂质过氧化为特征的细胞死亡形式，其发生与线粒体功能障碍和铁代谢紊乱密切相关^{［5， 6］}。有研究观察到，CSD可以诱发铁死亡^［7］。在铁死亡过程中，谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）作为关键调控酶，功能受损会进一步放大脂质过氧化的损害效应，最终导致神经元丢失、突触损伤以及认知功能的显著下降^{［8， 9］}。研究表明，调控铁代谢和GPX4通路的平衡，有望减轻慢性睡眠剥夺对神经系统的损伤，延缓认知功能的退化，为相关疾病的防治提供潜在的新靶点^［10］。

核因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶1（HO-1）通路在调控细胞内稳态方面具有关键作用，与慢性睡眠剥夺导致的铁死亡密切相关^［11］。慢性睡眠剥夺通过加剧铁稳态紊乱，诱发铁死亡，而铁死亡的发生进而引发神经元丢失、突触损伤和认知功能下降^{［9， 11， 12］}。研究显示，Nrf2能够上调HO-1的表达，增强抗氧化能力，减少活性氧积累，抑制脂质过氧化的发生，从而有效缓解铁死亡带来的细胞损伤^{［13， 14］}。此外，Nrf2还可通过调控GPX4和溶质载体家族7成员11（SLC7A11），进一步抑制铁死亡的病理进程^［15］。前期研究中发现，无忧汤具有改善慢性睡眠剥夺大鼠认知水平，改善海马神经元损伤的作用^［16］。但无忧汤是否可以通过Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡减轻CSD模型大鼠海马神经元损伤及保护突触可塑性的机制尚不可知，故本文通过实验进行验证。

1 材料和方法

1.1 实验动物

2月龄SPF级雄性SD大鼠50只，体质量180~200 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号SCXK（辽）2020-0001。大鼠饲养在湖北民族大学风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，所有大鼠可自由进食和饮水。大鼠饲养环境保持在22~25 ℃，相对湿度50%~70%，设有独立通风系统，给予实验大鼠良好的生活环境。本实验已获得湖北民族大学实验动物伦理委员会批准（伦理批号：2023082）。

1.2 药物及试剂

无忧汤由白芍20 g、当归20 g、竹茹12 g、炒酸枣仁12 g、人参12 g组成，饮片购于安徽群康药业科技有限公司，按照先前的实验研究^{［16，17］}，得到3个剂量组：3.99、7.98、15.96 g/kg。煎煮完毕放置4 ℃保存，备用。由于现有阳性药物对CSD引起的认知功能障碍改善作用有限，难以针对该病理特点发挥相应疗效，因此本研究未设置阳性药对照组。

试剂转铁蛋白受体1（TfR1）、铁蛋白重链1（FTH1）、HO-1、GPX4、SCL7A11、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）（成都正能生物有限公司）；Nrf2、β-actin（武汉塞维尔生物有限公司）；PSD95、SYN1（爱博泰克生物有限公司）；Fe²⁺、谷胱甘肽（GSH）、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽（GSH / GSSG）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒（武汉塞维尔生物有限公司）。

1.3 仪器

自制睡眠剥夺箱（45 cm×55 cm×70 cm）；Morris水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；多功能酶标仪（ThermoFisher）；Image Quant Las4000成像分析仪（GE）；电泳转膜一体机（武汉塞维尔生物技术有限公司）；透射电子显微镜（上海茁彩生物科技有限公司）；光学显微镜（Olympus）。

1.4 动物分组、模型制备及给药

将大鼠随机分为5组：正常组，模型组，无忧汤低、中、高剂量组（WYD-L组、WYD-M组、WYD-H组），10只/组。除正常组外，其他组利用睡眠剥夺箱（内部放置6个连体金属平台）进行睡眠剥夺实验。实验过程中在箱内注满水，保持水面低于平台1 cm，允许大鼠在平台上自由活动。当大鼠将要入睡时肌肉放松，进而掉到水中惊醒，从而达到诱导剥夺睡眠的目的。正常组利用内部不注水的对照箱进行实验，大鼠可以正常睡眠。在所有箱子上放置铁丝网，在铁丝网上放置水与食物并保持箱内清洁。先进行7 d适应性造模，后进行21 d正式造模。正式造模首日结束后进行灌胃，正常组与模型组使用生理盐水灌胃，WYD-L组、WYD-M组、WYD-H组给予相应剂量（3.99、7.98、15.96 g/kg）药物灌胃，灌胃时间共持续28 d。

1.5 Morris水迷宫检测

造模结束后，进行Morris水迷宫检测。把大鼠分别从每个象限的正中贴壁位置放入水中，记录其在60 s内找到隐蔽在水面下面平台的时间，记为逃避潜伏期。若大鼠在允许的时间未找到水下的平台并站在平台上时，操作员将引导大鼠至平台所在位置停留15 s，目的是让大鼠记住平台的位置。此训练1次/d，持续5 d。第6天让大鼠休息，第7天操作人员将水面下的平台移除，每组大鼠均从平台对角象限中间一点贴壁放入，记录每只大鼠在60 s内穿越平台次数、目标象限停留时间，以评估空间记忆和学习效果。

1.6 样本采集

Morris水迷宫检测结束后，大鼠禁食1 d，深度麻醉后断头，冰袋上剥离全脑，取1 m³大小海马组织，固定在电镜固定液中，HE染色、尼氏染色、免疫组化及免疫荧光标本利用4%多聚甲醛进行固定，高尔基染色固定在高尔基染色液中，其余标本装入EP管中，放入-80 ℃保存备用。

1.7 HE染色

脑组织样本制备成石蜡包埋块并切片。切片经过二甲苯脱蜡处理，随后通过梯度乙醇（100%~75%）进行脱水。脱水后，切片用双蒸水冲洗，并依次使用苏木精染色3~5 min和伊红染色5 min。染色完成后，切片以中性树胶封片，随后拍照并使用直立光学显微镜进行分析。

1.8 Nissl染色

石蜡包埋脑组织后制备5 μm连续切片，经二甲苯和梯度乙醇脱蜡处理，尼氏染色20 min，蒸馏水冲洗后二甲苯透明、中性树胶封片，镜检观察并用Image J定量分析海马区尼体数量。

1.9 免疫组化检测神经元特异性核蛋白（NeuN）阳性细胞表达

脑组织经石蜡包埋后制备5 μm切片，依次进行脱蜡、抗原修复及5% BSA封闭。切片经PBS清洗后，先后与NeuN一抗（1∶200）和二抗（1∶100）室温孵育各2 h，DAB显色后封片，显微镜观察并采用ImageJ定量分析NeuN阳性细胞数。

1.10 高尔基染色检测突触的长度及密度

脑组织经高尔基染色处理后，依次进行切片、观察与图像分析。将组织先后浸泡于重铬酸钾与硝酸银混合液及不同浓度硝酸银溶液中进行染色，随后制作100 μm冷冻切片。切片经蒸馏水冲洗、梯度乙醇脱水等常规处理后，于显微镜下观察并拍照，最终使用Image J软件测量神经元树突棘的长度与密度。

1.11 免疫荧光染色检测突触后致密区蛋白95（PSD95）和突触蛋白1（SYN1）的荧光强度

取石蜡包埋的脑组织切片，切成5 μm厚。脱蜡，抗原修复后，滴加一抗PSD95（1∶200）、SYN1（1∶200）4 ℃孵育过夜。滴加二抗（1∶200），室温孵育1 h。洗涤切片，滴加DAB显色液，脱水封片。置于荧光显微镜下，拍照，用ImageJ计算荧光强度。

1.12 透射电镜观察海马线粒体结构

海马组织经1%锇酸固定2 h后，依次进行梯度脱水、树脂渗透包埋和聚合固化。制备70 nm超薄切片，经铅铀双染后于透射电镜下观察线粒体超微结构。

1.13 试剂盒检测Fe²⁺、SOD、MDA、GSH、GSH/GSSG

新鲜海马组织在冰上解剖，并在PBS中匀浆。匀浆液经离心后，获得上清液，遵循制造商提供的方案进行Fe²⁺、SOD、MDA、GSH和GSH/GSSG的检测。

1.14 Western blotting 检测

从-80 ℃迅速取出100 mg海马组织，称质量后置于冰上解冻。加入RIPA裂解液和PMSF，4 ℃匀浆。4 ℃，12 000 r/min离心25 min，取上清液分装，一部分用于BCA法蛋白定量，剩余部分加入5×上样缓冲液；沸水浴煮沸10 min使蛋白变性，-20 ℃保存备用。制备SDS-PAGE凝胶。将样本加入凝胶孔中，进行电泳、转膜、封闭，加入稀释后的一抗：TfR1（1∶500）、FTH1（1∶500）、Nrf2（1∶1000）、HO-1（1∶500）、GPX4（1∶500）、SCL7A11（1∶500）、ACSL4（1∶500）、β-actin（1∶100 000），4 ℃孵育12 h后回收一抗，TBST洗膜，10 min/次，共洗膜3次，洗膜结束后加入二抗［标记有辣根过氧化物酶（HRP）的羊抗兔免疫球蛋白，1∶10 000］，常温下摇床孵育1 h，弃二抗，再次使用TBST洗膜，10 min/次，共洗膜3次，洗膜结束后滴加ECL显影液进行显影，利用ImageJ软件分析蛋白条带灰度值。

1.15 分子对接实验

在前期实验中，通过液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术提取了无忧汤中的主要化合物^［16］。为探究无忧汤主要化合物与通路关键蛋白的结合能力，分别从PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库和美国国家蛋白质数据库（https：//www.rcsb.org/）获取无忧汤主要化合物及其对应蛋白的分子结构。随后使用AutoDockTools软件（版本1.5.6）进行分子对接以评估结合亲和力，并通过PyMOL软件（版本2.5.5）进行可视化分析。当结合能低于-5 kcal/mol时，表明活性化合物与蛋白质结合良好。

1.16 统计学分析

采用SPSS 27.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示。对数据进行正态性检验，符合正态分布的数据组间比较采用单因素方差分析，方差齐性时，多组间比较采用LSD法或Tamhane's T₂法；不符合正态分布则采用Kruskal-Wallis H检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 无忧汤对CSD模型大鼠学习记忆水平的影响

定位航行实验中，前3 d各组之间的逃避潜伏期差异无统计学意义（P>0.05）。第4天开始，接受无忧汤治疗的CSD大鼠，特别是WYD-M组，逃避潜伏期减少；与正常组相比，模型组逃避潜伏期增加（P<0.01）。在空间探查测试中，与正常组相比，模型组平台穿越次数和目标象限停留时间降低（P<0.01）。与模型组相比，WYD-M组提升了平台穿越次数和目标象限停留时间（P<0.01）。而WYD-L和WYD-H组未能逆转这一缺陷。各组间游泳速度的差异无统计学意义（P>0.05，图1）。

2.2 无忧汤对CSD模型大鼠脑组织形态的影响

与正常组相比，模型组海马CA1、CA3区的神经元排列松散且紊乱，结构不紧密，数量显著减少；细胞核出现固缩现象，细胞质中可见空泡化，细胞膜完整性受损，表明细胞受到了严重的损伤。与模型组相比，WYD-M组大鼠神经元增多，细胞排列的相对整齐紧密，空泡化及核固缩现象明显减轻（图2）。

2.3 无忧汤对CSD模型大鼠海马尼氏体的影响

与正常组相比，模型组大鼠海马CA1、CA3区尼氏小体排列松散紊乱，并且数量减少（P<0.01）；与模型组相比，WYD-M组大鼠尼氏小体排列整齐有序，且数量增多（P<0.01），虽然WYD-H组尼氏小体排列整齐有序，且数量增多（P<0.05），但是总体不及WYD-M改善明显（图3）。

2.4 无忧汤对CSD模型大鼠海马神经元细胞的影响

与正常组相比，模型组大鼠海马CA1、CA3区神经元数量减少（P<0.01）；与模型组相比，WYD-M组大鼠海马CA1、CA3区神经元数量增加（P<0.01），虽然WYD-H组可以增加神经元细胞，但总体不如WYD-M组效果显著（图4）。

2.5 无忧汤对CSD模型大鼠海马突触可塑性的影响

与正常组相比，模型组海马树突棘的长度及密度均有所缩短（P<0.01）。与模型组相比，WYD-M组海马树突棘的长度及密度均有所恢复（P<0.01，图5A~C）。与正常组相比，模型组PSD95与SYN1的蛋白表达水平降低（P<0.01）；与模型组相比，WYD-M组增高了PSD95与SYN1的表达水平（P<0.01，图5D~F）。虽然WYD-H组在不同程度上也增加了表达水平，但总体上没有WYD-M组的效果好。

2.6 无忧汤对CSD模型大鼠海马中线粒体的影响

正常组细胞结构较完整，线粒体未见明显的病理改变，线粒体大小适中，形态呈椭圆形，嵴排列较整齐清晰；与正常组相比，模型组线粒体形态发生异常，出现了明显的空泡样肿胀，嵴断裂且数量减少，现“髓鞘样”变；与模型组相比，WYD-M组线粒体损伤得到了缓解，空泡样肿胀和嵴断裂的程度及数量均有所减轻（图6）。

2.7 无忧汤对CSD模型大鼠氧化应激水平及铁代谢的影响

与正常组相比，模型组MDA及Fe²⁺的水平上升，SOD、GSH、GSH/GSSH下降（P<0.01）；与模型组相比，WYD-M组MDA及Fe²⁺的水平下降（P<0.01），SOD、GSH、GSH/GSSH上升（P<0.01，图7A）。Western blotting 分析显示，与正常组相比，模型组中TfR1和FTH1的表达增加（P<0.01），WYD-M组降低了该趋势（P<0.05，P<0.01，图7B）。

2.8 无忧汤对CSD模型大鼠铁死亡及Nrf2/HO-1通路的影响

与正常组相比，模型组的Nrf2、HO-1、SLC7A11和GPX4水平降低（P<0.01），而ACSL4表达增加（P<0.01）。与模型组相比，WYD-M组增强Nrf2、HO-1、SLC7A11和GPX4蛋白的表达（P<0.05，P<0.01），降低ACSL4水平（P<0.05，图8）。

2.9 分子对接结果

结合无忧汤中当归、白芍的突出比例，选取这两味药物中的主要成分芍药苷和阿魏酸，评估结合能力，结果显示，芍药苷和阿魏酸2种化合物均与关键通路相关蛋白表现出强效结合，结合能均低于-5 kcal/mol（图9，表1）。

3 讨论

研究表明，睡眠剥夺会显著削弱记忆、注意力和学习能力^{［18， 19］}。除了引起短期的认知障碍外，睡眠不足还会增加阿尔茨海默病等神经退行性疾病的发生风险^［20］。这一现象主要与睡眠在清除大脑代谢废物、巩固记忆以及修复神经元方面的关键作用密切相关^［21］。目前，非药物干预，如认知行为疗法已被广泛认可为改善睡眠障碍相关认知功能障碍的有效方法，但现有药物治疗手段仍较为局限，且往往难以精准针对其病理特点发挥疗效^［22］。因此，本研究未设立阳性药物对照组。与此同时，在中医临床实践中，经典中药方剂已显示出缓解睡眠障碍所致认知功能下降的潜力，其中无忧汤作为代表性配方受到了广泛关注^［17］。临床研究表明，无忧汤能够有效改善失眠症患者的认知功能^［23］。因此，本研究旨在进一步探讨无忧汤在缓解CSD引发的认知功能障碍及神经保护方面的潜在机制。本研究通过MWM实验评估了无忧汤对CSD大鼠认知能力的影响。结果显示，无忧汤给药能够有效缩短CSD模型大鼠的逃逸潜伏期，符合预期。与模型组相比，WYD-M组在平台跨越次数上显著增加，在目标象限停留时间延长。这表明，无忧汤改善了CSD大鼠的认知功能障碍。

神经元和突触在学习与记忆的维持中至关重要。已有研究表明，CSD能够引发神经元损伤和突触功能障碍，从而导致认知能力的下降^［24］。本研究通过HE染色、Nissl染色和免疫组化检测NeuN神经元，结果显示，无忧汤处理显著减少了细胞核固缩和异常等病理变化，同时提高了海马神经元的计数。这表明，无忧汤可能有效减轻CSD引起的神经元病理损伤和神经元丧失。

突触功能障碍是CSD模型中的另一个关键病理特征。因此，本研究使用高尔基染色和免疫荧光技术检测树突棘的长度与密度及其关键标志物PSD95和SYN1。结果表明，无忧汤治疗具有神经保护作用，可能通过改善神经元损伤和突触功能障碍来对抗CSD的影响。

铁是维持线粒体功能、突触可塑性和认知功能的必需金属元素^{［25， 9］}。过量的铁会增加细胞对铁死亡的易感性。有研究已证明，铁死亡与CSD密切相关，其特征主要表现为线粒体的缩小以及线粒体脊的破裂或消失^［26］。为此，本研究使用TEM观察了海马体内的线粒体超微结构，发现无忧汤能够有效修复CSD引起的线粒体损伤。由于铁负荷过高会引发铁死亡，本研究通过试剂盒检测海马组织中的铁含量及氧化应激水平，结果显示无忧汤抑制CSD大鼠海马组织中的铁和MDA的积累并增加SOD、GSH、GSH/GSSH比值的表达。此外，铁代谢失调是铁死亡的重要驱动因素，主要通过TfR1、FTH1的调控^［27］。本研究通过Western blotting检测分析海马组织中TfR1和FTH1的表达水平，结果表明无忧汤能够显著抑制这些蛋白的表达，提示无忧汤通过调节铁代谢，从而减轻铁积累。

尽管铁死亡的具体机制仍需进一步探讨，但已有越来越多的研究证实，铁死亡受到铁代谢相关途径、脂质过氧化途径等多种途径的调控^［28］。Nrf2/HO-1信号通路是机体应对氧化应激的重要机制，其中HO-1作为Nrf2的靶基因，具有神经保护作用^［29］。Nrf2激活后能够促进HO-1的表达，进而降低铁细胞坏死，保护神经元及突触可塑性^［30］。近期研究表明，Nrf2/HO-1信号通路在减轻铁死亡方面发挥关键作用，因为该通路已被证明能够激活下游的SLC7A11和GPX4^［31］。为进一步验证这一机制，本研究采用Western blotting检测Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白以及铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11和ACSL4的表达水平。结果表明，与模型组相比，无忧汤组海马组织中Nrf2、HO-1、GPX4和SLC7A11的表达水平明显升高，同时，无忧汤显著抑制了海马组织中ACSL4的表达。

综上所述，本研究结果显示，无忧汤可以通过激活Nrf2/HO-1信号通路缓解CSD模型大鼠神经元及突触损伤和缓解铁死亡，从而减轻CSD模型大鼠的认知能力损害，为后续无忧汤在临床上使用提供实验依据。

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基金资助

湖北省自然科学基金联合基金(2023AFD068)

湖北省中医药管理局中医药科研项目(ZY20230047)

湖北民族大学校内科研项目(XN2316)

湖北民族大学研究生创新项目(MYK2023060)

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