敲除脂质运载蛋白2通过抑制NF-κB通路改善脓毒症急性肺损伤小鼠血管内皮屏障功能

LCN2 knockout protects endothelial barrier function in mice with sepsis-induced acute lung injury by regulating the NF-κB signaling pathway

摘要

目的 探讨敲除脂质运载蛋白2（LCN2）基因对脓毒症小鼠急性肺损伤及血管内皮功能障碍的影响，明确核因子-κB（NF-κB）通路在其中的可能作用。 方法 选用20只LCN2基因敲除（LCN2KO）小鼠和60只C57BL/6小鼠，通过盲肠结扎与穿孔（CLP）术构建脓毒症模型，分为WT-Sham组、Sham+PDTC组、Sham+Bay 11-7082组、WT-CLP组、LCN2KO-Sham组，LCN2KO-CLP组、CLP+NF-κB抑制剂PDTC组、CLP+NF-κB抑制剂Bay 11-7082组，10只/组。HE染色观察肺组织病理变化，检测肺湿干比（W/D）、肺指数及伊文思蓝外渗评价肺水肿与血管通透性。ELISA测定血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素-6（IL-6）水平。免疫荧光检测NF-κB、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）与CD31共定位情况，TUNEL/CD31双染评估内皮细胞凋亡变化。Western blotting检测LCN2、p-P65/P65、ICAM-1、VCAM-1及血管内皮钙黏附蛋白（VE-cadherin）蛋白表达。免疫共沉淀分析LCN2与P65的潜在相互作用。 结果 WT-CLP组小鼠肺组织结构明显受损，伴随水肿及炎症反应。与WT-CLP组相比，LCN2KO-CLP组及CLP+PDTC组小鼠肺组织损伤减轻，W/D值、肺指数及伊文思蓝外渗量下降，血清TNF-α和IL-6水平降低，肺血管内皮细胞中NF-κB、ICAM-1、VCAM-1与CD31的共定位信号减弱。CLP术后LCN2、p-P65/P65、ICAM-1及VCAM-1表达升高，VE-cadherin表达降低，内皮细胞凋亡增加，LCN2KO及抑制剂干预后相关蛋白表达得到改善，凋亡水平下降。免疫共沉淀结果显示LCN2与P65在肺组织中可能存在相互作用。Bay 11-7082干预后，降低了炎症因子，下调了p-P65及其下游黏附分子表达，恢复VE-cadherin水平。 结论 敲除LCN2可通过抑制NF-κB信号通路减轻脓毒症诱导的急性肺损伤及血管内皮功能障碍。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of lipocalin-2 (LCN2) gene knockout against sepsis-induced acute lung injury (ALI) and vascular endothelial dysfunction in mice and the mediating role of the nuclear factor-κB (NF-κB) signaling pathway. Methods Wild-type (WT) C57BL/6 mice receiving sham operation or cecal ligation and puncture (CLP) to induce sepsis were randomized into 3 subgroups for intraperitoneal injections of saline, PDTC, or Bay 11-7082 (n=10). Twenty LCN2 knockout (LCN2KO) mice were randomized for sham operation or CLP modeling. Pulmonary histopathological changes, lung wet-to-dry (W/D) ratio, lung index, Evans blue extravasation, and serum TNF-α and IL-6 levels in the mice were assessed. The colocalization of NF-κB, ICAM-1, and VCAM-1 with CD31 were analyzed using immunofluorescence staining, and endothelial cell apoptosis was examined with TUNEL/CD31 double staining. Western blotting and co-immunoprecipitation assay were performed to analyze the protein expressions of LCN2, p-P65/P65, ICAM-1, VCAM-1 and VE-cadherin and the interaction between LCN2 and P65. Results The WT mice receiving CLP showed severe lung structural damage with obvious edema and inflammation. In contrast, both the LCN2KO mouse and PDTC-treated WT mouse models of CLP showed milder lung injury with lower W/D ratio, lung index, Evans blue leakage, serum TNF‑α and IL-6 levels and markedly reduced colocalization signals of NF-κB, ICAM-1, and VCAM-1 with CD31. CLP resulted in significantly increased expression levels of LCN2, p-P65/P65, ICAM-1, and VCAM-1, lowered VE-cadherin levels, and enhanced endothelial cell apoptosis, and all these changes were significantly ameliorated in LCN2KO mice and WT mice with NF‑κB inhibitor treatment. Co-immunoprecipitation results suggested the interaction between lung LCN2 and P65. Bay 11-7082 significantly reduced inflammatory cytokine production, downregulated p-P65 expression and its downstream adhesion molecules, and restored VE-cadherin expression. Conclusion LCN2 knockout alleviates sepsis-induced ALI and vascular endothelial dysfunction in mice by inhibiting NF-κB signaling.

Graphical abstract

关键词

脂质运载蛋白2 / 脓毒症肺损伤 / 内皮功能障碍 / NF-κB信号通路

Key words

lipocalin-2 / sepsis-induced acute lung injury / endothelial dysfunction / nuclear factor-κB signaling pathway

脓毒症是一种由感染引起机体炎症和免疫反应失调导致的多器官功能障碍性疾病^［1］，其诱发的急性肺脏损伤（ALI）是最常见的器官损伤之一^［2］。研究表明，肺微血管内皮功能障碍是ALI和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）发生发展的关键机制之一^［3］。肺血管内皮细胞（PVECs）是脓毒症诱导肺损伤病理过程中的第一道防线，内皮细胞发生收缩、凋亡和膜破坏是其病程的最早变化，导致肺血管渗漏增加和急性肺水肿^［4］。PVECs在维持肺血管屏障的完整性和正常功能中发挥着至关重要的作用，其中，内皮细胞之间的紧密连接和黏附连接的结构维持内皮屏障的细胞旁通透性^［5］。ALI中受损的内皮屏障破坏主要由强烈的炎症和促炎细胞因子等诱导，内皮细胞受刺激后引发血管粘附分子表达增加，内皮通透性增加^{［6， 7］}。因此，内皮细胞损伤也被认为是ALI时重要的病理变化。

中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（LCN2）是一种含量丰富的相对分子质量为23 000的抗菌多肽，属于脂质运载蛋白家族的成员，最初发现于人中性粒细胞次级颗粒中，参与先天免疫的发生^［8］。LCN2所参与的信号转导通路之一是核因子κB（NF-κB），其对炎症调节至关重要^［9］。NF-κB的重要亚基p65的磷酸化促进NF-κB易位到细胞核，并增加炎性细胞因子的转录以诱导炎症^［10］，该途径与脓毒症诱导的内皮功能障碍有关^［11］，内皮NF-κB通路的激活提高了TNF-α、IL-6、ICAM-1和VCAM-1的表达，加剧内皮细胞炎症^［11］。VE-cadherin的内化也被认为是调控内皮细胞间连接稳定性和血管通透性的重要机制^［12］。

本课题组前期研究发现，CLP诱导的脓毒症小鼠模型中，肺组织LCN2表达升高伴随NF-κB活化增强，提示二者可能存在功能关联^［13］。但目前尚缺乏直接证据说明LCN2是否通过调控NF-κB信号参与脓毒症ALI内皮炎症及屏障功能受损，相关分子机制仍有待进一步明确。基于此，本研究在敲除小鼠LCN2基因背景下建立脓毒症模型，并抑制NF-κB通路，系统分析LCN2对肺血管内皮炎症反应、屏障蛋白表达及血管通透性变化的影响，探讨其与NF-κB信号通路的可能关系，为治疗ALI提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

6~8 周龄SPF级雄性C57BL/6野生型（WT）小鼠60只购自江苏青龙山生物科技有限公司［生产许可证号：SCXK（苏）2024-0001，使用许可证号：SYXK（皖）2023-009］。LCN2基因敲除小鼠（LCN2-/-，即LCN2KO）20只由长沙赛业生物科技有限公司提供。将WT小鼠随机分为6组（10只/组）：野生型假手术对照组（WT-Sham组）、NF-κB抑制剂PDTC组（Sham+PDTC组）、NF-κB特异性抑制剂Bay 11-7082组（Sham+Bay 11-7082组），野生型构建CLP脓毒症模型组（WT-CLP组）、野生型CLP加PDTC组（CLP+PDTC组），野生型CLP加Bay 11-7082组（CLP+Bay 11-7082组）；LCN2KO小鼠随机分为LCN2基因敲除假手术组（LCN2KO-Sham组）和LCN2基因敲除构建CLP模型组（LCN2KO-CLP组），10只/组。本研究动物实验方案已获得蚌埠医科大学动物伦理委员会批准（伦理批号：［2025］第522号）。

1.2 试剂材料

伊文思蓝（北京索莱宝科技公司）；甲酰胺（HY-Y0842）、NF‑κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（PDTC）、NF‑κB特异性抑制剂BAY 11-7082（Med Chem）；10%PAGE一步法凝胶试剂盒（雅酶生物）；IL-6和TNF-α的ELISA试剂盒（江苏晶美有限公司）；免疫沉淀试剂盒（P2179S，碧云天）；TUNEL试剂盒（11684795910，Roche）；LCN2抗体（AF1857，R&D systems）；NF‑κB P65（P65）抗体（80979-1-RR，Proteintech）；Phospho-NF‑κB P65（p-P65）抗体（AF2006）、ICAM-1抗体（AF6088）、VE-cadherin抗体（AF6265）、山羊抗兔二抗（S0001）（Affinity）；VCAM-1抗体（T55427，Abmart）；CD31抗体（HL18207，慧兰生物）；兔抗山羊二抗（BA1060，Boster）；荧光二抗CY3山羊抗兔（GB21303）、DAPI（G1012）（Servicebio）。

1.3 构建CLP模型及NF-κB抑制剂注射

小鼠术前禁食12 h，不禁水，采用2.5%异氟烷吸入麻醉后仰卧固定。常规备皮并碘伏消毒腹部，沿腹中线切开腹壁，暴露盲肠。WT-Sham组和LCN2KO-Sham组仅暴露盲肠后即回纳腹腔，其余各组继续进行结扎和穿孔操作。在距盲肠远端约1/3处用4-0号非吸收缝合线结扎，随后于结扎远端0.5~1 cm处避开血管，用18 G针头穿刺2次，轻挤出少量肠内容物以保持通畅。将盲肠回纳腹腔，逐层缝合切口，术后腹腔注射37 ℃预热的1 mL生理盐水以防止小鼠发生休克。

CLP+PDTC组小鼠术后1 h腹腔注射 50 mg/kg PDTC。CLP+BAY 11-7082组小鼠术前1 h腹腔注射10 mg/kg BAY 11-7082。

1.4 HE染色

造模结束后取部分肺组织，经多聚甲醛固定后以PBS充分冲洗残留固定液，随后依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明并完成石蜡包埋，切制5~8 μm的组织切片。切片经二甲苯和梯度酒精脱蜡复水后进行HE染色，染色完成后再次脱水、透明，并以中性树脂封片。光学显微镜下观察并拍摄肺组织形态学变化。肺损伤评分依据以下观察指标进行评估：肺出血、炎症细胞浸润以及肺间质水肿。根据疾病严重程度评分：0分表示无明显病变，0.5~1分为轻度，2分为中度，3分为重度，4分为危重。对每个样本的评分进行累加后，计算各组的平均得分用于统计分析。

1.5 肺系数和肺湿干比重测定

取材前称小鼠体质量，肺组织取出后，取出肺组织周围结缔组织，PBS洗净血迹，吸水纸吸干水分后，将肺组织放于天平上称量肺湿质量，肺系数=肺组织湿质量（mg）/小鼠体质量（g）。为进一步评估肺组织的水肿情况，取小鼠右肺上叶，吸干表面残留的水分后立即称量湿质量。随后将组织置于60 ℃的烘箱中干燥72 h，再次称量得到其干质量。最终以湿质量与干质量的比值（W/D ratio）反映肺组织的含水量，判断水肿程度。

1.6 伊文思蓝检测

为评估肺组织血管通透性，在CLP模型构建后，经尾静脉注射1%伊文思蓝溶液（10 mg/kg）。2 h后对小鼠进行麻醉，并从右心室灌注生理盐水约50 mL，以去除肺组织内的血管内染料。随后取肺组织，于1 mL PBS中匀浆，再加入2 mL甲酰胺，在37 ℃下孵育48 h，12 000 g、4 ℃离心15 min后检测上清，酶标仪测定A_{620 nm}，根据校正后的A值计算肺组织中伊文思蓝的含量，用以反映肺血管通透性的变化。

1.7 ELISA定量检测

小鼠眼球取血后，静置30 min，血液在离心管内凝固，离心机4 ℃低温预冷后，5000 g离心15 min后抽取上清，采用ELISA法测定血清IL-6、TNF-α含量，按试剂盒说明书进行操作。酶标仪测定A_{450 nm}，并通过标准曲线测定各组样品中IL-6、TNF-α浓度。

1.8 免疫荧光检测

石蜡包埋的肺组织切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡复水后，置于柠檬酸缓冲液中进行抗原修复，室温冷却后用PBS清洗，并以BSA封闭30 min。首先加入一抗：P65（1∶300）、ICAM-1（1∶200）、VCAM-1（1∶200），平放4 ℃孵育过夜；清洗后加入山羊抗兔二抗（1∶300），室温孵育50 min，根据需要进行TSA荧光放大。为避免前次染色的抗体干扰，再次进行抗原修复、PBS清洗并重复封闭步骤，加入一抗CD31（1∶500）于4 ℃孵育过夜，加入山羊抗兔二抗（1∶300），室温孵育50 min。清洗后加入DAPI，避光孵育10 min，并以抗淬灭封片剂封片。最终在荧光显微镜下获取图像，其中DAPI（蓝色）标记细胞核，CD31（绿色）标记内皮血管，目标蛋白以红色显示。通过三通道合并图像可判断目标蛋白在肺内皮中的表达及共定位情况。使用Image J软件对蛋白荧光表达进行半定量分析。

1.9 TUNEL检测

完成CD31免疫荧光染色后，按TUNEL试剂盒说明书进行TUNEL染色。PBS洗涤后进行DAPI复染，抗荧光淬灭封片剂封片。切片在荧光显微镜下观察并采集图像，采用ImageJ软件测量CD31阳性血管区域面积，并计数位于CD31阳性区域内的TUNEL阳性细胞核数，仅计数位于CD31阳性血管区域内或紧贴血管壁、呈核样形态的TUNEL阳性细胞，排除血管外及非特异性信号。以TUNEL阳性细胞数与CD31阳性血管面积之比表示肺血管相关细胞凋亡水平。

1.10 Western blotting检测

将每组小鼠肺组织切成小块加入200 µL RIPA裂解液和2 µL PMSF震荡混匀，并置于研磨机中，研磨机研磨，获得组织匀浆，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min取上清液进行BCA检测。确定蛋白浓度后加入上样缓冲液95 ℃水浴作用5 min。配胶，加样后电泳，转膜，选择快速封闭液4 ℃孵育30 min；一抗LCN2（1∶1000）、p-P65（1∶1000）、P65（1∶5000）、ICAM-1（1∶1000）、VCAM-1（1∶1000）、VE-cadherin（1∶1000）、GAPDH（1∶5000），4 ℃孵育过夜；兔抗山羊二抗 （1∶5000）、山羊抗兔二抗（1∶5000）4 ℃孵育40 min，TBST洗涤后，利用电化学发光（ECL）试剂盒对其进行检测，曝光成像。结果使用Image J软件进行灰度值分析，以GAPDH为内参。

1.11 免疫共沉淀检测

使用含蛋白酶抑制剂的裂解液裂解小鼠肺组织，匀浆后于4 ℃离心，收集蛋白上清并测定蛋白浓度。取Protein A/G磁珠按说明书洗涤后，分别加入抗体工作液（实验组）或同种属正常IgG工作液（阴性对照组），室温360°旋转孵育1 h以使抗体与磁珠结合。随后加入等量蛋白样品，于4 ℃条件下360°旋转孵育过夜。孵育结束后置于磁力架上分离磁珠，弃上清，用预冷裂解液洗涤3次。最后加入1×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴变性5 min，经磁力分离后收集上清，进行Western blotting检测。

1.12 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。所有实验都独立重复3次。

2 结果

2.1 HE染色分析结果

HE染色结果显示，WT-Sham组小鼠肺组织肺泡间隔纤细，结构完整，分布均匀，评分较低。与WT-Sham组相比，WT-CLP组肺泡间隔增厚，肺水肿程度增加，肺间质有大量炎症细胞浸润，肺泡结构不完整（P<0.001）。与WT-CLP组对比，LCN2KO-CLP组和CLP+PDTC组肺间隔变薄，肺水肿程度减轻，肺间质炎症细胞浸润明显减轻，肺泡结构较完整，评分降低（P<0.05，图1）。

2.2 小鼠肺系数及肺湿干比重变化

与WT-Sham组相比，WT-CLP组肺系数和肺湿干比升高（P<0.01）；与WT-CLP组相比，LCN2KO-CLP组和CLP+PDTC组的肺系数与肺湿干比下降（P<0.01，图2）。

2.3 小鼠肺组织伊文思蓝含量变化

伊文思蓝检测结果显示，与WT-Sham组相比，WT-CLP组伊文思蓝吸光度显著升高，肺组织染色明显加深（P<0.001）。与WT-CLP组相比，LCN2KO-CLP组和CLP+PDTC组伊文思蓝吸光度降低，肺组织染色程度减轻（P<0.01，图3）。

2.4 小鼠血清中TNF-α和IL-6含量变化

ELISA检测结果显示，与WT-Sham组相比，WT-CLP组血清中炎症因子TNF-α和IL-6含量升高（P<0.01）；与WT-CLP组相比，LCN2KO-CLP组和CLP+PDTC组TNF-α和IL-6含量降低（P<0.01，图4）。

2.5 免疫荧光法分析小鼠肺内皮血管中蛋白表达水平

免疫荧光检测结果显示，与WT-Sham组相比，WT-CLP组小鼠肺血管内皮P65、ICAM-1、VCAM-1荧光表达水平增加（P<0.01）；与WT-CLP组小鼠相比，LCN2KO-CLP组和CLP+PDTC组小鼠肺内皮中P65、ICAM-1、VCAM-1荧光表达水平降低（P<0.05，图5）。

2.6 TUNEL/CD31双标免疫荧光法检测肺内皮细胞凋亡

TUNEL/CD31双标免疫荧光结果显示，与WT-Sham组相比，WT-CLP组小鼠肺血管内皮中TUNEL阳性（CD31⁺）细胞增加（P<0.001）；与WT-CLP组相比，LCN2KO-CLP组和CLP+PDTC组小鼠肺血管内皮中TUNEL阳性（CD31⁺）细胞减少（P<0.05，图6）。

2.7 Western blotting检测小鼠肺组织中蛋白表达水平

Western blotting检测结果显示，与WT-Sham组相比，WT-CLP组小鼠组织中LCN2、p-P65/P65、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达水平增加（P<0.01），VE-cadherin蛋白水平下降（P<0.01）；与WT-CLP组小鼠相比，LCN2KO-CLP组和CLP+PDTC组小鼠组织中LCN2、p-P65/P65、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达水平降低（P<0.05），VE-cadherin蛋白水平升高（P<0.05，图7）。

2.8 免疫共沉淀验证LCN2与P65的相互作用

免疫共沉淀结果显示，以P65蛋白为诱饵进行免疫共沉淀，在沉淀复合物中可检测到LCN2蛋白，提示P65蛋白与LCN2蛋白在肺组织中可能存在相互作用，二者之间具有一定关联（图8）。

2.9 Western blotting与ELISA检测PDTC与BAY 11-7082对NF-κB通路及下游炎症因子的调控作用

Western blotting检测结果显示，与WT-Sham组相比，Sham+PDTC组和Sham+Bay 11-7082组小鼠组织中p-P65/P65、ICAM-1、VCAM-1、VE-cadherin蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），WT-CLP组小鼠组织中p-P65/P65、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达水平增加（P<0.01），VE-cadherin蛋白水平下降（P<0.01）；与WT-CLP组小鼠相比，CLP+PDTC组和CLP+Bay 11-7082组小鼠组织中p-P65/P65、ICAM-1、VCAM-1蛋白表达水平降低（P<0.05），VE-cadherin蛋白水平升高（P<0.01）。

ELISA检测结果显示，与WT-Sham组相比，Sham+PDTC组和Sham+Bay 11-7082组血清中炎症因子的差异无统计学意义（P>0.05），WT-CLP组TNF-α和IL-6含量升高（P<0.001）；与WT-CLP组相比，CLP+PDTC组和CLP+Bay 11-7082组TNF-α和IL-6含量降低（P<0.01，图9）。

3 讨论

脓毒症诱导的ALI/ARDS是一种由多重分子和细胞机制共同驱动的严重疾病，其核心机制包括内皮功能障碍、免疫失衡、氧化应激增强及细胞程序性死亡增加等多重因素，这些改变会破坏内皮完整性并促进细胞死亡，从而加剧肺损伤并导致呼吸衰竭^［14］。肺内皮细胞在损伤或疾病状态下会发生显著的表型改变，进而诱导血管重塑和炎症反应，这些变化是多种严重呼吸系统疾病发生和进展的重要病理基础^{［15，16］}。已有研究表明，肺血管内皮损伤是脓毒症ALI发生发展的关键环节，其屏障稳定性直接影响肺水肿程度和炎症反应强度，因此，维持血管内皮屏障功能被认为是干预脓毒症肺损伤的重要策略^{［17， 18］}。

LCN2的分泌可在感染、损伤和代谢紊乱等状态下明显增高^［19］。LCN2在多种细胞和器官中表达，主要参与机体炎症反应和代谢过程中的调控^［20］。既往研究提示LCN2参与调控血管内皮细胞功能，其高表达与内皮损伤和通透性增强密切相关，而敲除LCN2可在一定程度上改善内皮细胞结构与功能状态^［21］。ICAM-1和VCAM-1是主要表达于内皮细胞表面的黏附蛋白，在炎症过程中介导白细胞黏附与迁移，具有维持内皮稳态与调控炎症反应的重要作用^［22］。ICAM-1和VCAM-1作为炎症诱导型黏附分子，其高表达可促进炎症细胞黏附与迁移，加剧内皮损伤和血管通透性增加^［17］。阻断ICAM-1或VCAM-1与其配体的相互作用，可抑制免疫细胞在内皮表面的黏附与迁移，从而减轻脓毒症过程中由内皮激活所引发的炎症反应^［23］。有研究指出，可溶性 VE-cadherin在脓毒症过程中水平升高，可能反映微血管屏障功能的受损，其作为早期预测脓毒症相关内皮障碍的潜在生物标志物具有一定临床意义^［24］。VE-cadherin作为维持内皮细胞间连接结构的关键蛋白，其表达降低会直接导致内皮屏障结构破坏^［25］。本研究结果进一步证实，在CLP诱导的脓毒症模型中，LCN2缺失可显著减轻肺组织结构破坏和炎性细胞浸润，降低肺湿干比和肺指数，并明显减少伊文思蓝外渗，提示LCN2缺失对脓毒症所致肺血管通透性升高具有显著的抑制作用；同时，LCN2基因敲除后进行CLP干预，肺血管内皮细胞ICAM-1、VCAM-1表达下调，而VE-cadherin表达上调。本研究进一步通过TUNEL与CD31双染，从细胞凋亡层面验证了内皮损伤的发生，提示LCN2缺失能够有效减轻脓毒症条件下肺血管内皮细胞凋亡。说明LCN2缺失能够有效维持肺血管内皮细胞间连接稳定性，从结构层面增强肺血管屏障功能，体现出其明确的内皮保护作用。

NF-κB信号通路作为经典炎症调控通路，在脓毒症中持续被激活，可诱导多种炎症介质及黏附分子表达，从而进一步加重内皮细胞损伤与屏障破坏^［26］。磷酸化的NF-κB通路激活粘附分子（ICAM1和VCAM-1）、并促进TNF-α和IL-6等炎症因子的释放，将“抗粘连”肺血管内皮转化为“亲粘连”内皮，从而促进炎症细胞的粘附和随后的跨内皮迁移^［27］。炎症刺激下，LCN2的表达水平显著升高，而NF-κB作为炎症反应的核心转录因子，在脓毒症及ALI中持续处于活化状态^［28］。NF-κB的激活依赖IκB的磷酸化与降解，使其p65亚基从细胞质释放并转位入核，进而驱动多种炎症基因表达，包括细胞因子、趋化因子以及黏附分子等^［29］。但目前尚无研究系统探讨LCN2是否通过调控NF-κB直接影响内皮细胞连接蛋白和通透性。本研究发现，LCN2缺失显著降低肺组织中p-P65水平，提示LCN2可能通过调控NF-κB通路参与脓毒症相关内皮损伤过程。免疫共沉淀结果显示，P65与LCN2在肺组织中存在相互作用或处于同一蛋白复合物中，提示二者在NF-κB信号调控过程中可能存在功能关联。进一步，NF-κB抑制剂PDTC和Bay 11-7082的应用同样可降低p-P65表达，并下调ICAM-1、VCAM-1水平，同时增强VE-cadherin表达，呈现出与敲除LCN2相似的保护趋势。NF-κB的持续激活会干扰内皮细胞间连接的正常结构，加重脓毒症过程中的内皮损伤。

结合上述结果推测，脓毒症时，LCN2可能通过促进NF-κB通路活化及其向细胞核转位，增强黏附分子表达，促进炎症细胞黏附与迁移，并削弱VE-cadherin介导的细胞间连接结构，最终导致血管通透性增加和屏障功能破坏；而LCN2缺失可在一定程度上逆转上述过程，从而减轻肺内皮功能障碍。该结果从功能和分子水平构建了“LCN2-NF-κB-肺血管内皮屏障损伤”这一调控轴，为进一步阐明脓毒症ALI的分子机制提供了补充证据。

从临床角度来看，目前脓毒症相关ALI的治疗仍以支持治疗为主，缺乏针对内皮功能障碍的特异性干预手段。本研究揭示LCN2在脓毒症肺损伤中通过调控NF-κB信号通路介导内皮屏障破坏的关键作用，提示LCN2不仅可作为反映炎症状态的生物标志物，更可能成为调控肺血管通透性的新型干预靶点。靶向LCN2或其下游NF-κB信号通路，有望为脓毒症ALI的精准干预提供新的思路，并为改善患者预后开辟潜在的转化医学路径。

综上所述，LCN2可能通过调控NF-κB信号通路参与脓毒症急性肺损伤中内皮屏障功能的损伤过程，但其具体作用机制仍需进一步在细胞水平加以验证。

参考文献

[1] Cheng LX, Cao Y, Liu SH, et al. Unveiling the research advances of sepsis: pathogenesis, precise intervention and clinical perspective[J]. Int J Surg, 2025, 111(9): 6260-89. doi：10.1097/js9.0000000000002668

[2] Qiu N, Xu XM, He YY. LncRNA TUG1 alleviates sepsis-induced acute lung injury by targeting miR-34b-5p/GAB1[J]. BMC Pulm Med, 2020, 20(1): 49. doi：10.1186/s12890-020-1084-3

[3] Qiao XY, Yin JH, Zheng ZH, et al. Endothelial cell dynamics in sepsis-induced acute lung injury and acute respiratory distress syndrome: pathogenesis and therapeutic implications[J]. Cell Commun Signal, 2024, 22(1): 241. doi：10.1186/s12964-024-01620-y

[4] Gao M, Yu TY, Liu D, et al. Sepsis plasma-derived exosomal miR-1-3p induces endothelial cell dysfunction by targeting SERP1[J]. Clin Sci, 2021, 135(2): 347-65. doi：10.1042/cs20200573

[5] Birukova AA, Tian XY, Cokic I, et al. Endothelial barrier disruption and recovery is controlled by substrate stiffness[J]. Microvasc Res, 2013, 87: 50-7. doi：10.1016/j.mvr.2012.12.006

[6] Rotoli BM, Barilli A, Visigalli R, et al. Endothelial cell activation by SARS-CoV-2 spike S1 protein: a crosstalk between endothelium and innate immune cells[J]. Biomedicines, 2021, 9(9): 1220. doi：10.3390/biomedicines9091220

[7] Lee W, Choi HJ, Sim H, et al. Barrier protective functions of hederacolchiside-E against HMGB1-mediated septic responses[J]. Pharmacol Res, 2021, 163: 105318. doi：10.1016/j.phrs.2020.105318

[8] Devireddy LR, Gazin C, Zhu XC, et al. A cell-surface receptor for lipocalin 24p3 selectively mediates apoptosis and iron uptake[J]. Cell, 2005, 123(7): 1293-305. doi：10.1016/j.cell.2005.10.027

[9] Sun SC. The non-canonical NF‑κB pathway in immunity and inflammation[J]. Nat Rev Immunol, 2017, 17(9): 545-58. doi：10.1038/nri.2017.52

[10] Lawrence T. The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2009, 1(6): a001651. doi：10.1101/cshperspect.a001651

[11] Luo MH, Meng JY, Yan JH, et al. Role of the nucleotide-binding domain-like receptor protein 3 inflammasome in the endothelial dysfunction of early sepsis[J]. Inflammation, 2020, 43(4): 1561-71. doi：10.1007/s10753-020-01232-x

[12] Grimsley-Myers CM, Isaacson RH, Cadwell CM, et al. VE-cadherin endocytosis controls vascular integrity and patterning during development[J]. J Cell Biol, 2020, 219(5): e201909081. doi：10.1083/jcb.201909081

[13] 王奕人, 于梦洁, 杜若丽, 等. LCN2基因敲除可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路改善脓毒症小鼠肺损伤和铁死亡[J/OL]. 生理学报, 2025. doi: 10.13294/j.aps.2025.0070

[14] Barkat MQ, Li Q, Manzoor M, et al. Sepsis-induced ALI/ARDS beyond supportive care: molecular mechanisms and cutting-edge therapies[J]. Int Immunopharmacol, 2025, 166: 115495. doi：10.1016/j.intimp.2025.115495

[15] Su YC, Lucas R, Fulton DJR, et al. Mechanisms of pulmonary endothelial barrier dysfunction in acute lung injury and acute respiratory distress syndrome[J]. Chin Med J Pulm Crit Care Med, 2024, 2(2): 80-7. doi：10.1016/j.pccm.2024.04.002

[16] Vassiliou AG, Kotanidou A, Dimopoulou I, et al. Endothelial damage in acute respiratory distress syndrome[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(22): 8793. doi：10.3390/ijms21228793

[17] Tang F, Zhao XL, Xu LY, et al. Endothelial dysfunction: Pathophysiology and therapeutic targets for sepsis-induced multiple organ dysfunction syndrome[J]. Biomed Pharmacother, 2024, 178: 117180. doi：10.1016/j.biopha.2024.117180

[18] Watanabe E, Akamatsu T, Ohmori M, et al. Recombinant thrombomodulin attenuates hyper-inflammation and glycocalyx damage in a murine model of Streptococcus pneumoniae-induced sepsis[J]. Cytokine, 2022, 149: 155723. doi：10.1016/j.cyto.2021.155723

[19] Ahn H, Lee G, Kim J, et al. NLRP3 triggers attenuate lipocalin-2 expression independent with inflammasome activation[J]. Cells, 2021, 10(7): 1660. doi：10.3390/cells10071660

[20] Guo H, Jin DZ, Chen XL. Lipocalin 2 is a regulator of macrophage polarization and NF‑κB/STAT3 pathway activation[J]. Mol Endocrinol, 2014, 28(10): 1616-28. doi：10.1210/me.2014-1092

[21] Su XJ, Zhou PP, Qi YX. Down-regulation of LCN2 attenuates retinal vascular dysfunction and caspase-1-mediated pyroptosis in diabetes mellitus[J]. Ann Transl Med, 2022, 10(12): 695. doi：10.21037/atm-22-2655

[22] Singh V, Kaur R, Kumari P, et al. ICAM-1 and VCAM-1: Gatekeepers in various inflammatory and cardiovascular disorders[J]. Clin Chim Acta, 2023, 548: 117487. doi：10.1016/j.cca.2023.117487

[23] He JW, Duan ML, Zhuang HZ. ICAM1 and VCAM1 are associated with outcome in patients with sepsis: a systematic review and meta-analysis[J]. Heliyon, 2024, 10(21): e40003. doi：10.1016/j.heliyon.2024.e40003

[24] Flemming S, Burkard N, Renschler M, et al. Soluble VE-cadherin is involved in endothelial barrier breakdown in systemic inflammation and sepsis[J]. Cardiovasc Res, 2015, 107(1): 32-44. doi：10.1093/cvr/cvv144

[25] Shadab M, Slavin SA, Mahamed Z, et al. Spleen Tyrosine Kinase phosphorylates VE-cadherin to cause endothelial barrier disruption in acute lung injury[J]. J Biol Chem, 2023, 299(12): 105408. doi：10.1016/j.jbc.2023.105408

[26] Wang LN, Cao YP, Gorshkov B, et al. Ablation of endothelial Pfkfb3 protects mice from acute lung injury in LPS-induced endotoxemia[J]. Pharmacol Res, 2019, 146: 104292. doi：10.1016/j.phrs.2019.104292

[27] Minami T, Aird WC. Endothelial cell gene regulation[J]. Trends Cardiovasc Med, 2005, 15(5): 174-84. doi：10.1016/j.tcm.2005.06.002

[28] Cai JN, Wang YL, Sheng XD, et al. Shufeng Jiedu capsule inhibits inflammation and apoptosis by activating A2AAR and inhibiting NF-κB to alleviate LPS-induced ALI[J]. J Ethnopharmacol, 2022, 298: 115661. doi：10.1016/j.jep.2022.115661

[29] Zhao HK, Wu L, Yan GF, et al. Inflammation and tumor progression: signaling pathways and targeted intervention[J]. Signal Transduct Target Ther, 2021, 6(1): 263. doi：10.1038/s41392-021-00658-5

基金资助

安徽省高等学校科学研究项目重大项目(2022AH040215)

安徽省高校优秀科研创新团队资助项目(2022AH010083)

蚌埠医科大学“512”人才项目(by51201102)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021