miR-183-5p通过靶向调控KLHL24影响三阴性乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及铁死亡

Overexpression of miR-183-5p enhances malignant phenotype and inhibits ferroptosis of triple-negative breast cancer cells by negatively regulating KLHL24

摘要

目的 探究miR-183-5p靶向调控Kelch样蛋白24（KLHL24）对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞增殖、侵袭、迁移及铁死亡影响的研究。 方法 应用生物信息学方法对下载的有关乳腺癌的数据集和转录组数据进行差异化分析，筛选出目标基因；再结合多个在线数据库预测并确定目标基因的靶基因。采用RT-qPCR验证目标基因在正常乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞系中的表达情况。通过双荧光素酶报告基因实验验证目标基因与靶基因的靶向关系。通过Western blotting检测转染目标基因过表达质粒后细胞中靶基因编码蛋白表达变化。将MDA-MB-231细胞分为4组并转染：NC-miR + NC-KLHL24组（miR-183-5p对照质粒+KLHL24对照质粒共转染）、oe-miR-183-5p+ NC-KLHL24组（miR-183-5p过表达质粒+KLHL24对照质粒共转染）、NC-miR +oe-KLHL24组（miR-183-5p对照质粒+KLHL24过表达质粒共转染）、oe-miR-183-5p+oe-KLHL24组（miR-183-5p过表达质粒+KLHL24过表达质粒共转染）。使用EdU、Transwell及划痕愈合实验评估细胞增殖、侵袭和迁移能力变化，采用Western blotting技术，分析铁死亡核心调控通路（GPX4、SLC7A11、Nrf2）相关蛋白的相对表达水平，活性氧（ROS）实验、脂质过氧化物（LPO）实验、丙二醛（MDA）实验和还原型谷胱甘肽（GSH））实验检测目标基因以及其靶基因对上述铁死亡指标的影响。 结果 miR-183-5p在乳腺癌组织中的表达量高于正常乳腺组织（P<0.001），在乳腺癌细胞系中表达亦均高于正常乳腺上皮细胞，其中在MDA-MB-231细胞中表达最高（P<0.0001）。双荧光素酶报告基因实验证实miR-183-5p可以与KLHL24的3'-UTR靶向结合（P<0.001）。Western blotting显示过表达miR-183-5p后可降低靶蛋白KLHL24的表达（P<0.0001）。EdU细胞增殖、Transwell侵袭和划痕愈合实验结果显示，在TNBC细胞中过表达miR-183-5p后能明显促进细胞的增殖、侵袭和迁移能力（P<0.001），过表达KLHL24可以抵消miR-183-5p的促进作用。过表达miR-183-5p可上调GPX4、SLC7A11、Nrf2蛋白表达（P<0.05），过表达KLHL24则下调上述蛋白表达（P<0.05），且共表达KLHL24可逆转miR-183-5p对这些蛋白的上调效应。铁死亡指标检测结果表明，过表达miR-183-5p后可以下调细胞内ROS、LPO和MDA含量（P<0.0001），上调GSH的含量（P<0.0001），过表达KLHL24则能有效逆转miR-183-5p对上述铁死亡相关指标的调控作用。 结论 miR-183-5p可以通过负向调控KLHL24增强TNBC细胞增殖、侵袭和迁移能力，并抑制铁死亡的发生。

Abstract

Objective To investigate the effects of miR-183-5p overexpression on proliferation, invasion, migration, and ferroptosis of triple-negative breast cancer (TNBC) cells and the role of Kelch-like protein 24 (KLHL24) in mediating these effects. Methods Bioinformatics analyses were conducted to screen differentially expressed genes in breast cancer (BRCA) and predict the target gene of miR-183-5p. RT-qPCR was used to verify miR-183-5p expression in normal breast epithelial and TNBC cell lines. Dual-luciferase reporter assay was performed to confirm direct binding of miR-183-5p to 3'-UTR of KLHL24. Western blotting was used to detect KLHL24 expression in different TNBC cells after transfection with miR-183-5p-overexpressing plasmids. MDA-MB-231 cells were co-transfected with NC-miR and NC-KLHL24, oe-miR-183-5p and NC-KLHL24, NC-miR and oe-KLHL24, or oe-miR-183-5p and oe-KLHL24 plasmids, and the changes in cell proliferation, migration and invasion were examined using EdU, Transwell, and wound healing assays. Western blotting was used to detect the changes in expressions of ferroptosis-related proteins (GPX4, SLC7A11, and Nrf2), and ROS, LPO, MDA, and GSH levels in the transfected cells were determined. Results The expression of miR-183-5p was significantly elevated in BRCA tissues and TNBC cell lines, and MDA-MB-231 cells showed the highest miR-183-5p expression. Dual-luciferase reporter assay confirmed the direct binding of miR-183-5p to 3'-UTR of KLHL24. Overexpression of miR-183-5p significantly downregulated KLHL24 expression. In TNBC cells, miR-183-5p overexpression obviously promoted cell proliferation, invasion, and migration, upregulated the expressions of GPX4, SLC7A11 and Nrf2, reduced the levels of ROS, LPO and MDA, and increased the level of GSH (P<0.0001); these effects were significantly reversed by co-transfection of the cells with KLHL24-overexpressing plasmids. Conclusion Overexpression of miR-183-5p enhances TNBC cell proliferation, invasion, migration and inhibits ferroptosis by negatively regulating KLHL24.

Graphical abstract

关键词

三阴性乳腺癌 / miR-183-5p / KLHL24 / 增殖 / 侵袭和迁移 / 铁死亡

Key words

triple-negative breast cancer / miR-183-5p / KLHL24 / proliferation / invasion and migration / ferroptosis

乳腺癌是全球范围内对女性健康和生命构成重大威胁的疾病^［1］。全球流行病学数据显示，在女性癌症患者中，乳腺癌相关癌症是最常见的癌症类型，其发病例数占全球女性癌症总病例的23.8%，相关死亡病例占女性癌症死亡总数的15.4%^［2］。研究表明，乳腺癌的死亡原因主要是由于复发^［3］、侵袭迁移^［4］和对常规治疗手段的抵抗性^［5］，尤其是三阴性乳腺癌（TNBC）由于缺乏有效的治疗靶点，常规疗法效果有限，预后最差^{［6， 7］}。因此，迫切需要深入阐明TNBC发生发展的分子生物学机制，找到新的治疗靶点，对于改善患者预后具有重要意义。

近年来，铁死亡作为一种铁依赖性的、以脂质过氧化物累积为特征的调节性细胞死亡方式^［8］，在肿瘤治疗领域受到广泛关注^{［9， 10］}。有研究发现，在癌症治疗中，铁死亡的诱导不仅可以抑制肿瘤生长，而且还具有增强免疫治疗反应和克服对现有癌症治疗的耐药性的潜力^{［11， 12］}。近年来，随着铁死亡在肿瘤治疗中的潜力逐渐被认识，研究如何诱导铁死亡可能成为肿瘤治疗的新策略^［13］。

微小核糖核酸（miRNA）是一种源自体内的短小型非编码RNA，是基因表达的主要调控因子^{［14， 15］}。有研究表明，miRNA是利用其位于5'端的序列，非完全互补结合靶mRNA的3'端序列，完成对靶基因的表达抑制，从而发挥癌基因或抑癌基因的功能^［16］。miR-183-5p在多种肿瘤中异常表达，并参与调控恶性生物学行为。KLHL24作为铁死亡相关蛋白^［17］，前期生物信息学分析提示其可能是miR-183-5p的潜在靶标。然而，miR-183-5p是否通过靶向KLHL24影响TNBC的恶性表型及铁死亡过程，目前尚未见系统报道。

本研究旨在探讨miR-183-5p是否能通过靶向KLHL24调控TNBC细胞的增殖、侵袭、迁移及铁死亡的敏感性，通过揭示miR-183-5p/KLHL24轴在TNBC进展及细胞调控中的作用，进一步丰富TNBC发生发展的分子理论基础，为未来开发基于诱导铁死亡的靶向治疗策略提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 生信分析

1.1.1 基因表达综合数据库（GEO）

通过http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/下载GSE38167、GSE40525、GSE45666和GSE59247数据集数据（表1）。

1.1.2 癌症基因组图谱数据库（TCGA）

通过https：//portal.gdc.cancer.gov/下载TCGA-乳腺癌数据集数据，利用R语言limma包对下载的GEO及TCGA数据集数据进行差异分析，筛选出在乳腺癌组织和正常乳腺组织中差异表达的RNA。

1.1.3 miRWalk数据库

http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/预测可能与miR-183-5p相互作用靶基因。

1.1.4 miRDB数据库

通过https：//mirdb.org/预测可能与miR-183-5p相互作用靶基因。

1.1.5 StarBase数据库（StarBase v3.0）

通过https：//rnasysu.com/encori/预测可能与miR-183-5p相互作用靶基因。

1.1.6 TarBase数据库（TarBase v8.0）

通过https：//dianalab.e-ce.uth.gr/tarbasev9预测可能与miR-183-5p相互作用靶基因。

1.1.7 FerrDb V2数据库（FerrDb V2）

通过http：//www.zhounan.org/ferrdb/current/归纳整理铁死亡相关基因，并将其与miRWalk、miRDB、StarBase及TarBase预测可能与miR-183-5p相互作用靶基因取交集。

1.1.8 Kaplan-Meier Plotter数据库（Kaplan-Meier plotter： online survival analysis software）

通过https：//kmplot.com/analysis/对可能的靶基因进行差异分析。

1.1.9 微生信数据库

通过https：//www.bioinformatics.com.cn。用于预测miR-183-5p与KLHL24之间的结合位点。

1.2 细胞培养

本研究所用细胞均购自ATCC。培养条件：使用添加10%胎牛血清和含有1%青-链霉素双抗的DMEM培养基，放置在5% CO₂的37 ℃培养箱中以支持细胞生长。细胞处于成长对数期时，使用Lipofectamine™ 2000（Invitrogen）进行瞬时质粒转染，并根据实验需要转染不同质粒进行分组。本实验中转染所用质粒构建均由上海吉凯基因完成。

1.3 反转录实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

收取正常乳腺上皮细胞MCF-10A和转染24 h后的乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、SKBR-3），加入Trizol提取总RNA，评估获得的总RNA质量并进行反转录实验，接着根据2×SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒说明，以反转录生成的cDNA为模板，使用U6作为内参进行扩增。实验结束后进行测试数据的统计学分析。miR-183-5p和U6的引物序列（表2），由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。

1.4 双荧光素酶报告基因实验

构建KLHL24 3'-UTR的野生型报告载体（pGL3-KLHL24 3'-UTR-WT）以及突变型报告载体（pGL3-KLHL24 3'-UTR-MUT），分别与miR-183-5p过表达质粒和对照质粒共同转染至293T细胞内。孵育48 h后，对细胞进行裂解处理，并将裂解后的产物与反应液充分混合后进行检测。

1.5 Western blotting检测

将各组转染后的细胞培养48 h后，使用RIPA裂解进行总蛋白提取，并将提取的蛋白样品放入EP管内，加入5×上样缓冲液，在沸水中加热15 min变性。随后进行蛋白上样、电泳、封闭、孵育一抗、孵育二抗、ECL显色，最后利用ImageJ软件对显色的条带进行定量分析。内参为GAPDH。实验抗体浓度：GAPDH（1∶1000）；KLHL24（1∶1000）；ATF2（1∶1000）；GPX4（1∶1000）；SLC7A11（1∶1000）；Nrf2（1∶1000）。

1.6 EdU细胞增殖实验

将各组转染后的细胞培养48 h后，在爬片上按适当密度接种，按照BeyoClick^TMEdU-594试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）说明书操作，染色结束后进行封片，然后用荧光显微镜进行拍摄计数分析。

1.7 Transwell侵袭实验

将各组转染后的细胞培养48 h后，分取各组细胞进行计数，使用纯培养液进行细胞重悬，在提前涂好Matrigel胶的Transwell小室上层以相同密度接种，小室下层加入正常的完全培养基。放入培养箱内培养24 h后，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，去除上室中未穿膜细胞，再用Giemsa染液进行细胞染色，然后用纯水洗去多余染料自然晾干，最后进行拍摄计数分析。

1.8 划痕愈合实验

将各组转染后的细胞培养48 h后，分取各组的细胞以相同密度接种于六孔板中。培养24 h后，用移液器的吸头垂直于细胞层上进行划痕。随后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗细胞2次，并用1%血清的维持浓度培养液替换完全培养基，进行0 h拍照。培养24 h后，再进行24 h拍照并计算划痕的愈合情况。

1.9 检测活性氧（ROS）和脂质过氧化物（LPO）实验

1.9.1 ROS含量检测

将各组转染培养48 h的细胞以适当的密度铺入共聚焦小皿中，细胞完全贴壁后，吸弃原培养液，再按照北京盒子生工科技有限公司提供的ROS检测试剂盒说明书，加入1 mL稀释浓度为10 μmol/L的DCFH-DA，放入细胞培养箱内避光孵育20 min，再用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，加入1 mL正常培养液后观察拍照。

1.9.2 LPO含量检测

将各组转染培养48 h的细胞以适当的密度铺入共聚焦小皿中，在细胞完全贴壁后，按照Image-iT® Lipid Peroxidation Kit说明书（Invitrogen）向细胞中添加Image-iT® Lipid Peroxidation Sensor，使其最终浓度为10 μmol/L，在37 ℃下孵育30 min，去除培养基，并用PBS洗涤细胞3次，进行观察拍照。

1.10 丙二醛（MDA）含量和还原型谷胱甘肽（GSH）含量测定

按照MDA和GSH检测试剂盒（北京盒子生工科技有限公司）说明书，用提取液收集各组转染后培养48 h的细胞，在冰浴中进行超声破碎，设定离心条件4 ℃、8000 g，离心10 min。取部分上清液加入MDA检测试剂，放入沸水浴中加热60 min，然后用酶标仪进行定量检测；另取部分上清液加入GSH检测试剂室温避光反应10 min，然后用酶标仪进行定量检测。

1.11 统计学分析

本研究数据采用 GraphPad Prism 9.0进行统计分析。两组样本运用t检验进行比较，多组样本采用单因素方差分析进行差异分析。P<0.05被认为差异有统计学意义。所有实验均独立重复至少3次。

2 结果

2.1 目标miRNA的筛选

从GEO数据库获取的4个数据集及TCGA-乳腺癌数据集均经limma包进行差异表达分析（筛选标准：|log2FC|>1且adj. P value<0.05）。通过对差异表达miRNA取交集，韦恩图分析结果显示，miR-183是唯一在所有数据集中共同显著差异的miRNA（图1A）。其在各独立数据集及TCGA队列中均呈现一致的高表达模式（P<0.05，图1B~F）。鉴于miR-183前体可加工为具有不同功能的成熟体链（3p与5p），进一步对TCGA-乳腺癌数据库中的成熟miRNA数据进行分析。结果表明，miR-183-3p与miR-183-5p在乳腺癌组织中表达水平均显著高于癌旁正常乳腺组织（图1G、H）。miR-183-5p的表达上调更为显著（图1I）。本研究最终选定miR-183-5p进行后续功能与机制探索。

2.2 miR-183-5p靶基因的筛选

首先，综合miRWalk、miRDB、StarBase和TarBase数据库的预测结果，并与FerrDb V2数据库中收录的铁死亡相关蛋白进行交集分析，最终筛选出3个候选靶基因：KLHL24、ATF2和RBMS1（图2A）。进一步利用TCGA-乳腺癌数据集分析其表达特征发现，这3个基因在乳腺癌组织中的表达水平均低于正常组织（P<0.001，图2B~D）。预后生存分析结果显示，KLHL24与ATF2的高表达均与患者更长的总生存期相关（P<0.001，图2E、F），提示其可能具有抑癌作用；然而，RBMS1的高表达却与不良预后显著相关（P<0.001，图2G），显示出与其他两个基因不同的临床意义。过表达miR-183-5p后，KLHL24的蛋白表达显著下降（P<0.0001，图2H、I），而ATF2的表达未发生明显改变（P>0.05，图2J、K）。RT-qPCR结果显示，与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比，miR-183-5p在MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、SKBR-3等细胞中的表达均上升，且在MDA-MB-231细胞中表达最高（图2L）。基于此，本研究选定MDA-MB-231细胞开展后续功能实验。

2.3 miR-183-5p与KLHL24存在结合位点

通过微生信平台预测到二者之间存在互补结合位点（图3A）。实验结果显示，与共转染miR-183-5p mimic和突变型报告载体（KLHL24-MUT）的对照组相比，共转染miR-183-5p mimic和野生型报告载体（KLHL24-WT）的细胞其荧光素酶活性显著降低（P<0.001），而共转染miR-183-5p mimic和突变型报告载体（KLHL24-MUT）后荧光素酶活性没有改变（P>0.05，图3B），结果证实了miR-183-5p可与KLHL24的3'UTR区特异性结合。

2.4 miR-183-5p通过靶向负调控KLHL24增强TNBC细胞增殖、迁移和侵袭能力

EdU细胞增殖实验结果显示，与对照组相比，单独过表达miR-183-5p提高了TNBC细胞中的EdU阳性细胞比率，证实其具有促进细胞增殖的作用，上调KLHL24则能显著抑制阳性细胞比率，在过表达miR-183-5p的基础上重新引入KLHL24可逆转其促增殖效应（P<0.0001，图4A、B）。在细胞迁移能力方面，伤口愈合实验得到了相似的结果：与对照组相比，miR-183-5p过表达显著加速了伤口的愈合，而KLHL24过表达则抑制了迁移。同样，同时过表达KLHL24有效抵消了miR-183-5p的促迁移作用（P<0.001，图4C、D）。此外，Transwell侵袭实验同样证实，miR-183-5p能显著增强TNBC细胞的侵袭能力，KLHL24过表达则抑制了侵袭，并且miR-183-5p增强侵袭的能力亦可被KLHL24的过表达所拮抗（P<0.0001，图4E、F）。

2.5 miR-183-5p通过负向调控KLHL24的表达抑制铁死亡的发生

ROS检测实验结果显示：与对照组相比，过表达miR-183-5p显著降低细胞内的ROS水平；相反，过表达KLHL24则引起ROS的显著累积；此外，在miR-183-5p过表达的基础上共表达KLHL24，可显著逆转miR-183-5p引起的ROS水平降低（图5A）。LPO的检测结果与ROS结果一致，miR-183-5p过表达导致细胞内LPO含量降低，而KLHL24过表达组LPO含量明显增加；同样共表达KLHL24能够消除miR-183-5p过表达引起的LPO含量的降低（图5B）。在氧化损伤与抗氧化系统的检测中，发现了相同的趋势。miR-183-5p过表达显著降低了MDA的生成量（P<0.0001，图5C），并提高了GSH的含量（P<0.0001，图5D）。KLHL24过表达则产生了完全相反的效应，导致MDA水平升高（P<0.0001，图5C）而GSH水平下降（P<0.0001，图5D）。而在过表达miR-183-5p的基础上共表达KLHL24，则显著消除了miR-183-5p对MDA生成的抑制作用，并使GSH含量恢复至接近对照组的水平（P>0.05，图5C、D）。Western blotting结果表明：与对照组相比，过表达miR-183-5p可上调GPX4、SLC7A11和Nrf2蛋白表达（P<0.05），过表达KLHL24则显著下调上述蛋白表达（P<0.05，图5E~H），且共表达KLHL24可逆转miR-183-5p对这些蛋白的上调效应。

3 讨论

乳腺癌是全球女性健康面临的最严峻挑战之一，其中TNBC因高复发转移率和缺乏有效靶点而预后极差^{［2， 3］}。本研究通过实验证实，miR-183-5p可直接靶向抑制KLHL24的表达，进而促进TNBC细胞的增殖与侵袭迁移，并同时抑制铁死亡的发生。这一结果首次揭示了miR-183-5p/KLHL24调控轴在同时协调TNBC细胞生长、转移与铁死亡抵抗中的关键作用，为阐释TNBC恶性进展的调控机制提供了新的实验依据。

近年来，非编码RNA尤其是miRNA在肿瘤调控中的作用备受关注^{［18， 19］}。多项研究提示，miR-183-5p在乳腺癌、骨肉瘤、前列腺癌、甲状腺癌、非小细胞肺癌以及胆管癌中等多种肿瘤中扮演癌基因角色^［20-25］。本研究在TNBC中通过EdU实验、Transwell侵袭和划痕愈合实验验证了其作用，并进一步将其功能拓展至细胞死亡调控的新维度。与既往研究主要关注其对增殖、迁移的调控不同，本研究通过铁死亡指标检测实验发现miR-183-5p是肿瘤细胞用以降低铁死亡敏感性的关键因子。为进一步明确其分子机制，我们通过Western blotting实验检测了铁死亡核心通路相关蛋白的表达，结果显示与铁死亡指标ROS、LPO、MDA和GSH检测结果一致，明确了miR-183-5p可以通过负向调控KLHL24，上调GPX4、SLC7A11和Nrf2蛋白的表达，进而清除细胞内过量脂质过氧化物，维持细胞内氧化与抗氧化平衡，最终抑制TNBC细胞铁死亡。

KLHL24作为Cullin 3-RING泛素连接酶复合物的底物识别亚基，主要参与蛋白质稳态的调控^［26］。尽管此前有研究曾通过生物信息学将其与细胞自噬及铁死亡等过程相关联，可以作为急性髓系白血病^［27］和膀胱癌^［28］的潜在预后生物标志物，甚至在肺鳞状细胞癌中发现了涉及KLHL24基因间区的致癌性NTRK3融合事件^［29］。但其是否参与调控铁死亡，尚缺乏实验证据。本研究通过功能实验证实，KLHL24是介导miR-183-5p促癌效应的关键下游分子。过表达KLHL24可逆转miR-183-5p对增殖、迁移和侵袭的促进作用；更重要的是，KLHL24过表达能显著下调铁死亡核心通路相关蛋白表达，从而诱导TNBC细胞内脂质过氧化物累积并耗竭抗氧化剂，而这一促铁死亡效应可被miR-183-5p抵消。这些发现首次在功能上将KLHL24定义为TNBC中一个不可或缺的铁死亡正调控因子，使其从“静态”的关联标志物转变为“动态”的功能执行者。

通过上述实验，本研究揭示了miR-183-5p通过负向调控KLHL24促进TNBC细胞进展同时抑制铁死亡的信号通路。该通路不仅解释了miR-183-5p如何同时促进增殖、迁移、侵袭并抑制铁死亡，更重要的是，它串联了非编码RNA调控与细胞死亡执行机制。这为理解肿瘤细胞如何利用miRNA广泛调控细胞命运提供了新的模型。在TNBC临床治疗面临严峻耐药挑战的背景下，靶向该调控轴展现出双重治疗潜力：抑制miR-183-5p或恢复KLHL24表达，既可直接遏制肿瘤进展，又能重建其对铁死亡的敏感性，从而为克服传统及新兴治疗的抵抗提供新思路。当然，本研究结论主要源于体外细胞模型，该调控轴在体内复杂的肿瘤微环境中是否受其他因素的影响，尚需在动物模型中进一步验证。

综上所述，本研究发现并验证了miR-183-5p-KLHL24-铁死亡这一新的调控通路在TNBC进展中的重要作用。这些发现深化了对TNBC多维恶性表型协同调控机制的理解，为开发以该通路为靶点、兼具抑制增殖和诱导铁死亡的新型治疗策略提供了重要的理论与实验基础。

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基金资助

国家自然科学基金(82373043)

山东省自然科学基金(ZR2022MH311)

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