蓝靛果多糖的分离纯化及免疫调节活性研究

Isolation, purification and immunomodulatory activity of polysaccharide from Lonicera caerulea L. var. edulis Turcz. ex Herder

摘要

目的 旨在从蓝靛果（L. caerulea）中分离提取出一种新型纯化蓝靛果多糖（THP-2），探究其免疫调节活性。 方法 采用超声辅助水提醇沉法和凝胶柱层析等技术对L. caerulea进行多糖分离提取与纯化工艺，通过凝胶渗透色谱、离子色谱、高碘酸氧化与smith降解、红外光谱、核磁共振波谱以及刚果红实验等多组学方法，系统表征THP-2的相对分子质量、纯度及化学结构进行表征和分析。体外细胞实验采用DC2.4细胞和Raw264.7细胞模型对THP-2免疫调节活性进行初步评价。 结果 本研究从L. caerulea中分离纯化出一种新型多糖组分THP-2，其化学组成和结构特征与既往文献报道的蓝靛果多糖（THP）存在显著差异。该多糖的平均相对分子质量为123 090，单糖组分包括糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，摩尔比为27.84∶52.28∶8.47∶6.05∶2.75∶0.90∶0.88∶0.83。糖苷键分析表明，THP-2主要由（1→5）、（1→3）、（1→4）、（1→6）、（1→3，4）、（1→6，4）等糖苷键组成。免疫活性研究表明，THP-2能够显著激活DC2.4细胞的共刺激分子CD80、CD86、CD40、MHC-Ⅱ的表达（P<0.05），促进促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌（P<0.05），同时上调Raw264.7细胞的共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达（P<0.05），增强促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达（P<0.05）。此外，THP-2还能促进DC2.4细胞与Raw264.7细胞NO合成相关分子iNOS表达（P<0.05），增加NO分泌量（P<0.05），上调胞内促炎相关蛋白p-p65、p-IκB表达水平（P<0.05），增加DC2.4细胞的p-Akt蛋白含量（P<0.05）。 结论 本研究成功从L. caerulea中分离纯化出一种新型多糖组分THP-2，并对其化学结构进行了系统鉴定和表征。THP-2主要通过激活NF-κB信号通路和PI3K/Akt通路促进DC2.4细胞成熟分化，并通过NF-κB通路促进Raw264.7细胞向M1型巨噬细胞分化的能力。

Abstract

Objective To isolate a novel polysaccharide (THP-2) from Lonicera caerulea L.var. edulis Turcz. ex Herder (L. caerulea) and evaluate its immunomodulatory activity. Methods Ultrasonic-assisted water extraction and alcohol precipitation and gel column chromatography were used to separate and purify polysaccharides from L.caerulea. The relative molecular mass, purity and chemical structure of THP-2 were analyzed by gel permeation chromatography, ion chromatography, periodate oxidation and smith degradation, infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance spectroscopy and Congo red experiment. DC2.4 cells and Raw264.7 cells were used to evaluate the immunomodulatory activity of THP-2. Results A new polysaccharide component THP-2 was isolated and purified from L.caerulea, and its chemical composition and structural characteristics were significantly different from those of L.caerulea polysaccharide reported previously. The average relative molecular mass of THP-2 was 123 090, and its monosaccharide components included sugar, galactose, glucose, mannose, xylose, glucuronic acid and galacturonic acid with a molar ratio of 27.84:52.28:8.47:6.05:2.75:0.90:0.88:0.83. Glycosidic bond analysis showed that THP-2 was mainly composed of (1→5), (1→3), (1→4), (1→6), (1→3,4), (1→6,4) and other glycosidic bonds. THP-2 could activate expressions of costimulatory molecules CD80, CD86, CD40 and MHC-II and promote IL-1β, IL-6 and TNF-α secretion in DC2.4 cells, up-regulate CD80, CD86 and CD40 expressions and enhance the expressions of IL-1β, IL-6 and TNF-α in Raw264.7 cells. THP-2 also promoted iNOS expression, increased NO secretion, and up-regulated p-p65 and p-IκB expressions in both cells, and increased p-Akt protein content in DC2.4 cells. Conclusion The new polysaccharide component THP-2 isolated from L.caerulea is capable of promoting maturation and differentiation of DC2.4 cells by activating the NF‑κB signaling pathway and PI3K/Akt pathway and promoting the differentiation of Raw264.7 cells into M1 macrophages through the NF-κB pathway.

Graphical abstract

关键词

蓝靛果 / 多糖 / 化学结构 / 免疫调节 / 细胞极化

Key words

Lonicera caerulea L. var. edulis Turcz. ex Herder / polysaccharide / chemical structure / immune regulation / cell polarization

植物多糖因其广谱的治疗特性和相对较低的毒性^［1］已成为新型免疫调节剂开发的热门选项^{［2， 3］}，其所具有的糖残基及糖苷键被认为可能与病原体相关分子模式（PAMPs）结构存在相似之处，从而能被免疫细胞的模式识别受体（PRRs）所识别，进而使植物多糖具有改变免疫细胞的活动的功能^{［4， 5］}。

L. caerulea为忍冬科忍冬属的一种耐寒的落叶灌木的果实，其营养成分丰富具有诸多生物活性^{［6， 7］}，如L. caerulea的花青素具有显著的抗肿瘤、调节血胆固醇、护肝的作用^［8-10］；L. caerulea的多酚也具有抗氧化、抗菌等良好的生物活性^{［7， 11］}。但目前L. caerulea成分的活性研究仍主要集中在L. caerulea中的多酚和花色苷上，目前关于THP的研究已取得一定进展，现有研究已证实其具备抗糖基化、降血糖、抗氧化、抗肿瘤和降脂活性等生物活性^{［12， 13］}。但对于THP的研究仍存在明显局限：一方面，目前尚未见THP在免疫活性领域的相关报道；另一方面，具有免疫调节活性的THP的结构和免疫调节机制仍不清楚。这阻碍了L. caerulea作为新资源食品的开发，因此有必要探索具有免疫调节活性的THP并进一步鉴定多糖的结构。树突状细胞及巨噬细胞作为免疫功能的重要参与者，其功能低下会使正常免疫功能下降并导致疾病的发生，如肠道感染^［14］、哮喘^［15］、肿瘤^［16-19］以及多种自身免疫性疾病的发生发展^［20-24］。因而维系两种细胞的正常功能对于保持人体正常免疫功能进而改善疾病状态具有重要意义。基于THP的免疫调节潜力开展其对树突状细胞及巨噬细胞免疫活性作用的研究，对于可食用性免疫调节剂的开发及应用具有重要意义。基于此，本研究以L. caerulea为原料提取并分离纯化一种具有免疫调节活性的新型THP组分THP-2，通过鼠源树突状细胞系DC2.4及巨噬细胞系Raw264.7对THP-2的免疫调节活性进行初步探索，为L. caerulea开发成一种新资源食品提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 实验材料和试剂

1.1.1 实验材料

L. caerulea鲜果采自黑龙江省春市，采收时间为8~9月。

1.1.2 试剂

冰醋酸、溴化钾、无水乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸、95%乙醇、碳酸氢钠、EDTA-2Na（广州化学试剂厂）；葡萄糖醛酸标准品、半乳糖醛酸标准品、三氟乙酸、乙二醇、高碘酸钠、二氯甲烷、肌醇、吡啶、邻苯二甲酸氢钾（上海麦克林试剂）；p-p65兔抗、p65兔抗、p-Akt兔抗、Akt兔抗、p-IκB兔抗、IκB兔抗（Immunoway）；HRP-鼠二抗、HRP-兔二抗（santa cruz）；APC-CD80、PerCP-Cy5.5-CD40、APC-CD86、PE-MHC-II（Biolegend）；胎牛血清、DMEM培养基、1640培养基、Trypsin-0.025%EDTA、青/链双抗（Gibco）；PIPA裂解液、DCFH-DA探针、NO试剂盒、BCA试剂盒（上海碧云天生物）；Trizol、逆转录试剂盒、SYBR Green qPCR试剂盒（湖南艾科瑞生物）；TNF-α ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒（深圳欣博盛生物）；DEAE-琼脂糖-FF、葡聚糖-G100（北京索莱宝生物）。其他化学品和试剂为分析纯。

1.2 THP-2的提取与纯化

新鲜L. caerulea经冷冻干燥后粉碎成粉，与无水乙醇按1∶20（质量体积比）混合，在56 ℃条件下（超声频率45 kHz，功率200 W）进行30 min超声脱色处理。脱色处理后的果粉采用浸提法提取上清液，经旋蒸后得到浓缩液。浓缩液经Sevage法去除蛋白质后，通过旋蒸去除有机溶剂残留。透析处理在4 ℃条件下进行，使用去离子水，透析时间为48 h，每隔2 h更换1次透析液。透析后的浓缩液与无水乙醇按1∶3（体积比）混合，在4 ℃条件下静置24 h，获得粗多糖沉淀。沉淀经65 ℃烘干并碾碎，得到L. caerulea的粗多糖。将粗多糖溶于蒸馏水（浓度20 mg/mL），通过DEAE-琼脂糖FF凝胶柱进行分离。洗脱过程使用蒸馏水和0.1 mol/L NaCl溶液，流速控制在10 mL/min。每10 min收集1管洗脱液，以洗脱管数为横坐标、A_{490 nm}为纵坐标绘制洗脱曲线。收集单一洗脱峰对应的洗脱液，经冷冻干燥得到纯化多糖。纯化多糖通过葡聚糖G-100凝胶层析进一步纯化，最终获得THP-2。

1.3 化学结构表征

1.3.1 化学成分测定

糖含量、蛋白质含量分别以苯酚硫酸法、BCA蛋白定量法进行检测。

1.3.2 相对分子质量

本研究采用渗透色谱法（日本岛津）对THP-2进行相对分子质量测定。将THP-2溶解于0.2 mol硫酸钠溶液中，配制成浓度为2 mg/mL的THP-2水提取物。使用0.22 μm水性滤膜对提取液进行过滤，以去除可能存在的杂质颗粒。将处理后的THP-2水提取物待测样品与0.2 mol/L硫酸钠溶液（作为流动相）一同注入色谱柱中。实验条件设置为：流动相流速0.6 mL/min，柱温25 ℃。检测过程中采用示差折光检测器进行信号采集。同时，分别测定不同相对分子质量的葡聚糖标准品（T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000）的响应值，通过线性回归方法绘制相对分子质量标准曲线，为后续THP-2的相对分子质量分析提供校准依据。

1.3.3 单糖成分的测定

THP-2的单糖组成采用离子色谱法进行分析，所用仪器为Thermo离子色谱仪，配备Dionex Carbopac™ PA20柱（3×150 mm）。取10 mg THP-2，加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，充分混合溶解后密封，于105 ℃条件下水解6 h。水解完成后，将反应液置于旋转蒸发仪中浓缩至干。随后重复加入甲醇并旋蒸，以彻底去除残留的三氟乙酸。去除三氟乙酸后，用水将水解产物复溶，并使用0.22 μm水性滤膜进行过滤，得到待测样品液。将该样品液注入离子色谱仪中进行单糖成分分析。同时，分别配制各单糖标准品及不同浓度的混合单糖标准溶液，采用相同条件进行检测，用于单糖的定性和定量分析。

1.3.4 高碘酸氧化和Smith降解

THP-2（25 mg）在20 ℃条件下，加入25 mL 15 mmol/L高碘酸钠溶液，在避光环境中进行氧化反应。分别在反应开始后的0、6、12、24、36、48、60 h，取0.1 mL反应液，用去离子水稀释250倍后，测定吸光度A_{233 nm}。待吸光度趋于稳定后，加入2 mL乙二醇终止反应，并通过高碘酸钠标准曲线和NaOH滴定法，分别计算样品中高碘酸钠的消耗量和甲酸的生成量。将剩余的反应液装入透析袋中，于去离子水中透析48 h，去除小分子杂质后旋蒸浓缩，用蒸馏水定容至10 mL。随后加入40~70 mg硼氢化钠固体，在避光条件下还原反应24 h。反应结束后，用醋酸中和过量的硼氢化钠，并再次透析48 h。再次旋蒸浓缩后加入4 mL 2 mol/L三氟乙酸，在105 ℃下水解6 h。水解完成后，旋蒸去除三氟乙酸，用甲醇复溶水解产物，再次旋蒸以彻底去除残留的三氟乙酸。最后，将水解产物与相应标准品分别进行糖腈乙酸酯衍生化处理。衍生化产物采用气相色谱法进行分析，仪器为Thermo气相色谱仪，色谱柱为Thermo TRACETM TR-WaxMS GC色谱柱。程序升温条件如下：初始温度80 ℃，以8 ℃/min的速率升温至200 ℃，恒温2 min，继续以8 ℃/min升温至230 ℃，恒温3 min。

1.3.5 刚果红实验

THP-2（1.5 mg）溶解成1 mg/mL THP溶液，和80 μmol/L刚果红溶液200 μL，震荡混匀，用波长在190~1100 nm的紫外-近红外光对样品进行扫描，随后加入NaOH溶液充分混合，使NaOH浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L，每完成1次滴加即重新扫描光谱，记录每次扫描的最大吸收波长，同时以不加任何样品的刚果红溶液作为阴性对照。

1.3.6 紫外光谱、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振测定

将L. caerulea粗多糖和THP-2样品分别配制成1 mg/mL的水溶液，使用紫外分光光度计（日本岛津）在190~1100 nm波长范围内进行紫外-可见光谱扫描，以分析样品在该波段的吸收特性。红外光谱分析采用红外光谱仪（Bruker），在4000~400 cm^-1波数范围内，分辨率为4 cm^-1。首先，取150 mg干燥的溴化钾粉末制备无样品空白压片，用于基线校正。随后，将0.5 mg干燥的THP-2与150 mg溴化钾粉末充分混合并研磨均匀，压制成透光片，进行红外光谱测定，以表征其结构特征。核磁共振分析在核磁共振仪（Bruker）上进行。称取40 mg THP-2，用重水溶解后冷冻干燥。随后，用600 μL含0.01% TMSP的重水溶液复溶，并使用1 mL注射器将其转移至核磁管中。测定其¹H核磁共振谱和¹³C核磁共振谱，以进一步解析THP-2的分子结构。

1.4 免疫活性实验

1.4.1 细胞增殖能力检测（MTT法）

采用MTT法检测THP-2干预对DC2.4细胞活力的影响。DC2.4细胞及Raw264.7细胞分别采用DMEM、1640完全培养基（含10%胎牛血清及1%双抗）培养。取对数生长期的Raw264.7细胞和DC2.4细胞，其中，Raw264.7细胞稀释为1×10⁴/mL的细胞悬液，DC2.4稀释为2.5×10⁴/mL悬液，取200 μL悬液铺于96孔板内，待细胞贴壁，弃去培养基。加入200 μL含不同浓度THP-2（50、100、200、400、800 μg/mL）的完全培养基，干预24 h。弃去培养基，加入MTT基础培养基（0.5 mg/mL）培养2 h，弃去上清，加入200 μL的DMSO溶液，置于96孔板孵育器中，室温中速震荡5 min，随后采用酶标仪Thermo测量A_{570 nm}。公式：Cell viability（%）=（A_测定-A_对照空白）×100%/（A_对照-A_对照空白），其中A_对照表示对照组的吸光度均值，A_对照空白表示对照组背景吸光度均值。

1.4.2 细胞干预

THP-2对DC2.4细胞及Raw264.7细胞进行梯度浓度干预（25、50、100、200 μg/mL）。对Raw264.7细胞和DC2.4细胞分别使用0.1 μg/mLLPS和2.5 μg/mL LPS作为阳性对照。Raw264.7细胞和DC2.4细胞的铺板密度分别为2.5×10⁴/mL和5×10⁴/mL。

1.4.3 细胞成熟标志物的流式分析

采用细胞流式检测THP-2对LPS干预的DC2.4细胞成熟标志物（细胞表面共刺激分子及MHC-II分子）的影响。将1.4.2干预24 h的DC2.4细胞或Raw264.7细胞使用PBS洗2次。加入10 mmol/LEDTA PBS溶液解离细胞3 min，离心留取细胞沉淀。流式缓冲液清洗细胞2次后重悬细胞，加入CD16/CD32抗体染色15 min，封闭Fc受体，流式缓冲液清洗细胞2次。重悬细胞后加入对应的流式抗体，4 ℃避光染色20 min，流式缓冲液清洗细胞3次。收集细胞至流式管，采用流式细胞仪（BD）检测。公式：MFI relative expression （Mean）=A_x/A_对照，其中A_x表示各组的MFI均值，A_对照表示与A_x相同批次对照组的MFI均值。

1.4.4 一氧化氮和细胞因子的商用试剂盒检测

收集1.4.2干预24 h后的DC2.4细胞或Raw264.7细胞上清液，分别使用一氧化氮检测试剂盒和ELISA试剂盒检测一氧化氮、TNF-α和IL-6水平。

1.4.5 DCFH-DA法检测细胞内ROS含量

基础培养基洗涤1.4.2干预24 h后的DC2.4细胞或Raw264.7细胞3次。细胞与DCFH-DA在黑暗中孵育20 min后，使用基础培养基洗涤3次，并用基础培养基覆盖细胞后，进行检测，使用荧光显微镜观察，酶标仪（Thermo）定量检测，检测的激发波长为488 nm，检测波长为525 nm。

1.4.6 qRT-PCR

取1.4.2干预后的DC2.4细胞或Raw264.7细胞，PBS洗2次。使用Trizol试剂分离总RNA。确定mRNA浓度后，根据制造商说明，使用逆转录试剂盒逆合成cDNA。在QuantStudio 6系统上使用SYBR Green Master Mix对编码CD80、CD86、CD40、IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS基因的cDNA完成qRT-PCR。实验结束后收集样品Ct值，并使用2^^-ΔΔCt法计算样品目的基因mRNA的表达量。用于扩增的引物序列购自北京擎科生物科技股份有限公司（表1）。目标基因的mRNA表达水平通过GAPDH进行标准化。

1.4.7 蛋白质印迹法

取1.4.2干预后的DC2.4细胞或Raw264.7细胞，PBS洗2次，加入含有磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液并收集。裂解液离心取上清液。采用BCA法检测蛋白浓度。将定量上清液与5×蛋白上样缓冲液混合煮沸后制得蛋白上样样品。取适量蛋白提取物（35 μg）用10% SDS-PAGE分离2 h，电泳转移到PVDF膜上，在室温使用5% BSA TBST溶液封闭2 h。加入抗体稀释液（p-p65 1∶1000、p65 1∶1000、p-Akt 1∶1000、Akt 1∶2000、p-IκB 1：2000、IκB 1∶2000）4 ℃孵育过夜。用TBST洗膜3次。加入HRP偶联二抗稀释液（1∶2000），室温孵育2 h，再次使用TBST洗膜3次，随后使用显影液进行化学发光显影。测量并量化波段强度。

1.4.8 统计学分析

采用SPSS23.0软件对数据进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析；非正态分布的计量资料以中位数表示，组间比较采用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 THP-2的分离纯化

通过热水浸提法获得L. caerulea粗多糖，经DEAE-琼脂糖FF凝胶层析法纯化粗多糖，观察到4个洗脱峰，分别命名为THP-1、THP-2、THP-3、THP-4（图1A）。THP-2获得量相对较高，因此通过葡聚糖G-100凝胶层析法收集纯化多糖THP-2洗脱液（图1B），经过透析和冷冻干燥收集纯化多糖THP-2进行后续研究。高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）结果显示，THP-2平均相对分子质量为123 090，是一种相对分子质量相对均一的大相对分子质量多糖（图1C）。经苯酚硫酸法和BCA蛋白定量法绘制标准曲线计算得到粗多糖和THP-2糖含量分别为（68.40±0.02）%和（85.29±0.01）%（图1D、E），蛋白质含量分别为（12.43±0.16）%和（2.31±0.22）%。

2.2 THP-2的单糖组成

THP-2的三氟乙酸水解产物离子色谱结果显示，THP-2是一种以半乳糖及阿拉伯糖等多种糖残基组成的弱酸性杂多糖，主要由阿拉伯糖（Ara）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glu）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）及少量的岩藻糖（Fuc）、葡萄糖醛酸（GluA）、半乳糖醛酸（GalA）组成，其对应的摩尔百分比为：Ara∶Gal∶Glu∶Man∶Xyl∶Fuc∶GluA：GalA=27.84∶52.28∶8.47∶6.05∶2.75∶0.90∶0.88∶0.83（图2）。

2.3 高碘酸氧化和Smith降解

THP-2在加入高碘酸氧化后24~72 h吸光度值均不发生明显变化，高碘酸氧化反应完全。THP-2平均每1 mol糖残基消耗高碘酸0.693 mol，生成甲酸0.216 mol，在忽略还原端糖残基的情况下，THP-2中至少存在（1→）键、（1→6键）中的其中1种，以及存在（1→2）键、（1→4）、（1→4，6）、（1→2，6）键中的其中1种，且含有较多的不具备连二羟基、连三羟基结构的糖苷键连接方式。THP-2的Smith降解产物结果显示，Smith降解产物中存在乙二醇、丙三醇及赤藓糖醇，且THP-2中存在（1→4）或（1→4，6）糖苷键中的1种，及（1→2）或（1→2，6）糖苷键中的1种。气相色谱中还检测到对应的单糖分子，表明含有（1→3）或（1→3，4）、（1→3，6）、（1→2，3）等的糖苷键连接（图3）。

2.4 刚果红实验

在未加或仅有低浓度NaOH的状态下，THP-2与刚果红的混合溶液较阴性对照而言，最大吸收波长发生明显红移，但红移程度在低浓度NaOH范围内随NaOH浓度的升高而变大，THP-2可以与刚果红发生结合，使最大吸收波长发生红移（图4A）。

2.5 紫外光谱、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振分析

核酸和蛋白质分别在紫外光谱260 nm和280 nm左右存在特征吸收峰。粗多糖及THP-2的紫外光谱扫描结果显示，粗多糖存在一定量的蛋白残留，与多糖蛋白浓度测定的结果一致；而THP-2的蛋白含量较粗多糖有明显降低。此外，无论是粗多糖还是THP-2，在260 nm处均无明显吸收峰，粗多糖及THP-2没有明显的核酸分子残留（图4B、C）。

THP-2的傅里叶变换红外光谱结果显示，3412.02 cm^-1处吸收峰归因于O-H的伸缩振动，多糖中含有丰富的羟基。2929.83 cm^-1处吸收峰归因于C-H键伸缩振动。1643.33 cm^-1处吸收峰归因于羰基对称伸缩振动，多糖分子内含有羧基。1415.73 cm^-1处吸收峰归因于C-H键的变角振动。1377.15~1261.43 cm^-1处吸收峰归因于O-H键的变角振动，其中1377.15 cm^-1及1309.65 cm^-1处吸收峰归因于羧基上O-H的变角振动，1269.00 cm^-1与1261.43 cm^-1处吸收峰为其他羟基的变角振动峰。1059 cm^-1及1045.40 cm^-1吸收峰归因于糖环内C-O-C伸缩振动。986.89 cm^-1与777.30 cm^-1吸收峰归因于吡喃糖环的非对称伸缩振动和对称伸缩振动。877.13 cm^-1处的肩峰为甘露糖的特征吸收峰。波数小于700 cm^-1的吸收峰为糖环内碳链及游离糖环外的碳原子与氢原子的振动形成（图4D）。

THP-2一维核磁共振H谱（图5A）及¹³C谱（图5B）结果显示，在THP-2的氢谱中，属于异头氢的化学位移信号分别为5.25、5.16、4.55、4.47、4.52、4.50、4.54、4.66、4.63及5.12 ppm，对应的异头碳信号为109.23、107.49、104.35、103.68、103.40、103.13、102.60、101.63、100.13、99.36 ppm，信号分别来自（1→5）-a-L-阿拉伯呋喃糖、（1→3）-α-L-阿拉伯呋喃糖、（1→4）-β-D-半乳糖、（1→3，4）-β-D-木糖、（1→6）-β-D-葡萄糖、（1→4，6）-β-D-葡萄糖、（1→4）-β-D-葡萄糖、（1→4）-β-D-甘露糖、（1→4，6）-β-D-甘露糖、（1→6）-α-D-葡萄糖。THP-2具体的糖残基化学位移（表2）。

2.6 免疫活性实验

2.6.1 THP-2对DC2.4细胞增殖和细胞成熟的影响

以不同浓度THP-2（50~800 μg/mL）在96孔板中干预树突状细胞DC2.4 24 h后，经MTT法检测发现，仅200 μg/mL THP-2对DC2.4细胞有明显促增殖作用（P<0.05），400 μg/mL、800 μg/mL THP-2对细胞存在轻微抑制，其余浓度（50 μg/mL及以下）对细胞增殖影响不明显，小于200 μg/mL的浓度范围可作为THP-2对DC2.4细胞的干预浓度（图6）。选取25、50、100、200 μg/mL THP-2进行干预24 h，并以LPS为阳性对照，通过流式检测细胞成熟标志物（共刺激分子CD80、CD86、CD40及MHC-II）发现，与未干预对照组相比，THP-2干预后DC2.4细胞的上述标志物表达均有所提高，其中CD80、CD40、CD86、MHC-II的平均荧光强度高于对照组（P<0.05），但THP-2干预后CD80、CD40、CD86、MHC-II的表达增长水平均未超过2.5 μg/mL LPS阳性对照组（图7）。

续图7

2.6.2 THP-2对DC.2细胞因子表达的影响

THP-2能上调DC2.4细胞共刺激分子表达，干预24 h时DC2.4细胞的CD80 mRNA（P<0.05）、CD86 mRNA（P<0.05），CD40 mRNA表达（P<0.05）较对照组均升高；同时，THP-2干预24 h后DC2.4细胞TNF-α、IL-1β、iNOS、IL-6的mRNA表达水平均上升（P<0.05），呈现一定的剂量依赖性。细胞上清中IL-6、NO随THP-2干预后增高（P<0.05），但促进作用均弱于LPS（图8）。

2.6.3 THP-2对Raw264.7细胞增殖和细胞成熟的影响

MTT法检测24 h细胞增殖显示，200 μg/mL及以下浓度的THP-2对Raw264.7细胞增殖无明显影响，而高于该浓度则呈现抑制细胞增殖的现象（P<0.001，图9），即小于200 μg/mL的浓度范围可作为THP-2对Raw264.7细胞的干预浓度。选取25、50、100、200 μg/mL THP-2干预24 h，并以LPS为阳性对照，结果显示THP-2可上调共刺激分子表达（图10），干预24 h后CD80、CD40、CD86 mRNA水平均较对照组上升（P<0.05）。进一步检测发现THP-2能刺激细胞分泌促炎细胞因子，THP-2干预后，TNF-α、IL-1β、iNOS的mRNA含量提高（P<0.05），ELISA也证实细胞上清中TNF-α、IL-6、NO含量上升（P<0.05）。

2.6.4 THP-2对DC2.4细胞与Raw264.7细胞NF-κB通路及PI3K-Akt通路蛋白的影响

与对照组相比，THP-2干预后可增加DC2.4细胞中p-p65、p-IκB、p-Akt的含量（P<0.05），激活DC2.4细胞NF-κB与PI3K-Akt两条信号通路（图11A~C）。THP-2可激活Raw264.7巨噬细胞的NF-κB信号通路，Raw264.7巨噬细胞的Western blotting检测结果显示，p-p65、p-IκB水平随THP-2干预浓度增加而上升（P<0.05，图11D、E）。

3 讨论

本研究从L. caerulea中提取并分离纯化出一种新型多糖THP-2，平均相对分子质量为123 090，而紫外光谱表明THP-2具有良好的纯度。THP-2的化学结构上解析上，THP-2的傅里叶变换红外光谱显示出的2929.83 cm^-1处吸收峰、1415.73 cm^-1处吸收峰是典型的多糖特征峰^［25］，而刚果红实验提示THP-2并不是三螺旋结构，而是其他三维结构^［26］。单糖组成分析发现，THP-2是相对分子质量相对均一的大相对分子质量酸性杂多糖由半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖及少量岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸构成，丰富的单糖组成提示THP-2可能具备较为复杂的糖链结构。高碘酸氧化和Smith降解分析显示THP-2中含有大量（1→2）、（1→3）、（1→4）、（1→6）等的糖苷键连接。核磁共振1H谱和核磁共振¹³C进一步探究了THP-2的具体糖苷键组成，分析显示THP-2糖苷键组成丰富，主要为β-（1→3）、β-（1→4）和β-（1→6）糖苷键连接的葡萄糖单位组成的β-葡聚糖^［27-31］，但在核磁共振的结果中未找到岩藻糖、半乳糖醛酸及葡萄糖醛酸的相应信号，可能是由于含量较低，产生的信号被其他糖基的信号所掩盖。上述结果显示THP-2与既往THP研究中所提取的纯化多糖在单糖组成、摩尔比、糖苷键上均有差异^［12］，是一种新型THP。

同时，β-葡聚糖的免疫调节特性已被充分证实并广泛应用于功能性食品和制剂中^［32］。通常具有β-（1→3）、β-（1→6）分支链的β葡聚糖表现出更强的免疫激活，其作用机制可能与先天免疫细胞上的β-葡聚糖特异性受体如Dectin-1的亲和力更强而结合^［33］，从而促使适应性免疫的随后激活^［34］。而THP-2主要为β-葡聚糖结构，糖苷键主要有β-（1→3）、β-（1→4）和β-（1→6），而这种结构为与PRRs相互作用、具备免疫调节活性提供了理论基础。

DC2.4及Raw264.7细胞在体内同属于先天免疫细胞，且都具备启动适应性免疫应答的能力，但两者在启动免疫应答的职能上存在不同：树突状细胞主要职能是负载抗原并迁入淋巴结及其他淋巴器官的胸腺依赖区内，负责活化初始淋巴细胞，启动全新的适应性免疫应答；而巨噬细胞也能摄取抗原并进行提呈但不直接活化初始T细胞^［35］，其更显著的作用是发挥固有免疫功能，并参与机体组织修复及慢性炎症中组织重构等过程^［36-38］。因此，研究THP-2对两种细胞的免疫调节功能具有重要意义。DC2.4细胞及Raw264.7细胞在病原体、脂多糖刺激下会活化成熟，表现为MHC-II分子、共刺激分子CD80、CD86、CD40上调^［39-41］，分泌IL-1β、TNF-α^［42］、IL-6^［43］，产生NO并上调iNOS mRNA^{［44， 45］}。实验显示THP-2能上调DC2.4的MHC-II类分子及共刺激分子CD80、CD86、CD40使其呈成熟表型，qPCR实验结果显示THP-2对DC2.4细胞CD80 mRNA和CD40 mRNA促表达作用弱于阳性对照，符合流式细胞术实验结果，但对DC2.4细胞CD86 mRNA促表达作用相较于阳性对照组呈现了不同于流式细胞术实验的结果，这提示THP-2可能作为共刺激分子的激活剂，但对于维持mRNA稳定性的作用弱于阳性对照组，这使得THP-2有希望作为一种温和的免疫调节剂被开放。

此外，THP-2不仅能促进Raw264.7共刺激分子CD80、CD86、CD40的mRNA表达，也显著促进DC2.4细胞及Raw264.7细胞IL-1β、IL-6、TNF-α和iNOS表达，提高NO分泌，提示THP-2通过促进细胞因子分泌增强机体免疫应答，通过诱导NO生成，增强了两种细胞对病原体及异常组织细胞的杀伤能力，也印证THP-2可诱导Raw264.7向M1型巨噬细胞分化成熟。且实验结果显示低剂量THP-2对刺激巨噬细胞产生促炎因子的作用弱于LPS，这也再次提示THP-2是一种更加温和的促免疫调节剂。并且THP-2不仅对DC2.4细胞促增殖作用弱于低浓度经典刺激物LPS，而且高浓度时可以抑制Raw264.7细胞增殖，这与具有促进Raw264.7细胞增殖作用的LPS不同^［46］，这提示THP-2与LPS两者对DC2.4细胞和Raw264.7细胞的作用机制存在差异^［47］。有学者采用6种商业化β-葡聚糖作用髓状树突细胞，发现髓状树突细胞明显激活，CD40、CD80、CD86和MHCII在不同程度上调^［48］；有学者发现酵母来源的β-葡聚糖可以在体外和体内激活并成熟小鼠/人类的DC细胞，从而增强Ag特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞反应^［49］；也有研究发现了一种酵母来源的β-葡聚糖可以增强成熟巨噬细胞的功能反应^［50］，以上研究均与本文的研究结果一致。

PI3K-Akt信号通路在免疫细胞成熟的调节中发挥重要作用。Akt蛋白磷酸化可以促进IκB上游蛋白IKK的磷酸化，磷酸化的IKK则能催化IκB的磷酸化进而正向调控NF-κB通路，而转录因子NF-κB广泛参与细胞生长存活增殖，对抗原提呈细胞（APC）功能调节及分化至关重要。此外NF-κB信号通路是PRRs信号转导的主要下游效应通路之一。当PRRs被激活后，其产生的多种免疫效应会通过NF-κB信号通路介导实现，这一特点在富含PRRs的树突状细胞和巨噬细胞表现突出。因而研究NF-κB及PI3K-Akt信号通路对了解THP-2如何影响树突状细胞DC2.4和巨噬细胞Raw264.7分化成熟具有重要意义^［51-55］。实验表明THP-2能增加DC2.4及Raw264.7的p-IκB、p-p65表达，其中p-IκB表达的上升可以减少对NF-κB的抑制作用。而在外界刺激的NF-κB信号通路激活过程中，p65通常被认为是最早发挥转录功能且转录活性最强的NF-κB亚基^［56］，p-IκB、p-p65表达的共同上升说明NF-κB信号通路对THP-2促进DC2.4及Raw264.7的活化成熟具有重要作用。DC2.4中p-Akt升高提示PI3K-Akt通路参与THP-2促其活化成熟的调控，故THP-2促DC2.4成熟或经NF-κB及PI3K-Akt通路介导，促Raw264.7向M1型分化或主要由NF-κB通路介导。有研究从柚子皮中提取的多糖CPE-II可以激活RAW 264.7细胞MAPKs和NF-κB信号通路，增加NO产生，被鉴定为一种潜在有用的免疫刺激剂^［57］；有研究制备的苦荬菜多糖KMCP可以激活Raw264.7细胞的NF-κB信号通路来增强免疫调节活性，但强度略低于LPS组，支持KMCP有可能成为一种有效的免疫增强剂^［58］；也有研究制备的亚组分堇青花多糖对刺激THP1-Blue细胞的NF-κB转录活性具有剂量依赖性^［59］，有望成为免疫调节食品。这些结果进一步证明了THP-2具备开发为免疫调节产品的可能。

综上所述，本研究成功从蓝靛果中提取出一种新型多糖组分THP-2，并体外验证其具有良好的免疫调节功能，可以促进树突状细胞DC2.4成熟分化和巨噬细胞Raw264.7向M1型分化。THP-2在体内的免疫调节功能研究仍有待补充，现有结果为将来进一步研究THP-2以开发蓝靛果作为一种具有丰富营养的新资源食品提供理论基础。

参考文献

[1] Schepetkin IA, Quinn MT. Botanical polysaccharides: Macrophage immunomodulation and therapeutic potential[J]. Int Immunopharmacol, 2006, 6(3): 317-33. doi：10.1016/j.intimp.2005.10.005

[2] Yin M, Zhang Y, Li H. Advances in research on immunoregulation of macrophages by plant polysaccharides[J]. Front Immunol, 2019, 10: 145. doi：10.3389/fimmu.2019.00145

[3] 黎美枫, 焦峪坤, 刘红菊, 等. 红花夹竹桃中提取的多糖具有较好的免疫调节活性[J]. 广东医科大学学报, 2025, 43(5): 506-14.

[4] Wang DX, Li H, Li B, et al. Systematic fractionation and immunoenhancement of water-soluble polysaccharides isolated from fruit of Morus alba L[J]. Int J Biol Macromol, 2018, 116: 1056-63. doi：10.1016/j.ijbiomac.2018.05.106

[5] Zhao ZH, Dai H, Wu XM, et al. Characterization of a pectic polysaccharide from the fruit of Ziziphus jujuba [J]. Chem Nat Comp, 2007, 43(4): 374-6. doi：10.1007/s10600-007-0141-y

[6] Senica M, Bavec M, Stampar F, et al. Blue honeysuckle (Lonicera caerulea subsp. edulis (Turcz. ex Herder) Hultén.) berries and changes in their ingredients across different locations[J]. J Sci Food Agric, 2018, 98(9): 3333-42. doi：10.1002/jsfa.8837

[7] Gołba M, Sokół-Łętowska A, Kucharska AZ. Health properties and composition of honeysuckle berry Lonicera caerulea L. an update on recent studies[J]. Molecules, 2020, 25(3): 749. doi：10.3390/molecules25030749

[8] Wang YH, Li B, Ma Y, et al. Lonicera caerulea berry extract attenuates lipopolysaccharide induced inflammation in BRL-3A cells: Oxidative stress, energy metabolism, hepatic function[J]. J Funct Foods, 2016, 24: 1-10. doi：10.1016/j.jff.2016.03.023

[9] Zhang CP, Li WH, Liu JR, et al. The effective analysis for blue honeysuckle extract in the treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Evid Based Complement Altern Med, 2022, 2022: 9601020. doi：10.1155/2022/9601020

[10] Park M, Yoo JH, Lee YS, et al. Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice[J]. Nutrients, 2019, 11(3): 494. doi：10.3390/nu11030494

[11] Raudsepp P, Anton D, Roasto M, et al. The antioxidative and antimicrobial properties of the blue honeysuckle (Lonicera caerulea L.), Siberian rhubarb (Rheum rhaponticum L.) and some other plants, compared to ascorbic acid and sodium nitrite[J]. Food Control, 2013, 31(1): 129-35. doi：10.1016/j.foodcont.2012.10.007

[12] Ma CL, Bai JW, Shao CT, et al. Degradation of blue honeysuckle polysaccharides, structural characteristics and antiglycation and hypoglycemic activities of degraded products[J]. Food Res Int, 2021, 143: 110281. doi：10.1016/j.foodres.2021.110281

[13] Pei FY, Cao XB, Wang XM, et al. Structural characteristics and bioactivities of polysaccharides from blue honeysuckle after probiotic fermentation[J]. LWT, 2022, 165: 113764. doi：10.1016/j.lwt.2022.113764

[14] Baumgart DC, Metzke D, Guckelberger O, et al. Aberrant plasmacytoid dendritic cell distribution and function in patients with Crohn’s disease and ulcerative colitis[J]. Clin Exp Immunol, 2011, 166(1): 46-54. doi：10.1111/j.1365-2249.2011.04439.x

[15] Upham JW, Zhang GC, Rate A, et al. Plasmacytoid dendritic cells during infancy are inversely associated with childhood respiratory tract infections and wheezing[J]. J Allergy Clin Immunol, 2009, 124(4): 707-13.e2. doi：10.1016/j.jaci.2009.07.009

[16] Gerhard GM, Bill R, Messemaker M, et al. Tumor-infiltrating dendritic cell states are conserved across solid human cancers[J]. J Exp Med, 2021, 218(1): e20200264. doi：10.1084/jem.20200264

[17] Roberts EW, Broz ML, Binnewies M, et al. Critical role for CD103⁺/CD141⁺ dendritic cells bearing CCR7 for tumor antigen trafficking and priming of T cell immunity in melanoma[J]. Cancer Cell, 2016, 30(2): 324-36. doi：10.1016/j.ccell.2016.06.003

[18] Belgiovine C, D'Incalci M, Allavena P, et al. Tumor-associated macrophages and anti-tumor therapies: complex links[J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(13): 2411-24. doi：10.1007/s00018-016-2166-5

[19] Chittezhath M, Dhillon MK, Lim JY, et al. Molecular profiling reveals a tumor-promoting phenotype of monocytes and macrophages in human cancer progression[J]. Immunity, 2014, 41(5): 815-29. doi：10.1016/j.immuni.2014.09.014

[20] Ganguly D, Haak S, Sisirak V, et al. The role of dendritic cells in autoimmunity[J]. Nat Rev Immunol, 2013, 13(8): 566-77. doi：10.1038/nri3477

[21] Vitali C, Mingozzi F, Broggi A, et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells[J]. Blood, 2012, 120(6): 1237-45. doi：10.1182/blood-2011-09-379776

[22] Jiang ZL, Jiang JX, Zhang GX. Macrophages: a double-edged sword in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Immunol Lett, 2014, 160(1): 17-22. doi：10.1016/j.imlet.2014.03.006

[23] Wynn TA, Chawla A, Pollard JW. Macrophage biology in development, homeostasis and disease[J]. Nature, 2013, 496(7446): 445-55. doi：10.1038/nature12034

[24] Wucherpfennig KW. Mechanisms for the induction of autoimmunity by infectious agents[J]. J Clin Invest, 2001, 108(8): 1097-104. doi：10.1172/jci200114235

[25] Wiercigroch E, Szafraniec E, Czamara K, et al. Raman and infrared spectroscopy of carbohydrates: a review[J]. Spectrochim Acta Part A Mol Biomol Spectrosc, 2017, 185: 317-35. doi：10.1016/j.saa.2017.05.045

[26] 张猛猛. 玛咖根部多糖的结构鉴定及免疫调节活性的研究[D]. 广州: 华南理工大学, 2019.

[27] Yao HYY, Wang JQ, Yin JY, et al. A review of NMR analysis in polysaccharide structure and conformation: Progress, challenge and perspective[J]. Food Res Int, 2021, 143: 110290. doi：10.1016/j.foodres.2021.110290

[28] Hannuksela T, Hervé du Penhoat C. NMR structural determination of dissolved O-acetylated galactoglucomannan isolated from spruce thermomechanical pulp[J]. Carbohydr Res, 2004, 339(2): 301-12. doi：10.1016/j.carres.2003.10.025

[29] Yuan YF, Wang YB, Jiang YM, et al. Structure identification of a polysaccharide purified from Lycium barbarium fruit[J]. Int J Biol Macromol, 2016, 82: 696-701. doi：10.1016/j.ijbiomac.2015.10.069

[30] Zhao T, Mao GH, Feng WW, et al. Isolation, characterization and antioxidant activity of polysaccharide from Schisandra sphenanthera [J]. Carbohydr Polym, 2014, 105: 26-33. doi：10.1016/j.carbpol.2014.01.059

[31] Huang LL, Zhao J, Wei YL, et al. Structural characterization and mechanisms of macrophage immunomodulatory activity of a pectic polysaccharide from Cucurbita moschata Duch[J]. Carbohydr Polym, 2021, 269: 118288. doi：10.1016/j.carbpol.2021.118288

[32] He WW, Li ZP. Deciphering immunoregulatory mechanisms and structure-guided biosynthesis of β-glucans[J]. Carbohydr Polym, 2025, 368(Pt 2): 124254. doi：10.1016/j.carbpol.2025.124254

[33] Brown GD, Gordon S. A new receptor for β-glucans[J]. Nature, 2001, 413(6851): 36-7. doi：10.1038/35092620

[34] Liu YF, Zhang JS, Tang QJ, et al. Physicochemical characterization of a high molecular weight bioactive β-d-glucan from the fruiting bodies of Ganoderma lucidum [J]. Carbohydr Polym, 2014, 101: 968-74. doi：10.1016/j.carbpol.2013.10.024

[35] Martinez-Pomares L, Gordon S. Antigen presentation the macrophage way[J]. Cell, 2007, 131(4): 641-3. doi：10.1016/j.cell.2007.10.046

[36] Shapouri-Moghaddam A, Mohammadian S, Vazini H, et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease[J]. J Cell Physiol, 2018, 233(9): 6425-40. doi：10.1002/jcp.26429

[37] Mantovani A, Biswas SK, Galdiero MR, et al. Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling[J]. J Pathol, 2013, 229(2): 176-85. doi：10.1002/path.4133

[38] Kloc M, Ghobrial RM, Wosik J, et al. Macrophage functions in wound healing[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2018: term.2772. doi：10.1002/term.2772

[39] He TP, Tang CK, Xu SL, et al. Interferon gamma stimulates cellular maturation of dendritic cell line DC2.4 leading to induction of efficient cytotoxic T cell responses and antitumor immunity[J]. Cell Mol Immunol, 2007, 4(2): 105-11.

[40] Khatua S, Simal-Gandara J, Acharya K. Understanding immune-modulatory efficacy in vitro [J]. Chem Biol Interact, 2022, 352: 109776. doi：10.1016/j.cbi.2021.109776

[41] Kong LB, Smith W, Hao DJ. Overview of RAW_264.7 for osteoclastogensis study: Phenotype and stimuli[J]. J Cell Mol Med, 2019, 23(5): 3077-87. doi：10.1111/jcmm.14277

[42] Weber A, Wasiliew P, Kracht M. Interleukin-1β (IL-1β) processing pathway[J]. Sci Signal, 2010, 3(105): e3105cm2. doi：10.1126/scisignal.3105cm2

[43] Tanaka T, Narazaki M, Kishimoto T. IL-6 in inflammation, immunity, and disease[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2014, 6(10): a016295. doi：10.1101/cshperspect.a016295

[44] Robbins RA, Grisham MB. Nitric oxide[J]. Int J Biochem Cell Biol, 1997, 29(6): 857-60. doi：10.1016/s1357-2725(96)00167-7

[45] Cinelli MA, Do HT, Miley GP, et al. Inducible nitric oxide synthase: Regulation, structure, and inhibition[J]. Med Res Rev, 2020, 40(1): 158-89. doi：10.1002/med.21599

[46] Hou GQ, Guo C, Song GH, et al. Lipopolysaccharide (LPS) promotes osteoclast differentiation and activation by enhancing the MAPK pathway and COX-2 expression in RAW_264.7 cells[J]. Int J Mol Med, 2013, 32(2): 503-10. doi：10.3892/ijmm.2013.1406

[47] Lutz MB, Kukutsch NA, Menges M, et al. Culture of bone marrow cells in GM-CSF plus high doses of lipopolysaccharide generates exclusively immature dendritic cells which induce alloantigen- specific CD4 T cell anergy in vitro [J]. Eur J Immunol, 2000, 30(4): 1048-52. doi：10.1002/(sici)1521-4141(200004)30:4<1048::aid-immu1048>3.0.co;2-w

[48] Rainer H, Goretzki A, Lin YJ, et al. Characterization of the immune-modulating properties of different β-glucans on myeloid dendritic cells[J]. Int J Mol Sci, 2024, 25(18): 9914. doi：10.3390/ijms25189914

[49] Ding J, Ning YL, Bai Y, et al. β‑Glucan induces autophagy in dendritic cells and influences T-cell differentiation[J]. Med Microbiol Immunol, 2019, 208(1): 39-48. doi：10.1007/s00430-018-0556-z

[50] Horneck Johnston CJH, Ledwith AE, Lundahl MLE, et al. Recognition of yeast β‑glucan particles triggers immunometabolic signaling required for trained immunity[J]. iScience, 2024, 27(3): 109030. doi：10.1016/j.isci.2024.109030

[51] Chen JZ, Gu WY, Zhao KN. The role of PI3K/Akt pathway in β‑glucan-induced dendritic cell maturation[J]. Int Immuno-pharmacol, 2011, 11(4): 529. doi：10.1016/j.intimp.2011.01.027

[52] Miao Y, Jiang M, Qi L, et al. BCAP regulates dendritic cell maturation through the dual-regulation of NF-kappaB and PI3K/AKT signaling during infection[J]. Front Immunol. 2020, 11: 250. doi：10.3389/fimmu.2020.00250

[53] Zhang Y, Wang X, Yang H, et al. Kinase AKT controls innate immune cell development and function[J]. Immunology, 2013, 140(2): 143-52. doi：10.1111/imm.12123

[54] Vergadi E, Ieronymaki E, et al. Akt signaling pathway in macrophage activation and M1/M2 polarization[J]. J Immunol, 2017, 198(3): 1006-14. doi：10.4049/jimmunol.1601515

[55] Zhao SJ, Kong FQ, Jie J, et al. Macrophage MSR1 promotes BMSC osteogenic differentiation and M2-like polarization by activating PI3K/AKT/GSK3beta/beta-catenin pathway[J]. Theranostics. 2020, 10(1): 17-35. doi：10.7150/thno.36930

[56] Hayden MS, Ghosh S. NF‑κB in immunobiology[J]. Cell Res, 2011, 21(2): 223-44. doi：10.1038/cr.2011.13

[57] Shin MS, Park SB, Shin KS. Molecular mechanisms of immunomodulatory activity by polysaccharide isolated from the peels of Citrus unshiu [J]. Int J Biol Macromol, 2018, 112: 576-83. doi：10.1016/j.ijbiomac.2018.02.006

[58] Luo B, Dong LM, Xu QL, et al. Characterization and immunological activity of polysaccharides from Ixeris polycephala [J]. Int J Biol Macromol, 2018, 113: 804-12. doi：10.1016/j.ijbiomac.2018.02.165

[59] Kouakou K, Schepetkin IA, Yapi A, et al. Immunomodulatory activity of polysaccharides isolated from Alchornea cordifolia [J]. J Ethnopharmacol, 2013, 146(1): 232-42. doi：10.1016/j.jep.2012.12.037

基金资助

广东省自然科学基金(2025A1515010492)

广东省自然科学基金(2023A1515011065)

RIGHTS & PERMISSIONS

版权所有©《南方医科大学学报》编辑部2021