柴胡疏肝散抑制C3/C3aR介导小胶质细胞M1极化改善绝经综合征肝郁证模型小鼠的海马突触可塑性

Chaihu Shugan San inhibits C3/C3aR-mediated microglial M1 polarization to improve hippocampal synaptic plasticity in mice with menopausal syndrome with liver qi stagnation

摘要

目的 探讨柴胡疏肝散调节C3/C3aR介导M1型小胶质细胞极化改善绝经综合征（MPS）肝郁证的作用机制。 方法 将56只SPF级雌性C57BL/6小鼠按照体质量分层随机分为假手术组（n=13）和去势手术组（n=43）。手术过程中假手术组小鼠死亡1只，去势手术组小鼠死亡4只、3只造模未成功，故予以剔除。去势手术组小鼠摘除双侧卵巢建立绝经期模型后，再分为绝经组、绝经肝郁组和柴胡疏肝散组，12只/组。其中，绝经肝郁组和柴胡疏肝散组均采用双侧卵巢去势联合慢性温和不可预知应激（CUMS）法建立MPS肝郁证模型。柴胡疏肝散组给予6.47 g/kg柴胡疏肝散混悬液灌胃28 d，其余各组小鼠灌胃等剂量生理盐水。通过阴道脱落细胞涂片和行为学评价模型；ELISA法检测血清性激素、神经递质，血清和海马炎症因子水平；HE染色法观察海马组织形态；高尔基染色法观察海马神经元树突棘形态；免疫荧光法检测海马CA1区小胶质细胞相关标志物、突触可塑性相关蛋白；Western blotting检测海马补体C3（C3）/补体C3a受体（C3aR）通路相关蛋白。 结果 与假手术组比较，去势小鼠动情周期紊乱，绝经肝郁组小鼠表现出抑郁样行为（P<0.01）；血清性激素和神经递质水平异常（P<0.01），血清和海马炎症因子含量增加（P<0.01）；海马CA1区神经元细胞数量减少、排列紊乱且核固缩，树突棘数量减少；海马CA1区小胶质细胞相关标志物表达增加（P<0.01）、突触可塑性相关蛋白荧光表达降低（P<0.01）；C3/C3aR通路相关蛋白表达增加（P<0.05，P<0.01）。与绝经肝郁组比较，柴胡疏肝散干预后可改善MPS肝郁小鼠的抑郁样行为（P<0.05，P<0.01）；血清性激素和神经递质水平逆转（P<0.05，P<0.01），血清和海马炎症因子含量降低（P<0.01）；海马CA1区神经元细胞数量增加、排列有序，树突棘数量增加、形态改善；海马CA1区小胶质细胞相关标志物表达逆转，突触可塑性相关蛋白荧光强度增强（P<0.01）；海马C3/C3aR通路相关蛋白表达下调（P<0.05，P<0.01）。 结论 柴胡疏肝散可以改善MPS肝郁模型小鼠海马突触可塑性，其作用机制与抑制C3/C3aR信号通路介导小胶质细胞M1极化有关。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Chaihu Shugan San (CSS) for treatment of menopausal syndrome (MPS) with liver qi stagnation. Methods Fifty-six female C57BL/6 mice were randomized into sham-operated group (n=13) and bilateral ovariectomy (OVX) groups (n=43), and the latter group was further randomized equally into menopausal group, menopausal liver qi stagnation (MPS+CUMS) group subjected to chronic unpredictable mild stress (CUMS), and CSS treatment group (with CSS gavage at daily dose of 6.47 g/kg for 28 days). MPS model establishment was validated by vaginal smears and behavior tests. The levels of sex hormones, neurotransmitters, and inflammatory cytokines in the serum and hippocampus were measured by ELISA. Hippocampal morphology was observed using HE and Golgi staining, and immunofluorescence staining and Western blotting were used to detect the expressions of microglial markers, synaptic plasticity proteins and C3/C3aR pathway proteins in the hippocampal CA1 region. Results The OVX mice showed disrupted estrous cycles. The MPS+CUMS mice exhibited obvious depression-like behaviors, abnormal sex hormones and neurotransmitters, elevated inflammatory factors, hippocampal CA1 neuronal loss with disordered arrangement and pyknosis, reduced dendritic spines, increased microglial markers, decreased synaptic plasticity proteins, and upregulated C3/C3aR pathway. All these changes were significantly improved or corrected after CSS treatment in MPS+CUMS mice. Conclusion CSS alleviates MPS with liver qi stagnation possibly by inhibiting C3/C3aR-mediated M1 microglial polarization and improving synaptic plasticity.

Graphical abstract

关键词

绝经综合征 / 肝郁证 / 柴胡疏肝散 / 小胶质细胞 / C3/C3aR信号通路

Key words

menopausal syndrome / liver qi stagnation / Chaihu Shugan San / microglia / C3/C3aR pathway

绝经综合征（MPS）又称围绝经期综合征，是指女性在45~55岁绝经前后，因卵巢功能逐渐衰退及性激素水平的波动引起的以自主神经功能紊乱为主、伴精神心理障碍的一系列症候群^［1］，属中医“经断前后诸证”“脏躁”“郁证”“月经不调”等范畴。近年来，随着社会生活节奏加快及精神压力增大，MPS的发病率呈显著上升趋势。因其病程迁延、症状复杂，且常伴发抑郁状态，不仅影响女性从生育期向绝经期的正常过渡，更对其身心健康与生活质量造成长期负面影响，已成为全球范围内备受关注的公共健康问题^{［2， 3］}。

现代医学认为，MPS的发生发展与下丘脑-垂体-卵巢轴（HPO轴）功能失调密切相关，由此引发的“神经-内分泌-免疫”网络紊乱是其重要病理基础^{［4， 5］}。海马作为应激反应与情绪调节的关键脑区，对此紊乱尤为敏感^［6］。长期慢性压力与激素变化可共同作用于海马，一方面直接导致神经元损伤与突触可塑性下降，另一方面则通过激活小胶质细胞等免疫细胞，引发神经炎症，进一步损害海马的结构与功能^［7］。作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，小胶质细胞在海马区密集分布。它们不仅是免疫监视者，更通过突触修剪与神经营养支持，直接调控突触可塑性^［8，9］。其中，补体系统补体C3（C3）/补体C3a受体（C3aR）通路是介导小胶质细胞活化与突触异常修剪的重要免疫环节，其激活与神经炎症及突触可塑性受损密切相关^［10］。研究表明^［11-13］，肝失疏泄所致的情志异常与海马神经免疫微环境及突触功能改变存在潜在关联，这为从该视角探究疏肝理气剂的作用机制提供了理论依据。

中医学认为，女子以肝为先天，以血为本。绝经期肾气渐衰，精血不足，肝失所养，疏泄失常，加之此期女性多面临来自社会和家庭方面双重压力，易致情志不畅，气机郁滞，形成“肝气郁结”这一核心病机，临床多见抑郁、焦虑、烦躁等情志异常表现^［14］。柴胡疏肝散出自《景岳全书》，是疏肝理气剂的代表方，临床运用柴胡疏肝散治疗MPS患者，可有效缓解其抑郁与焦虑情绪^［15］。课题组前期研究发现，柴胡疏肝散可通过调控ERK1/2-CREB-BDNF^［16］、SIK2-CRTC1等信号通路^［17］、神经递质和炎症因子^［18］，改善MPS肝郁证小鼠海马突触可塑性及抑郁样行为。然而，柴胡疏肝散改善MPS肝郁证突触可塑性的作用，是否与其调节海马小胶质细胞的极化功能状态有关，目前尚未阐明。基于此，本研究旨在探讨柴胡疏肝散是否通过调控海马小胶质细胞极化及C3/C3aR信号通路，改善突触可塑性，从而缓解MPS肝郁证抑郁样行为，为柴胡疏肝散“疏肝解郁”功效提供新的分子机制解释，旨在丰富MPS的病因病机。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

56只SPF级雌性C57BL/6小鼠，8~12周龄，体质量18±2 g，许可证号：SCXK（泸）2022-0004，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。所有动物实验均通过福建中医药大学医学伦理委员会的审批（伦理批号：FJTCM IACUC 2024028）。

1.1.2 药品及试剂

柴胡疏肝散采用《景岳全书》原方，柴胡6 g、白芍4.5 g、枳壳4.5 g、川芎4.5 g、陈皮6g、香附4.5 g、炙甘草1.5 g（福建中医药大学附属第三人民医院）；巴氏染色试剂盒、苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（索莱宝科技）；小鼠雌二醇（E₂）ELISA试剂盒（伊莱瑞特）；小鼠促卵泡激素（FSH）ELISA试剂盒（优尔生生物）；小鼠促黄体生成素（LH）ELISA试剂盒（睿信生物科技）；小鼠γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸（Glu）ELISA试剂盒（酶免实业）；小鼠肿瘤坏死因子a（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒（睿信生物科技）；离子钙结合适配器分子1（Iba1）抗体（华安生物技术）；诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抗体、C3抗体（三鹰生物）；精氨酸酶1（Arg-1）、磷酸化信号传导及转录激活蛋白3（pSTAT3）抗体（CST）；突触后致密蛋白95（PSD95）抗体（Immunoway）；突触结合蛋白-1（SYT-1）抗体（赛默飞）；C3aR抗体（华安生物技术）；信号传导及转录激活蛋白3（STAT3）抗体（康何欣生物科技）。

1.1.3 实验仪器

小动物行为识别分析系统（CLEVER SYS INC）；荧光显微镜（Carl Zeiss）；生物组织包埋机、石蜡切片机、冰冻切片机（Leica）；多功能酶标仪（Tecan）；组织匀浆机（万柏生物科技）；垂直电泳系统、湿转仪（Bio-rad）；化学发光成像系统（赛维尔生物科技）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、模型制备及干预给药

56只SPF级雌性C57BL/6小鼠适应性喂养3周后，按体质量分层方法随机分为假手术组（n=13）和去势手术组（n=43）。假手术组小鼠仅切除卵巢周围脂肪组织，去势手术组则摘除双侧卵巢以建立绝经期模型。手术过程中假手术组小鼠死亡1只，去势手术组小鼠死亡4只、3只造模未成功，故予以剔除。最终将36只制备成功的绝经期小鼠随机分为绝经组（MPS）、绝经肝郁组（MPS+CUMS）、柴胡疏肝散组（CSS），12只/组。其中，绝经肝郁组与柴胡疏肝散组均接受为期28 d的慢性温和不可预知应激（CUMS）以建立肝郁证模型。刺激方法包括：夹尾（5 min）、禁食/禁水（24 h）、束缚（2 h）、潮湿垫料（24 h）、4 ℃冰水游泳（5 min）、热刺激（5 min）、鼠笼倾斜（45 ℃，24 h）、光照刺激（24 h）。应激模式应随机化开展，同类型应激的间隔≥48 h，累计应用≥3次，应激强度需相对均衡，强弱交替进行。在肝郁证造模同时，根据小鼠与人的药物等效剂量换算，柴胡疏肝散组予柴胡疏肝散混悬液灌胃干预（6.47 g/kg），其余各组则给予等体积0.9%生理盐水进行灌胃，1次/d，持续干预28 d。

1.2.2 巴氏染色法观察小鼠阴道脱落细胞变化

采集各组小鼠阴道脱落细胞，参照巴氏染色试剂盒操作规范进行染色，光学显微镜下观察各组小鼠阴道脱落细胞形态的变化，评估模型建立是否成功。

1.2.3 行为学检测小鼠抑郁焦虑样行为

在CUMS造模前后，所有小鼠均进行体质量测量，并通过旷场实验（OFT）、蔗糖水偏好实验（SPT）、强迫游泳（FST）、悬尾实验（TST）评价肝郁证模型的建立情况。

1.2.4 样本采集

第2次行为学实验结束后，小鼠禁食（不禁水）12 h，经异氟烷吸入麻醉后，采用摘眼球法采集全血以分离血清。采血完成后，颈椎脱臼处死动物，每组取3只小鼠进行心脏灌注，先后以0.9%氯化钠溶液与4%多聚甲醛各50 mL灌注固定，随后摘取全脑并浸泡于4%多聚甲醛固定液中后固定，再以流水冲洗24 h。固定好的全脑沿矢状面左右切开，一半放入75%乙醇溶液中，待后续HE染色；另一半脑组织依次经15%、20%、30%蔗糖水（PBS与蔗糖配比调制）梯度沉糖，每梯度72 h，脱水完成后，进行免疫荧光染色观察。此外，每组再各选3只，不需进行心尖灌注，直接打开颅骨，迅速取出全脑，超纯水清洗表面血液，浸泡于提前24 h配置好的高尔基浸泡液（试剂盒内溶液A∶溶液B=1∶1，提前24 h配置，静置后无沉淀的上清液），1脑1管（15 mL EP管）避光保存待后续高尔基染色。每组剩余小鼠脱颈处死后，冰上迅速分离海马组织，置于-80℃冰箱中保存备用，待后续ELISA和Western blotting检测。

1.2.5 ELISA法检测血清E₂、FSH、LH、Glu、GABA含量，血清和海马IL-1β、TNF-α含量

采用ELISA对各组小鼠血清E₂、FSH、LH、Glu、GABA，血清和海马IL-1β、TNF-α指标进行定量检测，所有操作均严格依据试剂盒说明书进行。

1.2.6 HE染色法观察海马神经元形态变化

4%多聚甲醛固定小鼠全脑，常规石蜡包埋切片（6 μm），采用HE试剂盒染色，中性树胶封片，光学显微镜观察。

1.2.7 高尔基染色观察海马神经元树突棘形态

按照FD Rapid GolgiStain™ Kit说明书进行高尔基染色，观察神经元树突棘形态与密度。小鼠全脑于通风橱内避光浸泡于高尔基试剂A、B混合液中共2周（首次过夜后更换新液，每周轻晃2次，5 s/次），随后转入溶液C浸泡72 h（中间换液1次）。取出脑组织修整后，OCT包埋，-80 ℃成型；于-22~-20 ℃条件下以100 μm厚度匀速切片。玻片预先滴加溶液C，贴片后吸干多余液体，室温避光风干24~48 h。风干后的玻片用超纯水低速摇床清洗2次（4 min/次），按1∶1∶2比例现配溶液D、E与超纯水混合工作液，染缸内加盖摇床染色10 min。染色后再以超纯水清洗2次（4 min/次），依次经50%、75%、95%、100%酒精梯度脱水各4 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ透明各4 min。最后以中性树脂封片，避光风干，显微镜下观察海马CA1区神经元树突棘形态与数量。

1.2.8 免疫荧光法检测海马区小胶质细胞活化相关蛋白及突触相关蛋白荧光表达

4%多聚甲醛固定小鼠全脑，经15%~30%蔗糖溶液梯度沉糖后，OCT包埋，冰冻切片（10 μm）后，PBS洗涤，滴加自发荧光淬灭剂A液，PBS洗涤并擦净后血清封闭，一抗（Iba1 1∶1000，iNOS 1∶200，Arg1 1∶200，PSD95 1∶100，SYT-1 1∶500）4℃过夜孵育，PBS洗涤后，二抗（CY3 山羊抗兔IgG 1∶100，FITC山羊抗大鼠1∶200）室温避光孵育1 h，PBS洗涤后滴加自发荧光淬灭剂B液，流水冲洗后，DAPI染色、封片，荧光显微镜观察并拍片，利用Image J软件分析阳性细胞数量及相对荧光强度。

1.2.9 Western blotting检测海马组织经典补体通路相关蛋白水平

取脑组织海马区30~50 mg，加入蛋白裂解液，提取总蛋白，使用BCA试剂盒对各组蛋白浓度进行定量，每孔按40 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，湿法转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗（GAPDH 1∶50 000，C3 1∶2000，C3aR 1∶1000，STAT3 1∶800，pSTAT3 1∶1000），4 ℃孵育过夜，加入HRP标记二抗（山羊抗兔1∶5000，山羊抗鼠1∶20 000），37℃孵育1 h。ECL显色液显色，凝胶成像系统采集蛋白条带图像，并采用Image J软件分析目的蛋白与内参蛋白的条带灰度值，进行相对定量分析。

1.2.10 统计学分析

使用SPSS 24.0软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差表示。若数据符合正态分布且方差齐，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较时，若满足方差齐性则采用LSD方法，方差不齐时则选用Tamhane's T₂法做组间比较。若数据不符合正态分布，则进行多样本秩和检验，组间比较时，选择Kruskal-Wallis H检验，结果以中位数（四分位数间距）表示。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠阴道脱落细胞染色观察

巴氏染色结果显示，假手术组小鼠阴道脱落细胞涂片呈现规律的动情周期更替（图1A~D），具体表现为：动情前期涂片以有核上皮细胞居多，可见少量角化细胞；动情期角化细胞成为主要成分；动情后期可见有核上皮细胞、角化细胞与白细胞三者共存；至动情间期则以白细胞为主。相比之下，去势手术组小鼠涂片则持续处于动情间期状态（图1E~H），表现为规律动情周期消失。

2.2 小鼠雌激素水平变化

与假手术组比较，绝经组和绝经肝郁组血清E₂降低（P<0.01），FSH、LH含量升高（P<0.01）；与绝经肝郁组比较，柴胡疏肝散组血清E₂含量升高（P<0.01），FSH、LH含量降低（P<0.05，P<0.01，表1）。

2.3 柴胡疏肝散可以改善绝经综合征肝郁证小鼠的异常情志及行为

2.3.1 造模前各组小鼠基线比较

CUMS干预前，各组小鼠皮毛光泽致密，体质量组间比较无统计学差异（P>0.05），OFT移动总距离和中心区域停留时间、SPT蔗糖水偏好率、FST和TST不动时间均未见显著差异（P>0.05）。同时，小鼠表现活跃，喜攀爬，社交行为正常，情绪状态平稳。在造模及药物干预前，各组小鼠基线一致，具有可比性（表2）。

2.3.2 柴胡疏肝散改善小鼠肝郁状态

与假手术组相比，绝经组小鼠体质量有所升高，而绝经肝郁组均降低（P<0.01）；柴胡疏肝散组体质量较绝经肝郁组虽有所增加，但差异无统计学意义。行为学结果显示，与假手术组比较，在OFT中，绝经组、绝经肝郁组移动总距离下降（P<0.05，P<0.01），绝经肝郁组中心停留时间减少（P<0.01）；在SPT中，绝经组、绝经肝郁组蔗糖水偏好率下降（P<0.01）；在FST与TST中，绝经组、绝经肝郁组不动时间均延长（P<0.01）；与绝经肝郁组比较，柴胡疏肝散组OFT移动总距离增加（P<0.01）、中心停留时间增加（P<0.01），蔗糖水偏好率增加（P<0.01），FST与TST不动时间缩短（P<0.01，表3）。

CUMS干预后，与假手术组相比，绝经肝郁组小鼠出现被毛粗乱无光泽、散乱，常见同类互噬或自残所致区域性脱毛，行为上表现为喜聚堆、懒动、惊跳反应过度，表现出明显的情志、行为异常。结合体质量减轻与上述行为学指标变化，提示绝经肝郁组小鼠处于肝郁状态，经柴胡疏肝散干预后，上述肝郁相关表征均得到不同程度的改善。

2.4 柴胡疏肝散对小鼠血清神经递质的影响

与假手术组比较，绝经组、绝经肝郁组血清Glu含量升高（P<0.01），GABA含量降低（P<0.05，P<0.01）；与绝经肝郁组比较，柴胡疏肝散组血清Glu含量降低（P<0.01），GABA含量升高（P<0.01，表4）。

2.5 柴胡疏肝散对小鼠血清和海马炎症因子的影响

与假手术组比较，绝经组、绝经肝郁组血清和海马IL-1β、TNF-α含量升高（P<0.01）；与绝经肝郁组比较，柴胡疏肝散组血清和海马IL-1β、TNF-α含量降低（P<0.01，表5）。

2.6 柴胡疏肝散对小鼠海马CA1区神经元细胞形态的影响

假手术组海马神经细胞排列致密有序，数量丰富，细胞核形态规整、核仁清晰可见；与假手术组比较，绝经组、绝经肝郁组神经元排列稀疏紊乱，细胞间隙增宽，并可见核固缩、深染等神经元损伤表现；与绝经肝郁组小鼠相比，柴胡疏肝散组神经元细胞数量增多，核固缩现象减轻，神经元病理损伤得到改善（图2）。

2.7 柴胡疏肝散对小鼠海马CA1区神经元树突棘形态的影响

与假手术组比，低倍镜下，绝经组、绝经肝郁组神经元排列稀疏、胞体萎缩、突起断裂，高倍镜下树突棘数量减少、长度缩短、呈细短萎缩状；与绝经肝郁组比，低倍镜下柴胡疏肝散组神经元排列致密、胞体饱满、突起完整，高倍镜下树突棘数量增加、萎缩形态改善（图3）。

2.8 柴胡疏肝散对小鼠海马区小胶质细胞活化相关蛋白Iba1、Iba1/iNOS、Iba1/Arg1的影响

与假手术组比较，绝经组、绝经肝郁组海马CA1区Iba1、Iba1/iNOS、Iba1/Arg1阳性细胞数量明显增加（P<0.01）；与绝经肝郁组相比，柴胡疏肝散治疗后Iba1、Iba1/iNOS阳性细胞数量明显减少（P<0.01），Iba1/Arg1阳性细胞数量增加（P<0.01，图4）。

2.9 柴胡疏肝散对海马CA1区突触相关蛋白PSD95、SYT-1表达的影响

与假手术组比较，绝经组、绝经肝郁组海马CA1区PSD95、SYT-1荧光表达强度减少（P<0.01）；与绝经肝郁组相比，柴胡疏肝散治疗后PSD95、SYT-1荧光表达强度增加（P<0.01，图5）。

2.10 柴胡疏肝散对海马经典补体通路相关蛋白C3、C3aR、pSTAT3/STAT3表达的影响

与假手术组相比，绝经组海马 C3、pSTAT3/STAT3蛋白表达升高（P<0.05），C3aR蛋白表达升高（P<0.01）；绝经肝郁组C3、C3aR、pSTAT3/STAT3蛋白表达升高（P<0.01）。与绝经肝郁组相比，柴胡疏肝散组C3、C3aR表达降低P<0.01）、pSTAT3/STAT3蛋白表达降低（P<0.05，图6）。

3 讨论

根据中医理论，MPS根本病机在于“肾气渐衰，天癸将竭”，其核心在于肝气郁结。肝肾同源，精血互生，肾精亏虚则肝血失充，肝体失养，则疏泄不及，此为“因虚致郁”的内在基础^［19］。同时，绝经期女性常面临多重社会心理压力，情志不遂直接导致肝气郁结，即“因郁致病”的外在诱因^［20］。《血证论·脏腑病机论》云：“木气冲和调达，不致郁遏，则血脉得畅”，正阐述了肝主疏泄、调畅气机以维持气血平和的生理常态。反之，若肝失疏泄，则气机壅滞，百病由生，这与《陈素庵妇科补解》“妇人多居闺阁，性多执拗，忧怒悲思，一有郁结，则诸经受伤”的论述相互印证，不仅强调了女性易受七情所伤，肝气郁结进而扰动五脏的病理特点^{［21， 22］}，更进一步提示，肝气郁结不仅关乎情志异常，亦可通过气机不畅导致血行不利、津液输布障碍，进而影响脑窍清阳，这一整体观与现代“神经-免疫-内分泌网络”失调理论具有相通性。

柴胡疏肝散出自《景岳全书》，是临床常用的疏肝理气代表方剂。现代研究从多角度揭示其疗效机制：在分子机制研究层面，该方可调节HPA 轴、神经递质、神经元损伤信号通路、免疫调节与炎症反应等多靶点，在绝经经期抑郁模型中发挥抗抑郁作用^［23-26］；临床研究亦证实，运用柴胡疏肝散治疗MPS患者，能够显著提升整体疗效，帮助患者调节不良情绪，降低西药治疗相关副作用^{［15，27］}。课题组前期研究表明，柴胡疏肝散能改善MPS肝郁证小鼠的海马突触可塑性。然而，柴胡疏肝散改善MPS肝郁证突触可塑性的作用，是否与其调节海马小胶质细胞的极化功能状态有关，目前尚未有文献明确。因此，本研究从小胶质细胞入手，进一步揭示其调节MPS肝郁证海马突触可塑性的具体作用机制。

本研究采用“双侧卵巢去势+CUMS”联合造模法建立MPS肝郁证小鼠模型，选用遗传背景一致、神经结构与人类高度相似的C57BL/6雌性小鼠^［28］。绝经期模型采用双侧卵巢去势法，具有操作简便、周期短的优势；肝郁证模型采用CUMS法，通过长期、低强度的多种应激刺激模拟人类慢性心理压力，与中医“情志内伤-肝气郁结”病机高度契合。将去势手术与CUMS相结合，既可模拟MPS的“肾精亏虚”生理基础，又可诱发“肝气郁结”病理状态，实现了病证结合模型的构建^［29］。模型评价方面，绝经期模型通过阴道脱落细胞染色观察动情周期并结合血清性激素水平确认，结果显示去势后小鼠动情周期消失，血清E₂显著降低而FSH、LH显著升高^［30］；肝郁证模型则通过旷场实验、糖水偏好实验、强迫游泳实验和悬尾实验进行行为学评价^［31］，绝经肝郁组小鼠表现出探索欲望降低、快感缺失、行为绝望等抑郁样行为，且体质量增长减缓，与临床症状高度一致，而柴胡疏肝散干预可显著改善上述异常，从方证对应角度反向验证了模型的可靠性。此外，Glu与GABA作为大脑主要的兴奋性与抑制性神经递质，其稳态对维持正常情绪与认知至关重要^［32］。慢性应激可导致小胶质细胞释放Glu增加，引起细胞外Glu异常蓄积与GABA相对不足，进而通过激活谷氨酸受体诱发兴奋性神经毒性，损伤神经元与突触可塑性^［33］。围绝经期抑郁大鼠模型中亦观察到海马GABA下降、Glu升高，ERK/CREB-BDNF/TrkB信号通路抑制以及突触可塑性受损^［34］。本研究结果显示：与假手术组相比，绝经肝郁组小鼠血清Glu水平显著升高，GABA水平显著降低，提示血清神经递质水平失衡。柴胡疏肝散干预后可显著降低Glu水平，升高GABA水平，进一步说明本研究的MPS肝郁证模型的成熟。综上，本研究成功建立了兼具内分泌紊乱、行为异常和代谢改变的MPS肝郁证小鼠模型，为后续神经免疫机制研究提供了可靠的动物模型支撑。

神经炎症是指中枢神经系统中先天免疫细胞感知应激而发生的一系列免疫反应，可通过干扰突触修剪、神经元再生、神经传递等方式影响大脑功能^［35］。近年来，小胶质细胞介导的神经炎症在抑郁症发病机制中的作用备受关注，神经炎症假说已成为该领域研究热点^［36］。绝经期是神经炎症易感的重要时期^［5］。研究表明^{［37， 38］}，围绝经期抑郁模型动物脑组织中促炎因子水平显著升高、抗炎因子水平降低，且伴有海马体代谢异常及氧化应激、炎症指标增加，提示该时期存在明显的炎症反应。本研究采用ELISA法检测血清和海马组织中IL-1β、TNF-α等炎症因子水平，从外周和中枢层面评估MPS肝郁证的炎症状态。结果显示，与假手术组相比，绝经肝郁组血清和海马组织中IL-1β、TNF-α炎症因子水平显著升高，提示MPS肝郁证存在全身和中枢炎症反应；经柴胡疏肝散干预后，上述IL-1β、TNF-α炎症因子水平显著降低，表明该方具有抑制炎症反应的作用。

海马是调控情绪与认知的关键脑区，其突触可塑性是情绪调节的重要神经基础^［39］。海马突触可塑性下降，以突触的数量、结构、功能改变为病理特点，与抑郁状态密切相关^［40］。树突棘是从神经元树突中出现的独特突触后结构，树突棘形态数量与突触超微结构变化都是突触结构可塑性改变的重要体现。PSD95与SYT-1是调控突触结构与功能的核心蛋白：PSD95参与调控突触后信号整合与长时程增强^［41］；SYT-1介导突触囊泡的胞吞胞吐过程，精确调控Glu和GABA神经递质的释放^［42］，二者均为评估突触可塑性的重要标志。研究发现^{［43， 44］}，慢性应激抑郁模型中突触标志蛋白PSD95、SYN减少，树突状脊柱蛋白Drebrin丧失，提示突触结构与功能受损。与文献研究一致，本研究发现绝经肝郁组小鼠海马神经元数量减少，树突棘数量减少、长度缩短，PSD95、SYT-1蛋白的荧光表达下降，表明突触可塑性受损，神经递质紊乱。经柴胡疏肝散干预后，神经元形态改善，树突棘数量增加、形态改善，海马PSD95、SYT-1荧光表达增加，提示柴胡疏肝散可以恢复突触可塑性，改善MPS肝郁证的抑郁样行为，该结果与既往研究一致^{［17， 45］}。

突触可塑性受神经系统与免疫系统的共同调节，其中小胶质细胞扮演关键角色^［46］。作为中枢神经系统的固有免疫细胞，在生理状态下，小胶质细胞通过分泌神经营养因子，促进突触形成、突触成熟，维持正常的突触可塑性。慢性应激条件下，小胶质细胞向M1表型极化（以iNOS为标记分子），释放促炎因子、活性氧化物质，其吞噬能力增强导致突触过度修剪，从而损害突触可塑性^［47］；而向抗炎M2表型极化（以Arg1为标记分子）则有助于修复损伤突触，发挥神经保护作用，维持突触可塑性^［48］。调控小胶质细胞表型转换已成为神经系统疾病潜在的干预策略。多项研究围绕该机制探讨了中药改善抑郁的作用。例如，柴胡皂苷B2可通过TLR4/NF-κB通路抑制小胶质细胞活化和神经炎症，并调节铁死亡及钙稳态，从而改善抑郁样行为^［49］；黄芪素通过抑制小胶质细胞活化和神经炎症相关通路（如RIPK1/RIPK3/MLKL和mTOR/NF-κB），保护血脑屏障完整性并缓解LPS诱导的抑郁样行为^［50］。与文献研究一致，本研究发现绝经肝郁组小鼠海马区小胶质细胞标志物Iba1表达升高，且与iNOS、Arg1共表达增加，同时伴有海马炎症因子的上调，提示MPS肝郁证存在小胶质细胞活化。柴胡疏肝散治疗后，Iba1及Iba1/iNOS阳性表达降低，而Iba1/Arg1阳性表达升高，海马炎症因子水平下降。这表明柴胡疏肝散可能通过促进小胶质细胞由M1向M2表型转化，减轻海马神经炎症反应，从而修复突触可塑性。

经典补体通路尤其C3/C3aR信号通路在神经炎症与突触修剪中起重要作用^［51］。作为经典补体通路的核心蛋白，C3可标记突触，由小胶质细胞表面的C3aR识别并介导吞噬^［52］。STAT3是C3/C3aR信号通路的下游靶点，属于STAT蛋白家族成员，其酪氨酸磷酸化（形成p-STAT3）是激活的关键步骤。活化的pSTAT3转入细胞核内后，通过调节IL-1β、TNF-α等炎症因子的转录，进而影响小胶质细胞的活化状态及吞噬功能^［53］。研究发现^{［54， 55］}，在慢性应激诱导的抑郁老鼠模型中，海马区C3及C3aR蛋白表达显著升高，同时伴随炎症因子水平上升、小胶质细胞活化以及神经元损伤，表明C3/C3aR信号通路异常激活介导的小胶质细胞活化和神经炎症与抑郁行为密切相关。本研究结果显示，MPS肝郁证模型小鼠海马内C3、C3aR及pSTAT3蛋白表达均升高，提示MPS肝郁证模型小鼠海马内C3/C3aR信号通路异常激活；而经柴胡疏肝散干预后能降低上述指标，表明柴胡疏肝散可能通过抑制海马内C3/C3aR信号通路，从而保护突触结构与功能。

综上所述，本研究提示柴胡疏肝散可能通过调控小胶质细胞极化表型（抑制其向M1型极化、促进其向M2型极化），并抑制C3/C3aR信号通路的异常激活，进而改善神经炎症反应和突触可塑性，最终缓解MPS肝郁证小鼠的抑郁样行为。本研究存在一定局限性：未设置阳性对照组（如逍遥散），虽出于机制聚焦的考虑，但不利于疗效的横向比较。后续研究将进一步纳入阳性对照药物，以更全面地评价柴胡疏肝散的作用特点。本研究聚焦柴胡疏肝散抗抑郁作用的中枢机制，为中医药治疗MPS肝郁证提供分子生物学和形态学依据，揭示疏肝解郁法“肝主情志”的现代科学内涵。

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基金资助

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国家自然科学基金(82174248)

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