芍药苷靶向EZH2/CCNE1调控细胞周期与炎症微环境改善乳腺癌化疗期癌因性疲乏

Paeoniflorin alleviates cancer-related fatigue during chemotherapy for breast cancer by targeting EZH2/CCNE1 to regulate cell cycle and inflammatory microenvironment

摘要

目的 通过机器学习方法、整合药理学及体外实验探讨白芍干预乳腺癌化疗期癌因性疲乏（CRF）的潜在分子机制及关键药效物质基础。 方法 从TCMSP、SwissTargetPrediction等数据库筛选白芍的活性成分及靶点，并利用Genecards和OMIM获取疾病靶点。结合GEO数据集（GSE41112），运用Limma包筛选化疗与非化疗组的差异表达核心基因。创新性地引入4种机器学习算法：随机森林（RF）、支持向量机（SVM）、极端梯度提升（XGBoost）和广义线性模型（GLM），筛选最具诊断价值的关键特征基因，并构建Nomogram预测模型。利用Kaplan-Meier Plotter和HPA数据库进行生存分析与免疫组化验证。进一步构建IL-17诱导的Py230乳腺癌细胞CRF模型，通过CCK-8、qRT-PCR、Western blotting和免疫荧光技术验证白芍主要活性成分芍药苷对核心靶点的调控作用。 结果 共筛选得到芍药苷、白芍苷及山奈酚等13个活性成分及475个药物靶点，与疾病差异基因映射后获得65个核心交集基因。富集分析显示主要涉及MAPK信号级联、昼夜节律调节及细胞周期等生物过程。免疫浸润分析表明，核心基因与CD8⁺T细胞、巨噬细胞等免疫细胞丰度显著相关。在4种机器学习模型中，支持向量机模型性能最佳，筛选出PSMB8、EZH2、CCNE1、PSEN2、CDK1为关键特征基因。基于此构建的Nomogram模型C-index=0.911，校准曲线及决策曲线分析均显示其具有良好的准确性与临床净获益。分子对接证实白芍核心成分与关键靶点具有较强的结合能。生存分析显示，EZH2和CCNE1的高表达与乳腺癌患者不良预后显著相关（P<0.05）。体外实验证实，化疗药物上调癌细胞中EZH2和CCNE1的mRNA和蛋白水平表达，而芍药苷能显著逆转这一病理改变（P<0.05），其效果与阳性抑制剂相当。 结论 白芍可能通过其活性成分芍药苷，靶向抑制EZH2和CCNE1的异常表达，调节细胞周期与炎症微环境，从而发挥缓解乳腺癌CRF的减毒增效作用。

Abstract

Objective To explore the molecular mechanisms and key pharmacodynamic basis of Baishao for alleviating cancer-related fatigue (CRF) during chemotherapy for breast cancer. Methods Bioinformatics analyses were used to explore the active ingredients and potential targets of Baishao, CRF-related targets, and the differentially expressed core genes between chemotherapy and non-chemotherapy groups. Four machine learning algorithms (Random Forest, SVM, XGBoost, and GLM) were used to screen the key feature genes to construct a diagnostic nomogram model with subsequent survival and immunohistochemical analyses using Kaplan-Meier Plotter and HPA databases. In an IL-17-induced Py230 breast cancer cell model of CRF, the regulatory effects of paeoniflorin (a major active ingredient of Baishao) on the core targets were validated using CCK-8 assay, qRT-PCR, Western blotting, and immunofluorescence staining. Results Thirteen active ingredients (including paeoniflorin, albiflorin, and kaempferol) and 475 drug targets of Baishao were identified, yielding 65 core intersection genes enriched in the MAPK signaling cascade, circadian rhythm, and cell cycle regulation and showing significant correlations with immune cells. The SVM model demonstrated the best diagnostic performance and identified PSMB8, EZH2, CCNE1, PSEN2, and CDK1 as the key feature genes. The SVM-based nomogram achieved a C-index of 0.911, showing excellent calibration and clinical net benefit. Molecular docking confirmed strong binding affinities between the core ingredients of Baishao and the key targets. Survival analysis linked high EZH2 and CCNE1 expressions to poor breast cancer prognosis. In IL-17-induced Py230 cells, chemotherapy resulted in significant upregulation of EZH2 and CCNE1 expressions, which were effectively reversed by paeoniflorin treatment with an efficacy comparable to specific positive inhibitors. Conclusion Paeoniflorin alleviates chemotherapy-induced CRF in breast cancer by targeting and inhibiting abnormal expressions of EZH2 and CCNE1 to regulate cell cycle and inflammatory microenvironment, highlighting the therapeutic potential of Baishao for attenuating toxicity and enhancing efficacy of chemotherapy.

Graphical abstract

关键词

白芍 / 乳腺癌 / 化疗期癌因性疲乏 / 整合药理学 / 机器学习

Key words

Baishao / breast cancer / cancer-related fatigue during chemotherapy / integrative pharmacology / machine learning

乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率最高的癌症类型，化疗作为其术后及晚期治疗的核心手段虽可显著延长生存期，但相关毒副作用不容忽视^［1］。其中，癌症相关性疲乏（CRF）是乳腺癌化疗期间最常见且最具困扰性的并发症之一，发生率高达65%~100%^［2］。CRF不同于一般疲劳，其特点为持续性的主观疲惫感，且无法通过休息或睡眠缓解，常伴随认知功能下降和情绪障碍，严重损害患者生活质量，并可能降低化疗依从性，甚至影响疾病预后^［3］。相较于恶心呕吐及癌性疼痛等常见并发症，CRF给患者带来的身心负担往往更为沉重。这种难以耐受的疲惫感常导致患者被迫中断抗肿瘤治疗，从而严重损害了治疗依从性并缩短了生存期^［4］。尽管现代医学干预能在一定程度上缓解症状，但CRF常表现出难治性与反复性；此外，常规药物干预往往伴随眩晕、焦虑、厌食等不良反应，部分情况下甚至可能产生反常效应，进一步加剧疲乏。鉴于此，中医药凭借其减毒增效及整体调节的独特优势，在肿瘤支持治疗领域正受到日益广泛的关注与应用。探索安全、有效、能够改善化疗期机体状态的干预策略已成为当前亟待解决的临床问题。

中医药在肿瘤综合治疗中强调扶正祛邪，在改善化疗副作用、调节免疫功能及缓解疲乏方面具有独特优势^{［5， 6］}。白芍作为传统大宗药材，具有养血柔肝、缓急止痛之功效。现代药理学研究表明，白芍及其活性成分具有显著的免疫调节、抗炎、抗氧化及神经保护作用，在改善慢性疲劳及调节肿瘤微环境方面显示出潜在的应用价值^［7］。然而，目前关于白芍干预乳腺癌CRF的研究仍存在明显的局限性。既往研究多集中于单一成分对神经系统或肿瘤细胞的单向调节，缺乏从“药物-靶点-疾病”整体网络视角解析其在乳腺癌CRF这一特定复杂病理背景下的协同作用机制。传统的网络药理学研究往往仅依赖公共数据库的靶点取交集，缺乏临床转录组数据的支持，且筛选关键靶点时多依据简单的拓扑学参数，容易导致结果的假阳性率高，难以精准锁定核心生物标志物。现有报道鲜有将中药靶点预测与严格的机器学习算法及临床生存预后分析相结合，导致研究结果的临床转化证据不足。

随着生物信息学与系统生物学的快速发展，网络药理学已成为解析中药复杂作用机制的有力工具。与此同时，基于高通量测序数据的机器学习算法为筛选疾病特征生物标志物提供了高精度的预测手段^［8］。将网络药理学预测的靶点与临床样本的转录组数据相结合，并引入肿瘤免疫微环境分析，可以更系统、客观地揭示中药干预疾病的生物学本质。因此，本研究采用整合药理学结合机器学习的多维策略进行深入探索，旨在采用整合药理学策略探讨白芍治疗乳腺癌CRF的潜在机制，并为中药抗癌伴随症状的机制研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 筛选白芍有效成分及疾病靶点预测

在TCMSP数据库中输入“白芍”，以口服生物利用度≥30% 和药物似性≥0.18为筛选条件，获得白芍有效作用成分和成分对应的作用靶点，通过Uniprot数据库将作用靶点名称全部转化成gene symbol名称。然后在Pubchem数据库中搜索得到所有有效成分对应的smile号，随后将smile号输入SwissTargetPrediction进行靶点预测，筛选P>0.01的靶点，最终将得到的所有靶点合并去重，得到白芍的作用靶点。分别在GenCards和OMIM数据库中得到与乳腺癌有关的基因靶点。

1.2 核心靶点筛选及构建“药物-成分-核心靶点”网络

药物与疾病的靶点取交集获得交集靶点后导入String数据库，设置物种为智人，获取互作关系tsv文件。将文件导入Cytoscape 3.7.0，使用centiscape插件计算Degree、closeness、betweenness值以得到核心靶点。运用Cytoscape 3.7.0软件构建“药物-成分-核心靶点”网络。

1.3 GEO数据获取与预处理

从GEO数据库下载与乳腺癌患者化疗后心理状态相关的基因表达谱数据集GSE41112。该数据集包含61例样本，其中化疗组24例，非化疗组37例。使用R软件GEO query包下载原始数据，通过GPL10558平台注释文件将探针ID转换为基因Symbol。对于同一基因对应多个探针的情况，取其表达值均值作为该基因的表达水平。表达矩阵经log₂转换和分位数标准化后用于后续分析。

1.4 核心基因的表达差异、染色体定位与相关性分析

将网络药理学筛选获得的核心靶点与预处理后的GEO表达谱数据进行匹配。采用R语言的limma包对数据集样本进行差异表达分析，以P<0.05为统计学显著性阈值，筛选出显著差异表达的核心基因（SDECGs）。为评估SDECGs作为生物标志物的可靠性，将对其在所有GEO数据集中的差异表达情况进行统计，记录每个SDECG在多少个独立数据集中呈现显著差异。在可视化方面，首先利用R语言的RCircos包，将SDECGs在人类染色体上的特定位置进行映射，绘制Circos圆图，以直观展示其基因组分布特征。此外，采用Pearson相关系数计算SDECGs之间表达水平的相关性，并通过corrplot包进行矩阵可视化，以揭示核心基因间潜在的共调控关系和分子互作网络。

1.5 免疫细胞浸润分析

为深入探究白芍作用核心基因在肿瘤微环境中的潜在调控机制，本研究对GEO数据集样本进行免疫细胞浸润分析。采用CIBERSORT算法，基于标准的LM22免疫细胞标记基因集，计算各样本中22种免疫细胞亚群的浸润比例。随后，利用Wilcoxon秩和检验比较22种免疫细胞浸润水平的差异性。最后，通过Spearman相关系数计算筛选获得的SDECGs基因表达水平与浸润免疫细胞分数之间的相关性，并通过相关矩阵图进行可视化，以期揭示核心基因对肿瘤局部免疫应答的潜在影响。

1.6 机器学习建模及关键特征基因筛选

为从SDECGs中识别出最具诊断或治疗价值的关键分子，并构建高精度的疾病预测模型，本研究采用4种主流的机器学习算法对SDECGs进行建模分析：随机森林（RF）、支持向量机（SVM）、极端梯度提升（XGBoost）和广义线性模型（GLM）。将GSE41112作为训练集，按7︰3比例随机划分为训练集和测试集。使用受试者工作特征曲线（ROC）的曲线下面积（AUC）评估模型性能。采用最佳模型的特征重要性指标对SDECGs进行排序，筛选出重要性得分最高的一组基因，将其定义为白芍干预乳腺癌CRF的关键特征基因。最后，利用筛选出的关键特征基因，构建Nomogram列线图，用于实现疾病风险的个体化、定量化预测。同时，通过绘制校准曲线评估Nomogram模型的预测值与实际观察结果之间的一致性，并通过决策曲线分析评估其临床净获益，从而全面评估Nomogram图的准确性与临床实用性。

1.7 GEO模型验证和分子对接

使用训练集筛选出的关键特征基因，在这些外部验证集上重新构建相同的机器学习模型，并通过绘制ROC曲线和计算AUC值，严格验证构建的机器学习模型的泛化能力和临床适用性。从分子水平验证白芍核心活性成分对关键特征靶点的干预潜力，从RCSB蛋白数据库下载目标蛋白的三维结构，从中药系统药理学平台数据库中下载关键成分的分子结构式，进行AutoDockTools 1.5.7分子对接，Pymol 2.6软件可视化结果。

1.8 核心基因的生存分析与预后评估

通过Kaplan-Meier Plotter在线数据库进行生存分析。将筛选获得的关键特征基因分别输入系统，根据基因mRNA表达量的中位数将乳腺癌患者队列划分为高表达组与低表达组。通过绘制Kaplan-Meier生存曲线直观展示基因表达水平与患者生存时间的关系，并采用 Log-rank检验评估两组间生存曲线的差异显著性。此外，计算风险比及其95%置信区间以量化基因表达对预后的风险程度。

1.9 核心基因的免疫组化验证

通过人类蛋白质图谱数据库进行免疫组化分析。分别在数据库中输入筛选获得的核心基因名称（EZH2、CCNE1、NOS2、GPBAR1 及 P2RX7），检索并下载其在正常乳腺组织与乳腺癌组织中的典型免疫组化病理染色图像。通过对比观察组织切片中二氨基联苯胺显色的棕黄色颗粒强度、密度及分布范围，定性评估目标蛋白在肿瘤组织与正常组织间的表达丰度差异及其在细胞核或细胞质中的亚细胞定位特征。

1.10 核心基因mRNA在乳腺癌及乳腺组织中的差异表达分析

通过Gene Expression Profiling Interactive Analysis在线数据库进行差异表达分析。在分析模块中输入筛选获得的关键特征基因（EZH2、CCNE1、GPBAR1、NOS2 及 P2RX7），选择乳腺癌作为疾病数据集，并将对照组设定为包含TCGA正常样本与GTEx正常样本的混合数据集（Tumor=1085，Normal=291）。对基因表达数据进行标准化处理，通过单因素方差分析检验差异，并绘制箱线图可视化展示各基因在肿瘤组织与正常组织中的mRNA表达水平分布。

1.11 乳腺癌Py230细胞化疗期癌因性疲乏模型的构建及体外药效验证

1.11.1 细胞培养与药物细胞活性检测

乳腺癌细胞株Py230购自美国典型培养物保藏中心，使用含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中培养。取对数生长期的Py230细胞接种于96孔板。待细胞贴壁后，加入含不同浓度芍药苷（0、50、100、200、300、400、500 μmol/L）的培养基处理24 h。随后加入10 μL/孔 CCK-8溶液，继续孵育2 h。使用酶标仪测定吸光度A_{450 nm}，计算细胞存活率，以确定芍药苷对Py230细胞的安全干预剂量范围。

1.11.2 化疗期癌因性疲乏细胞模型的构建与分组给药

为了在体外模拟化疗诱导的应激微环境，采用白细胞介素17（IL-17）诱导Py230细胞建立CRF细胞模型^［9］。实验分为5组：空白对照组：加入等量完全培养基；化疗模型组（CRF组）：加入含IL-17的培养基诱导24 h，以模拟细胞应激状态；EZH2阳性对照组（CRF+GSK126组）：在模型组基础上加入EZH2特异性抑制剂GSK126；CCNE1阳性对照组（CRF+SCH727965组）：在模型组基础上加入CDK抑制剂SCH727965；芍药苷干预组（CRF+Pae组）：在模型组基础上加入芍药苷进行共处理。

1.11.3 实时荧光定量PCR检测

各组细胞处理后以TRIzol提取总RNA并逆转录为cDNA。使用SYBR Green法进行qRT-PCR扩增。以GAPDH为内参，采用2^-△△Ct法计算EZH2与CCNE1 mRNA的相对表达水平。所有引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成（表1）。

1.11.4 Western blotting检测

各组细胞处理结束后，按比例加入RIPA裂解液提取总蛋白并调平蛋白样品浓度，Western blotting检测EZH2（1︰10000）和CCNE1（1︰1000）及β-actin（1︰50 000），次日，用HRP偶联的二抗［羊抗兔 IgG（H+L）HRP和羊抗鼠 IgG（H+L）HRP，1∶5000，武汉三鹰生物技术有限公司］室温孵育1 h。使用化学发光成像系统曝光显影，ImageJ软件分析蛋白质条带灰度值。

1.11.5 免疫荧光实验

各组细胞处理结束后进行常规固定，并使用0.3%Triton透膜、山羊血清封闭。随后依次孵育EZH2（1∶1000）和CCNE1（1∶400）及荧光标记的AlexaFluor488偶联抗兔IgG二抗（1∶200，武汉三鹰生物技术有限公司），经DAPI进行细胞核染色后，使用抗荧光淬灭剂封片，于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.12 统计学分析

本研究中生物信息学分析主要基于R软件及其相关软件包完成。计量资料若符合正态分布，以均数±标准差表示；若不符合正态分布，则以中位数（四分位数间距）表示。两组间数据的比较，满足正态分布及方差齐性时采用独立样本t检验，否则采用Wilcoxon 秩和检验。多组间数据的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey's post hoc检验。变量间的相关性分析根据数据分布类型选用Pearson相关分析或 Spearman相关分析。生存分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并利用Log-rank检验评估组间差异，通过Cox回归模型计算风险比及95%置信区间。机器学习模型的性能评估采用ROC曲线下面积，Nomogram模型的准确性通过校准曲线和C-index进行验证。所有统计检验均为双尾检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白芍中的有效成分和靶点及疾病靶点

从TCMSP数据库中共得到白芍有效成分13个，在TCMSP和Swiss TargetPredction获得其靶点合并去重后，得到了583个白芍相关靶点；在Genecards（Score≥20）和OMIM获得疾病靶点合并去重后共得到7512个疾病靶点，取交集后获得交集靶点 475个（图1）。

2.2 核心靶点筛选及构建“药物-成分-核心靶点”网络

使用String数据库将475个交集靶点构建PPI网络，该网络有474个节点和10321条边。使用centiscape插件对PPI网络进行分析，以Degree≥43.548523206751、closeness≥0.000995976892419、betweenness≥547.177215189891为条件确定核心基因，最终得到92个核心靶点。最后在Cytoscape3.7.0软件中绘制“药物-成分-核心靶点”网络图（图2）。

2.3 核心靶点PPI网络

将得到的92个核心靶点在String数据库中获得蛋白互作关系，后用Cytoscape3.7.0软件对其进行可视化分析，共得到92个节点和2108条边的PPI网络图（图3）。

2.4 数据预处理与核心交集靶点的差异表达分析

对GSE41112数据集进行预处理后，获得包含21 183个基因的标准化表达谱，其中化疗组24例，非化疗组37例，预处理后的数据质量符合后续分析要求。通过差异表达分析共鉴定出2555个差异表达基因。进一步将这些差异基因与475个白芍-疾病共有靶点映射取交集，最终锁定65个核心交集基因。火山图散点分布直观反映了基因表达的显著性差异（图4A），证实该数据集在化疗组与非化疗组之间存在明确的分子特征区分。65个核心交集基因在各样本中的表达模式（图4B）。

2.5 GO和KEGG富集分析结果

GO和KEGG富集分析结果揭示了白芍干预CRF的分子机制具有多维、系统的网络调控特征（图5）。白芍通过干预机体对缺氧及外源性毒物的应激反应、正向调节造血与白细胞分化，同时靶向抑制MAPK级联与AGE-RAGE等核心代谢应激通路。其核心靶点显著富集于细胞凋亡、多种癌症微环境及EGFR耐药调节通路，表明其能协同促进肿瘤细胞死亡并克服获得性耐药。

2.6 核心基因的共表达网络与互作特征

20个核心基因的表达谱特征及其相互关联模式显示，通过Circos图（图6A）可视化了基因在不同组别的表达差异及共表达关系，外圈与内圈热图分别代表化疗组与非化疗组的基因表达水平，中心连线则揭示了基因间的相互作用。进一步通过弦图解析了核心基因间的强相关性，其中红色和蓝色弦线分别代表显著的正相关与负相关，线条透明度直观反映了相关系数的强度（图6B）。饼图样式的热图定量展示了基因间的Pearson相关系数矩阵，图中紫色与绿色分别对应正负相关，而饼图的填充比例则精确反映了相关系数绝对值的大小（图6C）。

2.7 免疫浸润分析结果

基于标记基因的方法对GSE41112数据集进行免疫浸润分析显示，各样本中8种主要免疫细胞类型的浸润比例分布（图7A）。堆叠柱状图展示了GSE41112数据集各样本中8种免疫细胞（T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细胞、调节性T细胞、肥大细胞）的相对比例。箱线图显示化疗组和非化疗组各类免疫细胞的浸润评分（图7B）。热图揭示了30个核心基因与8种免疫细胞丰度之间的特异性正负相关调控模式（图7C）。BLK、PRKCA、BCL2及PIK3R1的表达与T细胞和B细胞的浸润水平呈现出显著正相关，提示这些基因在促进适应性免疫应答及淋巴细胞趋化中发挥关键作用；同时，TGFBR2的表达与调节性T细胞和肥大细胞呈强烈的正相关，这可能直接参与了化疗后局部免疫抑制微环境的构建；此外，MAP2K4与中性粒细胞丰度表现出高度的正向协同。MAP2K2与包括巨噬细胞、树突状细胞及Tregs在内的多种免疫细胞均呈广泛的负相关；而NOS2的表达与T细胞、B细胞及NK细胞的浸润呈明显负相关；EZH2和CCNE1则与中性粒细胞等呈现一定的负相关趋势。

2.8 机器学习模型的性能比较及列线图预测模型的构建与验证

基于65个核心基因，采用4种机器学习算法（RF、SVM、XGBoost、GLM）构建诊断模型（图8A），红色为随机森林（AUC=0.883），绿色为支持向量机（AUC=0.896），蓝色为XGBoost（AUC=0.701），紫色为广义线性模型（AUC=0.630）。基于支持向量机模型筛选出的Top5特征基因（PSMB8、EZH2、CCNE1、PSEN2、CDK1）构建Nomogram列线图（图8B），逻辑回归模型C-index=0.911，表明模型具有优异的区分能力。校准曲线评估显示，Nomogram预测概率与实际观察概率之间具有良好的一致性，校准曲线接近45°对角线，平均绝对误差为0.059（图8C）。决策曲线分析评估了模型的临床净收益，模型曲线高于参考线表（图8D）。

2.9 分子对接结果

分别将关键靶点PSMB8、EZH2、CCNE1、PSEN2、CDK1、DRD1、NOS2、GPBAR1、P2RX7、CASP7在PDB数据库中搜索得到大分子蛋白三维结构8QYM、4MI5、7KJS、7Y5X、6GU2、7JVP、6JWM、7XTQ、9E3M、4JR2，然后将上述靶点蛋白作为受体与潜在活性成分作为配体进行分子对接。结合能热图显示二者之间具有良好的结合活性，结合能均<-6 kcal/mol（图9A）。选取其中结合活性最优的10组进行分子对接可视化演示（图9B）。

2.10 核心基因与乳腺癌患者生存率的相关性分析

通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析关键特征基因（EZH2， CCNE1， P2RX7， GPBAR1， NOS2A）的表达水平与乳腺癌患者生存率之间的关系（图10）。在本研究筛选出的关键基因中，EZH2和CCNE1的高表达与乳腺癌患者的不良预后显著相关（P<0.05）；与低表达组相比，EZH2高表达组患者的生存率降低（P<0.05）；同样，CCNE1的高表达也提示预后不良。相反，P2RX7和NOS2A的高表达与较好的生存结局相关，表现为保护因素。P2RX7高表达组的风险比降低（P<0.05），NOS2A高表达组亦显示出类似的生存获益趋势。此外，GPBAR1的表达水平与患者生存率的组间差异无统计学意义。

2.11 核心蛋白在乳腺癌及乳腺组织中的差异表达

通过检索HPA数据库，获取EZH2、CCNE1、NOS2、GPBAR1及P2RX7在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的免疫组化病理染色图像，结果显示（图11），核心靶点在肿瘤组织与正常组织中表现出显著的表达差异，在乳腺癌组织切片中，EZH2和CCNE1呈现出广泛且深沉的棕黄色染色，提示这两种蛋白在肿瘤细胞核及细胞质中呈强阳性表达；而在正常乳腺组织中，染色主要呈蓝色，棕黄色阳性信号极弱或缺失。这一结果与前述生存分析中EZH2/CCNE1高表达提示预后不良的结论相呼应，证实它们是乳腺癌的关键促癌因子。GPBAR1在乳腺癌组织中同样观察到明显的棕褐色颗粒沉淀，显示出较高的蛋白表达丰度，明显高于正常乳腺组织的表达水平。P2RX7在乳腺癌组织中显示出中等强度的阳性染色，而NOS2在两组中的染色差异相对较小。对免疫组化染色的阳性区域面积进行定量统计发现，与正常乳腺组织相比，乳腺癌组织中EZH2（P<0.01）、CCNE1（P<0.001）、GPBAR1（P<0.001）以及P2RX7（P<0.001）的阳性表达面积比例均增高，而NOS2在两组间的阳性面积差异未见统计学意义，这与形态学观察结果高度一致。

2.12 核心基因在乳腺癌与乳腺组织中的mRNA差异表达验证

通过GEPIA数据库整合TCGA中1085例乳腺癌组织与GTEx中291例正常乳腺组织的转录组数据，分析关键基因的mRNA表达水平差异。EZH2和CCNE1在乳腺癌组织中的mRNA表达水平高于正常乳腺组织（P<0.05，图12）。肿瘤组的中位表达量明显高于正常组，这一转录水平的升高与前述免疫组化显示的蛋白高表达及生存分析中的不良预后风险高度一致。与正常组织相比，GPBAR1在乳腺癌组织中的mRNA表达水平下调（P<0.05）。NOS2和P2RX7在肿瘤组与正常组之间的mRNA表达水平未见统计学差异，箱体分布较为接近。

2.13 芍药苷对乳腺癌细胞核心基因EZH2和CCNE1转录水平的调控作用

芍药苷对乳腺癌细胞的增殖抑制具有明显的剂量依赖性，且在200 μmol/L以内表现出良好的细胞安全性（图13A）。化疗应激可显著诱导细胞内表观遗传因子EZH2及周期蛋白CCNE1的mRNA水平异常升高，化疗可能通过重塑表观遗传景观触发细胞周期紊乱。芍药苷干预可显著下调上述核心基因的转录活性，其效应与特异性抑制剂（GSK126及SCH727965）趋同，能将EZH2与CCNE1的表达水平回调至接近正常状态（图13B、C）。

2.14 芍药苷对乳腺癌细胞核心基因EZH2和CCNE1蛋白表达的影响

Western blotting结果显示，与对照组相比，模型组中EZH2和CCNE1蛋白表达升高，模型组经芍药苷干预后，这些异常表达的蛋白水平均得到明显改善，差异有统计学意义（P<0.05，图14）。

2.15 芍药苷对乳腺癌细胞核心基因EZH2和CCNE1蛋白定位及表达影响

免疫荧光结果显示（图15），与对照组比较，模型组EZH2、CCNE1表达量明显升高；与模型组比较，模型组+GSK126与模型组+SCH727965的EZH2、CCNE1表达降低，同时模型组+芍药苷组EZH2、CCNE1表达量降低。

3 讨论

《素问·五常政大论》中“大毒治病，十去其六……无使过之，伤其正也”，指出强效药物易致正气受损。《素问·阴阳应象大论》中“壮火之气衰，少火之气壮；壮火食气，气食少火……壮火散气，少火生气”。化疗药物作为“壮火”之邪，入里则“壮火食气”，不仅耗散元气，更灼烁真阴，致使肝血亏虚、疏泄失司，最终形成虚劳与郁证并见的病理状态。肝为刚脏，体阴而用阳，主藏血而司疏泄。若热毒灼烁真阴，致肝血亏虚，则肝体失养；体失所养则疏泄失职，气机不畅。气血两虚，无以化生神气，故见肢体倦怠、神疲乏力；肝失条达，气机郁滞，故见情志不舒、抑郁寡欢。此病机演变与乳腺癌CRF临床所见之虚劳兼夹郁证的病理表征高度契合。白芍味酸苦、性微寒，入肝、脾经，长于养血敛阴、柔肝缓急。《神农本草经》所载，白芍可“补劳气”，这与本研究挖掘出的活性成分改善机体疲劳及免疫调节的现代药理机制互为印证，为“酸甘化阴”以治虚劳提供了坚实的物质基础。

芍药苷、白芍苷、山奈酚和β-谷甾醇是白芍发挥作用的核心物质基础。芍药苷作为白芍的主要单萜苷类成分，已被多项研究证实具有显著的神经保护和抗抑郁作用^［10-12］。CRF的发生常伴随下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的功能紊乱，芍药苷可通过调节HPA轴的反馈机制，降低糖皮质激素水平，从而缓解应激诱导的疲劳行为^{［13，14］}。此外，芍药苷还能抑制神经炎症，特别是通过抑制小胶质细胞的激活来减少脑内促炎因子的释放^［15］，这对改善“化疗脑”相关的认知性疲乏具有重要意义。山奈酚作为一种天然黄酮类化合物，表现出强大的抗氧化应激能力。化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，会诱导线粒体功能障碍，产生大量ROS^［16］。线粒体是细胞的能量工厂，其损伤直接导致ATP生成减少^［17］，是躯体性疲乏的直接原因。山奈酚可能通过清除ROS、保护线粒体膜电位，维持机体正常的能量代谢。

基于网络药理学与生物信息学的深度交互分析，本研究证实MAPK信号级联是白芍干预乳腺癌化疗期CRF的核心生物学通路^［18］。化疗药物作为强效应激源，通过诱导胞内活性氧积聚激活p38 MAPK及JNK通路，导致IL-6、TNF-α等促炎因子的爆发性分泌^{［19，20］}，这与本研究筛选出的TNF、MAPK1等枢纽基因富集结果高度一致。外周炎症因子可通过破坏血脑屏障或经迷走神经传入途径激活中枢小胶质细胞，引发神经炎症并干扰多巴胺能及血清素能神经传递，最终诱导以快感缺失和极度疲乏为特征的病态行为^{［21，22］}。白芍活性成分可能作为MAPK通路的天然抑制剂，通过阻断其异常磷酸化切断“化疗应激-MAPK激活-中枢神经炎症”的恶性循环，从而发挥解毒祛瘀的抗疲乏效应。

本研究通过多算法集成的机器学习策略筛选出的关键基因不仅作为区分CRF高风险人群的数学特征，更深刻揭示了CRF发生的生物学底层逻辑，涵盖了细胞周期紊乱、免疫炎症风暴、表观遗传重塑及神经退行性变等多个关键维度。CDK1作为真核细胞G2/M期转换的限速激酶，是化疗药物诱导肿瘤细胞发生有丝分裂障碍的直接靶点^［23］。然而，传统化疗药物因缺乏精准的靶向选择性，在杀伤肿瘤的同时亦误伤了机体的高增殖潜能正常组织，导致非选择性的细胞周期停滞^［24］。这种正常组织的更新受阻不仅直接引发贫血和免疫功能低下，更会导致全身性的再生障碍性疲乏。本研究观察到的CCNE1高表达反映了机体在遭受化疗细胞毒性损伤后启动的一种代偿性增殖反应。然而，这种高负荷的合成代谢过程往往伴随着巨大的能量消耗，导致线粒体功能障碍及ATP耗竭，从而加剧代谢性疲乏^［25］。PSMB8是连接系统性炎症与蛋白质分解代谢的关键枢纽^［26］，在化疗诱导的全身性炎症背景下，TNF-α与IFN-γ强力诱导骨骼肌中PSMB8的异常上调，激活泛素-蛋白酶体途径，加速肌纤维蛋白降解，导致继发性肌肉减少症及持续性躯体无力。本研究中4种模型的性能差异主要取决于算法机制与转录组数据特征的适配度。SVM在此类数据中表现最优，SVM能通过核函数高效处理高维非线性映射，并利用支持向量有效抵抗过拟合^［27］；作为基于Bagging策略的集成学习算法，RF能有效克服基因共线性并捕获复杂的非线性交互网络^［28］。相反，XGBoost在小样本限制下极易因过度拟合噪声而导致泛化能力下降^［29］；GLM则受限于严格的线性假设，难以解析复杂的生物学非线性调控网络，且极易受高维共线性干扰，因此分类效能最差^［30］。因此，本研究最终优选SVM模型用于关键特征基因的筛选与Nomogram列线图的构建。Nomogram模型中PSMB8的高权重提示其为“炎症-肌肉疲乏”轴的核心桥梁，白芍可能通过抑制NF-κB等上游炎症通路下调PSMB8，阻断肌蛋白耗损。EZH2作为PRC2复合物的核心催化亚基，通过H3K27me3介导基因转录沉默^［31］。EZH2的失活导致乳腺早熟发育和STAT5依赖基因的激活^［32］；忍冬苷通过自噬介导的NLRP3炎性小体失活靶向EZH2减轻溃疡性结肠炎^［33］；白芍对EZH2的干预潜力提示其可能通过逆转这种表观遗传修饰，恢复神经可塑性。作为γ-分泌酶组分及内质网钙泄漏通道调节因子，PSEN2的异常会导致神经元内钙超载、线粒体功能障碍及Aβ沉积，进而引发突触丢失与认知功能下降^［34］。白芍可能通过调节PSEN2介导的钙信号稳态，发挥神经保护作用，预防化疗相关的记忆力减退。为探究具体的结合机制，我们选取了结合能最优的前10组复合物进行可视化分析，发现白芍的活性小分子能够精准地嵌入靶蛋白的活性口袋或变构位点，呈现出高度的几何互补性，即经典的“锁-钥模型”^［35］。芍药苷庞大的笼状骨架能够深入CDK1的ATP结合裂隙。芍药苷上的多个羟基侧链作为氢键供体或受体，与CDK1催化核心的关键氨基酸残基形成密集的氢键网络。这种结合可能产生空间位阻效应，直接阻碍ATP的进入或磷酸基团的转移，从而抑制CDK1的激酶活性，阻断癌细胞的周期进程^［36］。山奈酚诱导EZH2的构象改变，抑制其组蛋白甲基转移酶活性，进而逆转CRF相关的表观遗传异常^［37］。

尽管本研究基于整合药理学、生物信息学及机器学习策略系统揭示了白芍干预乳腺癌CRF的分子网络与潜在机制，并构建了风险预测模型，但受限于当前数据与方法，仍存在一定局限性。转录组分析仅依赖单一GEO数据集，样本量限制及潜在的批次效应可能削弱结果的普适性，未来需引入多组学、大样本队列以验证Nomogram模型的泛化能力与临床效能。其次，当前结论主要基于生物信息学预测，尚缺乏实体实验确证，后续工作需通过体内药效评价、分子生物学验证及基因编辑技术，确证核心靶点的功能并构建生物学因果链条。未来需结合UPLC-MS/MS技术阐明活性成分的生物利用度及血脑屏障穿透性，明确药效物质基础。

综上所述，本研究创新性地构建了整合药理学、机器学习及实验验证的多维研究体系，有效克服了传统网络药理学靶点筛选假阳性率高的弊端，系统揭示了白芍干预乳腺癌CRF的生物学本质。研究首次确证白芍核心成分芍药苷能够精准靶向抑制化疗应激诱导的EZH2和CCNE1异常高表达，通过阻断MAPK级联反应、调节细胞周期进程并重塑炎症免疫微环境，发挥显著的减毒增效双重作用。这一发现不仅深刻阐释了中医“养血柔肝”治疗虚劳的现代分子内涵，更为解决化疗耐药与疲乏共病提供了确切的分子靶标；同时，基于关键特征基因构建的Nomogram模型为乳腺癌CRF的早期识别提供了可量化的临床工具。尽管对免疫微环境的精准调控机制尚需单细胞测序等高分辨率技术进一步解析，但本研究为白芍的临床精准应用奠定了坚实基础，未来将通过对特定免疫亚群的深入探索，持续推动中医药在肿瘤支持治疗中的高质量转化与应用。

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