miR-124通过促进海马神经干细胞增殖分化改善MK-801介导的小鼠焦虑样行为

MiR-124 ameliorates MK-801-induced anxiety-like behaviors in mice by promoting hippocampal neural stem cell proliferation and differentiation

摘要

目 的 探究 miR-124对MK-801介导小鼠焦虑样行为的调控作用。 方法 将60只6周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为CON组、MK-801+Saline组、MK-801+Vehicle组和MK-801+miR-124组，每组15只。通过腹腔注射MK-801诱导焦虑样模型，脑立体定位注射mmu-miR-124-3p mimics以过表达miR-124，RT-qPCR实验检测miR-124是否成功转染，行为学实验检测miR-124对小鼠焦虑样行为的影响，Western blotting实验检测miR-124对小鼠海马神经元蛋白表达的影响，免疫荧光染色实验检测miR-124对神经干细胞数量、新增殖神经元数量及神经元分化的影响。 结果 miR-124上调后海马miR-124水平显著升高（P<0.05），小鼠旷场实验中总活动距离（P<0.05）与中央区活动距离（P<0.001）、高架十字迷宫实验中开放臂活动时间百分比（P<0.05）均显著升高，小鼠海马Tuj1蛋白表达量显著增加（P<0.001），小鼠海马神经干细胞数量和新生神经元数量均显著增多（P<0.001），新生神经元与成熟神经元荧光面积比值亦显著增加（P<0.001）。 结论 miR-124可通过促进海马神经干细胞增殖分化、增加神经元数量，改善MK-801介导的小鼠焦虑样行为，为焦虑症治疗提供潜在靶点。

Abstract

Objective To investigate the regulatory effect of miR-124 on MK-801-induced anxiety-like behavior in mice. Methods Sixty 6-week-old male C57BL/6J mice were randomly divided into control group, MK-801+Saline group, MK-801+Vehicle group, and MK-801+miR-124 group (n=15). Anxiety-like models were established in the latter 3 groups by intraperitoneal injection of MK-801, and stereotaxic brain injection of mmu-miR-124-3p mimics was performed for local miR-124 overexpression in the hippocampus, and successful miR-124 transfection was verified using RT-qPCR. Behavioral tests were conducted to assess the effect of miR-124 overexpression on anxiety-like behaviors of the mice. Western blotting and immunofluorescence staining were used to examine the effects of miR-124 overexpression on hippocampal neuronal protein expressions, neural stem cell number, number of new neurons, and neuronal differentiation. Results The mice in MK-801+miR-124 group showed significantly increased hippocampal miR-124 levels after the injection. The mice receiving miR-124 microinjection exhibited significant increases in both the total and central zone distance traveled in open field test and in percentages of time spent in the open arms in elevated plus maze test. Hippocampal Tuj1 protein expression and the numbers of hippocampal neural stem cells and newborn neurons, along with the fluorescence area ratio of newborn to mature neurons, increased significantly in the mice in MK-801+miR-124 group. Conclusion miR-124 overexpression ameliorates MK-801-induced anxiety-like behaviors in mice by promoting hippocampal neural stem cell proliferation and differentiation and increasing hippocampal neuron number, suggesting the value of miR-124 as a potential therapeutic target for anxiety disorders.

Graphical abstract

关键词

miR-124 / 焦虑 / 神经干细胞 / 神经元

Key words

miR-124 / anxiety / neural stem cells / neurons

焦虑症是一种常见的精神障碍性疾病，其核心特征是对可能被他人审视的社交情境产生强烈恐惧^［1］，常伴随回避行为、警觉性增高等症状。研究表明，焦虑样行为的产生多伴随神经元功能异常^［2］，而针对神经元的调节已被证实可在一定程度上控制焦虑样行为的发生^［3］，提示干预特定神经元群体可能是调控该行为的有效策略。地佐环平（MK-801）是一种非竞争性的N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，不仅能够诱导实验动物出现认知障碍，还能诱发明显的焦虑样行为^［4］；其损伤神经干细胞的机制主要是抑制细胞增殖并促进其凋亡^［5］；同时还会抑制神经干细胞向神经元的分化、破坏其正常发育进程，并阻碍神经干细胞的定向迁移能力^［6］。因此，使用有效干预手段以缓解MK-801诱导的焦虑症状具有重要研究意义。

海马神经发生是指神经干细胞增殖、分化、迁移与成熟的过程，与神经元发育持续动态进行^［7，8］，当静息态神经干细胞受外界信号激活后，经不对称分裂产生干细胞特性子代细胞与神经元前体细胞^［9］，神经元前体细胞成熟前仍可多次分裂扩增^［10］。随后逐步分化，最终形成功能完整的神经元。miR-124隶属于微小RNA（miRNA）家族，在中枢神经系统中高表达，是神经发育及其功能调控的关键因子^［11］，其过表达后能够显著促进神经细胞存活，并抑制神经元凋亡^［12］。有研究报道，miR-124可预防神经发生出现异常，促进海马神经发生以及改善认知功能从而治疗唐氏综合征的认知缺陷^［13］。另有研究表明，miR-124可在睡眠剥夺中通过激活PI3K/AKT通路进而促进神经干细胞增殖并诱导其分化为神经元^{［14， 15］}。然而，关于miR-124促进海马神经发生后如何进一步调控神经元分化，并与焦虑症的治疗相结合，目前尚无研究报道。基于miR-124在神经发生过程中的关键调控功能，结合MK-801通过损伤神经元、干扰神经发生进而诱发焦虑样行为的明确机制，本研究拟从神经元功能调控视角切入，系统探究miR-124对MK-801介导的焦虑样行为的调控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组造模

本实验选用SPF级6周龄C57BL/6J雄性小鼠60只，体质量18～22 g，购于宁夏医科大学实验动物中心，实验动物许可证号SCXK（宁）2020-0001。所有动物在相同环境下饲养，室温22± 2 ℃，湿度55%左右，光暗循环12 h，自由饮食进水。将60只6周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分成CON组、MK-801+Saline组、MK-801+Vehicle组和MK-801+miR-124组，15只/组。通过腹腔注射MK-801构建焦虑模型，同时脑立体定位注射Saline、miR-124（Mus musculus microRNA-124-3p mimics，小鼠mmu-miR-124-3p mimics）和Vehicle（Adeno-associated Virus Serotype 9-Glycoprotein-2-Negative Control，AAV9-GP-2-NC），立体定位坐标以前囟为坐标原点，X轴 ± 1.6 mm，Y轴 - 2.0 mm，Z轴 - 2.1 mm^［16］，每侧1 μL，注射速度为0.2 μL/min。取材前连续3 d腹腔注射EdU，浓度为50 mg/kg。本研究已通过宁夏医科大学伦理委员会审查批准（伦理批号：宁医大伦理第2025-N336号）。

1.1.2 试剂与仪器

SMART3.0图像分析系统（Panlab），SMART3.0摄像系统、高架十字迷宫箱小动物麻醉机、立体定位仪（深圳瑞沃德生命科技股份有限公司）；PCR仪（上海伯乐生命医学有限公司）；纯水制造机（成都超纯科技有限公司）；凝胶成像分析仪（赛默飞），石蜡包埋机、石蜡切片机（Leica）；荧光显微镜（奥林巴斯）；RNA引物（宁夏塞维尔科技有限公司）；全蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物）；PAGE凝胶快速制备试剂盒（上海雅酶）；GFAP山羊抗兔多克隆抗体、SOX2兔抗鼠多克隆抗体、Tuj1山羊抗兔多克隆抗体、DCX山羊抗兔多克隆抗体、NeuN兔抗鼠多克隆抗体、Ki67兔抗鼠多克隆抗体（HUABIO）；EdU增殖试剂盒（上海慧蓝生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠行为学实验

旷场实验中，旷场箱由长40 cm，宽40 cm，高40 cm的封闭箱体组成，底部均匀分为9个格子，中间1格为中央区。箱体顶部中央为视频采集系统，并且与记录系统相连。实验时先使小鼠依次在旷场内自由探索5 min，之后将小鼠依次放入装置中央，记录5 min 内小鼠的自由活动情况，观察其总运动距离和中央区运动距离，以此反映小鼠的焦虑样程度。在高架十字迷宫实验中，实验箱体主要由两条开放臂（28 cm×5.8 cm） 和两条闭合臂（28 cm×5.8 cm）组成，互相垂直呈十字交叉，它们交汇的地方为中央区（5.8 cm×5.8 cm），装置置于离地面50 cm处。实验开始后，将小鼠面朝开放臂方向放入中央区，记录5 min内小鼠的运动轨迹及各臂运动时间，计算其开放臂活动时间百分比。实验期间，保持安静，避免小鼠看到实验人员的活动。每只动物实验后用75%酒精彻底擦拭实验装置，以防止残留气味干扰之后的实验动物。

1.2.2 实时定量逆转录聚合酶链反应PCR（RT-qPCR）

从小鼠海马中提取总RNA，测定RNA浓度和纯度；RNA反转录为cDNA，反应程序如下：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃。使用RT-qPCR技术检测海马miR-124基因表达，U6为内参基因，委托武汉塞维尔公司合成引物，引物序列信息如下：miR-124-3p-S： ACACTCCAG CTGGGTAAGGCACGCGGTG；miR-124-3p-RT：CT CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGCATTCA；U6-S：CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-A： AACGCTTCACGAATTTGCGT。扩增程序如下：95 ℃预变性3 min，40个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃进行保存（PCR仪：ABI Gene Amp® 9700型）。PCR反应体系为：5×TransStart Fast Pfu 缓冲液4 μL，2.5mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，Trans Start Fast Pfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，加双蒸水补足至20 μL。每样本3个重复。

1.2.3 Western blotting实验

将海马组织从-80 ℃冰箱取出，按照试剂盒说明书加入蛋白质裂解液（含蛋白酶抑制剂），匀浆90 s（冰冻振荡器和离心机提前预冷至4 ℃），冰上静置15 min，12 000 r/min离心 20 min，吸取样品上清液置于冰上备用。采用BCA法测量蛋白浓度，按照试剂盒说明书配制标准曲线，加BCA工作液，37 ℃孵育30 min，测量各标准品和样品的吸光度A，计算各样品的蛋白浓度并配平各样品蛋白浓度，按比例加入缓冲液后沸水浴10 min 使蛋白质变性，冷却至室温后放入-20 ℃冰箱保存备用。变性后的样品在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，浓缩胶电压为80 V，待蛋白跑到分离胶后调整电压为120 V。根据胶的整体大小裁PVDF膜，转膜所用电压为400 mA，时间为25 min。转膜步骤结束后用TBST洗3遍，每遍10 min，无蛋白快速封闭液封闭2 h，弃去封闭液后，加入抗鼠抗体Tuj1单克隆抗体（1∶1000），室温倾斜摇床孵育1 h后4 ℃过夜。第2天复温一抗1 h，吸去一抗，TBST洗3遍，每遍10 min，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG（1∶5000），室温孵育1 h，TBST洗3遍，每遍10 min，ECL显色。利用ImageJ分析蛋白表达情况。

1.2.4 免疫荧光染色

使用酪酰胺信号放大技术（TSA）技术进行免疫荧光染色。行为学结束后用异氟烷麻醉并处死小鼠后，进行脑组织脱水和石蜡包埋处理，切片5 μm。组织切片脱蜡，柠檬酸盐修复液高温修复18 min，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，每次5 min，滴加过氧化物酶封闭液室温封闭15 min，再用普通封闭液（PBS配制的0.3%Triton，1%BSA，1%山羊血清的混合液）室温封闭1 h，封闭结束后滴加抗体（DCX 1∶1500，SOX2 1∶1500），4 ℃过夜；第2 天复温30 min，清洗后滴加相应种属的抗体，室温孵育1 h；清洗后滴加TSA染料染色15 min，染色结束后再次柠檬酸盐修复液高温修复18 min，清洗后滴加过氧化物酶封闭液室温封闭15 min，再用普通封闭液室温封闭1 h，封闭结束后滴加抗体（Ki67 1∶1500，NeuN 1∶1500，GFAP 1∶1500）4 ℃过夜；第2天复温30 min，清洗后滴加相应种属的抗体，室温孵育1 h；滴加EdU反应液，室温孵育40 min，最后用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，扫描结束后用ImageJ对荧光数据进行分析。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 10.3.1统计软件进行分析，两组间相比较采用t检验，多组间相比较采用单因素方差分析方法，符合正态分布且方差齐性的计量资料用均数±标准差表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-124转染成功

RT-qPCR实验结果显示：MK-801+Saline组miR-124水平降低（P<0.05）；过表达miR-124后，miR-124水平显著升高（P<0.05，图1）。

2.2 miR-124改善小鼠焦虑样行为

旷场实验结果显示（图2A），MK-801+Saline组小鼠在旷场活动总距离（P<0.001）与旷场中心活动距离（P<0.001）下降；过表达miR-124后小鼠旷场活动总距离（P<0.05）与旷场中心活动距离（P<0.001）增加（图2C、D）。高架十字迷宫实验中（图2B），MK-801+Saline组小鼠开放臂活动时间百分比减少（P<0.05）；过表达miR-124后开放臂活动时间百分比增多（P<0.05，图2E）。

2.3 miR-124增加Tuj1蛋白表达

Western blotting检测结果显示：MK-801+Saline组海马组织Tuj1蛋白表达量降低（P<0.001）；过表达miR-124后海马组织Tuj1蛋白表达量显著增加（P<0.001，图3B）。

2.4 过表达miR-124增加小鼠海马区神经干细胞数量

免疫荧光染色结果显示：MK-801+Saline组海马区新生神经干细胞减少（P<0.05）；过表达miR-124后海马区新生神经干细胞显著增多（P<0.0001，图4B）。

Fig.4 miR-124 reverses the inhibitory effect of MK-801 on neural stem cell proliferation (Scale bar=100 μm). A: EdU, SOX2, and GFAP fluorescence staining. B: Statistics of EdU, SOX2, and GFAP co-labeled cells. *P<0.05 vs CON group; ^####P<0.0001 vs MK-801+Saline group; Zoom in the image to 5 times its original size (n=9).

2.5 过表达miR-124增加小鼠海马区新生神经元数量

免疫荧光染色结果显示：MK-801+Saline组海马区新生神经元数量减少（P<0.0001）；过表达miR-124后海马区新生神经元数量显著增多（P<0.001，图5B）。

Fig.5 miR-124 reverses the inhibitory effect of MK-801 on newly generated neurons (Scale bar=100 μm). A: DCX and Ki67 fluorescence staining. B: DCX and Ki67 co-labeled cell numbers in the 4 groups. ****P<0.001 vs CON group; ^###P<0.001 vs MK-801+Saline group; Zoom in the image to 5 times its original size (n=9).

2.6 过表达miR-124增加小鼠海马区新生神经元与成熟神经元比值

免疫荧光染色结果显示：MK-801+Saline组海马区的DCX⁺/NeuN⁺荧光面积比例降低（P<0.0001）；过表达miR-124后海马区的DCX⁺/NeuN⁺细胞比例显著增加（P<0.0001，图6B）。

3 讨论

焦虑不仅对心理健康构成威胁，引发情绪障碍加重及认知功能下降，还会损害生理健康，导致躯体不适与免疫功能降低，严重时甚至可能诱发高血压等疾病^［17］。焦虑的神经环路涉及海马、前额叶皮层、杏仁核等多个脑区的复杂交互^［18］，其中海马被广泛认为是连接慢性应激与焦虑病理的关键枢纽^［19］，其改变可能先于或并行于其他脑区的功能重塑。作为神经发生的关键脑区，海马齿状回颗粒下层中神经干细胞通过多阶段分化形成神经元祖细胞与神经胶质祖细胞，并持续分化为多种类型神经细胞。miR-124作为中枢神经系统中最丰富的microRNA之一，在上述脑区均有表达^［20-22］，并且可通过调控Wnt/β-catenin和Notch等信号通路促进神经干细胞的增殖及其向神经元的分化^{［23， 24］}，进而影响神经环路的形成与功能，参与焦虑样行为的调节^［25］。此外，miR-124亦与神经发育及神经精神疾病的发病机制相关^［12］，并在疾病相关的焦虑情绪调节中发挥作用。由于miR-124能够促进神经干细胞增殖及神经元分化，进而修复受损神经元，因此在神经回路功能受外界因素干扰引发焦虑样行为时，miR-124可能通过恢复受损神经元功能，使神经环路趋于正常，从而调节焦虑样行为。神经元损伤导致焦虑样行为的主要机制在于其破坏了情绪调控关键神经环路的功能，引起情绪调节失衡^［26］。具体而言，神经元损伤可影响情绪相关神经递质（如γ-氨基丁酸、5-羟色胺等）的合成、释放及传递，从而加剧焦虑^［27］；同时，其对关键脑区（如海马和杏仁核）功能的干扰也会直接破坏情绪稳态^{［28， 29］}。

本研究结果显示，MK-801诱导的焦虑样行为表现为小鼠活动能力及探索意愿下降；而上调miR-124可显著增加小鼠在旷场实验中的总活动距离和中心区域活动距离，以及在高架十字迷宫实验中的开放臂停留时间百分比，表明miR-124能够改善MK-801诱导的焦虑样行为。焦虑样行为的出现与神经细胞损伤密切相关，而miR-124在中枢神经系统中的主要功能是促进神经干细胞增殖与分化。本研究中其在MK-801模型中对焦虑样行为的改善作用亦与该机制密切相关^［30］。因此，上调miR-124可能有助于缓解焦虑状态。

为验证该推论，本研究进一步检测了神经干细胞及神经元相关指标。结果显示，MK-801可降低神经元标志蛋白Tuj1的表达，而miR-124上调后其表达显著回升，提示miR-124可能通过激活并促进神经干细胞分化以增加神经元表达。为进一步探究miR-124对神经干细胞的影响，本研究从新生神经干细胞、新生神经元及神经元分化成熟程度三个层面展开免疫荧光染色分析。其中，SOX2与GFAP共标记用于检测静息态神经干细胞，联合EdU可评估海马神经干细胞储备情况^［31］。实验发现，miR-124过表达后小鼠海马区神经干细胞数量显著增多，提示miR-124具有促进神经干细胞增殖的作用。值得注意的是，miR-124上调后神经干细胞数量甚至高于对照组，推测可能原因包括：一方面，miR-124本身具有较强的促增殖效应；另一方面，MK-801可能引起星形胶质细胞反应性增多，进而暂时性升高脑源性神经营养因子（BDNF）水平^［32］，与miR-124产生协同作用，共同促进神经干细胞数量增加。新生神经干细胞具有持久的抗焦虑效应^［33］，其核心机制在于其可分化为新神经元，修复受损神经回路或促进有益神经递质生成，从而缓解焦虑^［34］。本研究结果也显示，miR-124过表达后新增殖前体神经元细胞（DCX与Ki67双阳性）数量增多，表明miR-124能够促进神经元前体细胞的增殖。同时本研究还发现，miR-124上调后未成熟神经元（DCX阳性）与成熟神经元（NeuN阳性）的比值升高，提示miR-124可促进海马区未成熟神经元生成，修复MK-801引起的神经元损伤^［35］，进而改善焦虑样行为。该比值升高可能源于miR-124促进神经干细胞增殖与分化的过程中，增殖速率高于分化速率，且神经元前体细胞在完全成熟前仍可经历数次分裂，导致前体细胞数量相对增多^［10］。

此外，神经干细胞及其分化产物可分泌多种神经营养因子与抗炎因子，如BDNF、GDNF、TGF-β及IL-10等^［36］，通过旁分泌效应改善局部脑微环境^［37］，保护现有神经元，可能间接促进情绪稳定与焦虑缓解。同时，PI3K/Akt通路的激活可抑制神经元凋亡^［38］并增强神经干细胞活性^［39］。miR-124可靶向抑制该通路的负调控因子PTEN，减弱PTEN对PI3K的拮抗作用，增强PI3K磷酸化及Akt激活，从而激活PI3K/Akt通路。据此推测，miR-124可能通过调控该通路发挥神经保护作用，进而改善焦虑状态。

综上所述，miR-124在调控海马神经干细胞增殖与分化、促进神经元生成方面具有重要作用，提高miR-124水平有助于增强神经网络的完整性与功能，改善焦虑样行为。考虑到miR-124在前额叶皮层、杏仁核等其他脑区同样有所表达，下一步我们将系统评估miR-124在其他焦虑相关脑区中的作用，并探索其与已发现的海马机制之间的交互。阐明miR-124在海马神经发生中的核心作用，不仅是理解其全脑功能的重要基石，也为未来研究其如何通过海马的输出投射（如至杏仁核或前额叶皮层的环路）影响焦虑网络提供了关键的机制起点和特异性靶点。

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基金资助

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