电针通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路减轻膝关节骨关节炎大鼠膝关节软骨凋亡

Electroacupuncture alleviates articular chondrocyte apoptosis in rats with knee osteoarthritis by regulating the TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway

摘要

目的 探讨电针调控Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核转录因子-κB（NF-κB）信号通路对膝关节骨关节炎（KOA）大鼠软骨组织凋亡的影响。 方法 27只SPF级SD大鼠随机分为空白组、模型组和电针组（n=9）。采用碘乙酸钠（MIA）法复制KOA大鼠模型。电针组予“内膝眼”“犊鼻”“血海”“阳陵泉”电针干预（疏密波，2/100 Hz，0.5~1.0 mA，20 min/d，14 d）。LequesneMG行为学量表评估大鼠膝关节功能、苏木精-伊红染色（HE）观察大鼠软骨细胞病理改变；透射电镜（TEM）观察大鼠软骨细胞超微结构形态、Western blotting检测TLR4、MyD88、NF-κBp65、II型胶原蛋白（COL2）、X型胶原蛋白（COL10）、Bcl-2关联X蛋白（Bax）、B淋巴细胞瘤-2蛋白（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3蛋白（Caspase-3）表达水平，实时荧光定量PCR法检测软骨组织TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA表达水平；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组大鼠血清中白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α水平。另取15只SPF级SD大鼠，随机分为空白组、模型组、抑制剂组（TAK-242）、电针组、假电针组（n=3），Western blotting检测高迁移率族蛋B1（HMGB1）及通路关键蛋白表达，并分析NF-κB p65核转位情况。 结果 与空白组比较，模型组大鼠LequesneMG评分升高，HE染色可见膝关节软骨细胞减少，细胞肿胀，细胞核固缩、消失，电镜下软骨细胞膜失去完整性，细胞核呈不规则形态，染色质固缩呈团块状，线粒体肿胀、嵴被破坏，TLR4/MyD88/NF-κB p65、COL10、Bax、Caspase-3蛋白及mRNA表达升高，COL2、Bcl-2表达降低，血清IL-1β、TNF-α水平升高（P<0.01）。与模型组比较，电针干预可显著降低LequesneMG评分，改善软骨组织结构损伤及细胞超微结构异常；下调TLR4、MyD88、NF-κB p65及Bax、Caspase-3表达，上调Bcl-2表达，同时降低血清IL-1β、TNF-α水平（P<0.01）。Western blotting结果显示，模型组大鼠软骨组织中HMGB1蛋白表达显著升高（P<0.01），并伴随NF-κBp65核转位增强；电针干预后HMGB1表达下降，NF-κB p65核内表达降低、胞质表达回升（P<0.01）。TLR4抑制剂组呈现相似变化趋势，而假电针组未见明显改善（P>0.05）。同时，TLR4、MyD88及NF-κB p65的mRNA表达变化趋势与蛋白水平一致。 结论 电针可能通过抑制HMGB1介导的TLR4/MyD88/NF-κB信号通路异常激活，减少NF-κB p65核转位，进而调节Bcl-2/Bax表达平衡，抑制线粒体依赖性软骨细胞凋亡过程，从而发挥抗炎及抗凋亡作用并改善KOA软骨损伤。

Abstract

Objective To investigate the effect of electroacupuncture (EA) on chondrocyte apoptosis in rats with knee osteoarthritis (KOA) and the underlying mechanism. Methods Twenty-seven SD rats were randomly divided into blank group, KOA model group, and EA group (n=9). Rat models of KOA were established by intra-articular injection of monosodium iodoacetate, and EA treatment was administered at the acupoints "Neixiyan", "Dubi", "Xuehai", and "Yanglingquan" (dense-sparse wave, 2/100 Hz, 0.5-1.0 mA, 20 min/day for 14 days). Knee function of the rats was assessed using Lequesne MG scale, and cartilage pathologies and ultrastructural changes were observed with HE staining and transmission electron microscopy. The protein expressions of TLR4, MyD88, NF-κB p65, COL2, COL10, Bax, Bcl-2, and caspase-3 and mRNA levels of TLR4, MyD88, and NF‑κB p65 were detected using Western blotting and RT-qPCR; serum levels of IL-1β and TNF‑α were determined with ELISA. Another 15 rats were randomized into blank control, model, TLR4 inhibitor (TAK-242), EA, and sham-EA groups (n=3) for analysis of HMGB1 and key pathway protein expressions and NF‑κB p65 nuclear translocation. Results The KOA rats showed increased Lequesne MG scores, obvious chondrocyte injuries, upregulated TLR4, MyD88, NF‑κB p65, COL10, Bax, and caspase-3 expressions, increased serum IL-1β and TNF‑α levels with decreased COL2 and Bcl-2 expressions. EA significantly reduced Lequesne MG scores, improved cartilage pathologies and reversed the abnormal changes in protein expressions and inflammatory cytokines. The KOA rats showed increased HMGB1 expression and enhanced NF‑κB p65 nuclear translocation, and EA treatment effectively decreased HMGB1 expression, reduced nuclear NF‑κB p65, and increased cytoplasmic NF‑κB p65. The TLR4 inhibitor produced similar effects, while sham EA produced no significant effect. Conclusion EA alleviates cartilage injury in KOA rats possibly by inhibiting HMGB1-mediated activation of TLR4/MyD88/NF‑κB signaling and NF‑κB p65 nuclear translocation to regulate Bcl-2/Bax balance and suppress mitochondria-dependent chondrocyte apoptosis.

Graphical abstract

膝关节骨关节炎（KOA）是一种常见于中老年群体的慢性退行性关节病变，以膝关节疼痛、功能障碍甚至行走能力丧失为主要临床表现。随着人口结构老龄化，现已成为全球第四大致残性疾病^［1］，积极开展KOA疾病防治具有重要意义。目前KOA的具体发病机制尚未完全阐明，主流观点认为其病理过程涉及关节软骨退化、软骨下骨微结构重塑以及关节周围炎症反应三个核心环节，三者相互影响，形成复杂的病理网络^［2-4］。Toll样受体4（TLR4）/髓样分化因子88（MyD88）/核因子-κB（NF-κB）信号通路作为经典的炎症信号转导途径，在KOA的发生发展及关节软骨破坏中扮演关键角色^［5］。因此，如何有效调控该信号通路以抑制炎症反应、延缓软骨损伤，已成为当前KOA治疗研究的重要方向之一。课题组前期研究表明电针治疗能够有效改善KOA患者的症状^［6］，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路作为调控KOA炎症反应和软骨细胞凋亡的关键枢纽，其过度活化被证实是驱动软骨退变的核心机制之一^［5］。

本研究在前期临床研究基础上，选取“内膝眼”“犊鼻”“血海”“阳陵泉”四穴进行电针干预。中医学认为KOA属“痹证”“筋骨痹”范畴，《素问·痿论》有“宗筋主束骨而利机关也”之论，膝部为多经筋交汇之所。内膝眼为经外奇穴，犊鼻属足阳明胃经，血海属足太阴脾经，阳陵泉属足少阳胆经且为“筋会”。四穴合用，既可疏通膝部经络、调畅局部气血，又能活血通络、舒筋利节，标本兼顾。从现代解剖与神经生理机制来看，内膝眼与犊鼻位于膝关节腔周围，受股神经、腓总神经分支支配，神经纤维投射至L₄-₅脊髓节段，与KOA痛觉传入节段重叠，依据疼痛闸门学说^［7，8］，该类穴位刺激可通过激活粗纤维抑制脊髓背角兴奋性中间神经元，关闭痛觉传导闸门，实现节段性镇痛。血海位于股内侧肌与缝匠肌之间，受股神经股内侧肌支支配，神经投射至L₄-₅节段，与内膝眼、犊鼻的神经节段分布形成互补；同时其深层富含动静脉吻合支，刺激后扩张局部血管，加速TNF-α、IL-1β等炎症因子清除，改善关节微环境。阳陵泉位于腓骨小头前下方，受腓总神经支配，神经投射至L₅-S₁脊髓节段，与膝关节外侧痛觉传导路径一致，针刺阳陵泉可通过调控脊髓背角CB2R抑制促炎因子IL-1β表达以缓解慢性疼痛^［9］，同时还可松解痉挛肌肉、增强膝周肌力，稳定关节结构。以上选穴理论提示，电针作用于这组特定穴位，可能通过调节局部神经-免疫-炎症网络，进而影响软骨细胞的生存与凋亡。但其是否通过靶向抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的异常激活，进而阻断软骨细胞凋亡进程，目前尚未阐明。本次研究通过构建KOA大鼠模型，深入研究电针干预对KOA大鼠软骨细胞凋亡的影响，同时通过TLR4/MyD88/ NF-κB信号通路探讨其潜在作用机制。

1 材料和方法

1.1 电针对KOA大鼠软骨细胞凋亡及线粒体凋亡途径的影响

1.1.1 动物分组

32只健康SPF级雄性SD大鼠，体质量（280±20）g，10~12周龄，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，常规分笼饲养于安徽中医药大学科学实验中心清洁动物房，室温（22±3）℃，湿度（60±10）%，12 h/12 h光暗循环，自由进食饮水。动物适应性喂养1周后，将其中的9只随机纳入空白对照组，其余23只用于建立KOA模型，将造模成功的18只大鼠随机分配至模型组与电针组，每组各9只。本研究所有动物实验操作均经安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（伦理批号：AHUCM-rats-2023200）。

1.1.2 主要试剂及仪器

戊巴比妥钠（上海上药新亚），碘乙酸钠（MIA，武汉克米克），苏木精-伊红（HE）染色试剂盒、大鼠IL-1β、TNF-α酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（杭州联科）、BCA蛋白定量试剂盒（上海赛默飞）、羊抗兔HRP标记二抗、羊抗鼠HRP标记二抗（北京中杉金桥），GAPDH、Caspase-3抗体、COL2抗体、COL10抗体，（Proteintech），TLR4抗体、MyD88抗体（CST），NF‑κBp65抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体（Abcam），总RNA提取试剂（北京索莱宝），逆转录试剂盒、扩增试剂盒（北京全式金）。

生物组织包埋机（湖北亚光），病理切片机（深圳达科为），显微镜（尼康），透射电子显微镜（FEI），电泳仪（BIO-RAD），电转仪（大连竞迈），酶标仪（雷勃），荧光定量PCR仪（上海宏石），台式高速冷冻离心机（EPPENDORF），掌上离心机（上海碧云天），超微量分光光度计（南京五义）。

1.1.3 模型制备

大鼠术前禁食不禁水6~8 h，采用MIA法复制KOA模型^［10］。腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（5 mL/kg）麻醉大鼠，将右侧膝关节附近鼠毛剔除干净并消毒，使膝关节弯曲45°，从髌骨下极髌腱外缘处进针，当针下有落空感、回抽无血后向关节腔内注射50 μL MIA溶液（60 mg/mL），空白组于右侧膝关节腔内注射50 μL0.9%氯化钠溶液，3组大鼠均在注射后进行数次膝关节屈伸运动。造模14 d后，LequesneMG行为学评分≥6分判断造模成功^［11］。

1.1.4 干预方法

电针组将大鼠采用鼠套固定，参照《实验针灸学》取患侧“内膝眼”、“血海”、“犊鼻”、“阳陵泉”予以电针治疗。定位：参照2020年中国针灸学会发布的团体标准《实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠》^［12］（T/CAAM0002-2020），并结合动物比较学方法进行定位。“内膝眼”：髌骨内侧，髌韧带内侧凹陷处；“犊鼻”：髌骨外侧，膝关节外侧凹陷中；“血海”：后肢股内侧，髌骨底内侧端与耻骨连线的下1/9处；“阳陵泉”：小腿外侧，在腓骨头前下方凹陷处，距足三里上外侧约3 mm。

针刺方法：将大鼠仰卧固定于治疗台上，充分暴露右侧下肢部位。采用3%异氟烷（1 L/min）进行诱导麻醉，并在1%异氟烷（1 L/min）维持气麻状态下实施针刺治疗。选用一次性无菌针灸针（0.25 mm×25 mm）分别于右侧“内膝眼”、“犊鼻”、“血海”、“阳陵泉”分别直刺2~4 mm左右。常规提插捻转后，采用KWD-808I型脉冲针灸治疗仪进行电针干预，将第1组电针正、负极分别接“内膝眼”、“血海”穴，第2组电针正、负极分别接“犊鼻”、“阳陵泉”穴。电针参数及治疗时间：波形为“疏密波”，频率为2/100 Hz，电流强度为0.5~1.0 mA，以局部肌肉轻度抖动为度，留针20 min，1次/d，连续14 d。

1.1.5 取材

大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，通过趾夹反射确认大鼠意识完全丧失后，暴露腹部，抽取腹主动脉血1~2 mL用于ELISA检测。采血完毕后，立即使用大鼠专用断头器对大鼠实施断头处死，以确保死亡。大鼠处死后，分离其右侧膝关节，充分暴露胫骨平台及对应股骨髁表面的软骨组织，之后在股骨外髁、内髁提取新鲜软骨组织，每组随机取3例样本置于4%多聚甲醛溶液中固定，用于HE染色；另每组取3例样本，于4 ℃条件下修整为2 mm×2 mm×2 mm组织块，放入2.5%戊二醛固定液中，供透射电镜观察；剩余3只大鼠软骨组织分别将其用于RT-PCR及Western blotting检测。

1.1.6　LequesneMG行为学量表评分

造模后及电针干预后，由两名经过培训且对分组不知情的研究人员对大鼠右肢进行LequesneMG行为学量表评分^［13］，评分由包括疼痛等不适反应、关节肿胀、步态改变和关节屈伸角度四部分组成，共计12分，分值越高提示骨关节炎症状越重。所有评估由两人独立记录，如遇评分差异，两人再次严格按照量表标准进行判定，达成一致后获得最终评分。

1.1.7　HE染色观察膝关节软骨组织病理学变化

取出固定于4%多聚甲醛中的软骨组织，使用二乙胺四乙酸脱钙处理，经由梯度乙醇脱水，并运用石蜡包埋，切片（厚度5 µm），二甲苯将切片脱蜡，梯度乙醇水化后置于苏木素染色液中浸染3 min，1%盐酸乙醇分化液分化，水洗，氨水返蓝，伊红染色液染色2 min，蒸馏水冲洗后梯度乙醇脱水，使用二甲苯透明及中性树胶密封，在光镜下观察大鼠膝关节软骨组织病理学变化。

1.1.8　透射电镜观察膝关节软骨组织超微结构

将上述保存的软骨组织样本取出（2 mm×2 mm×2 mm），将其置于2.5%戊二醛固定，0.1 mol/L磷酸盐（PBS）缓冲液漂洗后再次使用1%锇酸室温固定，再将样本用PBS缓冲液冲洗3次，梯度乙醇，丙酮依次脱水，包埋后切片，厚度约70 nm，用醋酸双氧铀-柠檬酸铅染液进行染色，使用透射电镜观察软骨组织细胞超微结构改变。

1.1.9 Western blotting检测软骨组织中TLR4、NF-κBp65、COL2、COL10、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白水平

取适量低温保存的软骨组织（约0.1g），加入RIPA裂解液进行充分匀浆，经12 000 r/min离心15 min后收集上清液，采用BCA比色法测定样本中的总蛋白浓度，并据此计算电泳上样量。后续依次进行蛋白电泳分离、转膜及5%脱脂牛奶封闭，之后分别加入一抗（TLR4、NF-κBp65、COL2、COL10、Bax、Bcl-2、Caspase-3均为1∶1000稀释，GAPDH为1∶8000稀释），和膜室温孵育2 h；TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗稀释液（1∶10 000）中，于37 ℃条件下孵育1 h后使用TBST缓冲液充分洗涤膜片。最后采用ECL化学发光试剂进行显影。利用ImageJ软件对目标条带进行灰度分析，以GAPDH作为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。

1.1.10　RT-PCR检测关节软骨组织

取软骨组织100 mg加入装有TRIzol 1mL的匀浆管，吹打裂解，室温静置5 min；加入0.2倍体积氯仿剧烈震荡15 s，室温静置3 min；4 ℃，12 000×g离心15 min，吸取约400 μL上层无色水相；加入0.5倍体积异丙醇颠倒混匀，室温静置10 min；4 ℃，12 000×g离心10min弃上清后加入1 mL 75%乙醇涡旋洗涤沉淀，4 ℃，7500×g离心5min后弃上清；室温干燥5~10 min，用RNase-free水溶解RNA，取RNA反转录得到cDNA，并以该cDNA为模板，用目的基因设计合成的引物进行Real-timePCR，反应条件为95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，循环40次。以GAPDH为内参，采用2^-△△Ct法计算出各目的基因相对表达量，引物序列见表1。引物由北京全式金公司合成。

1.1.11　ELISA检测血清中IL-1β、TNF-α水平

腹主动脉采血后，3500 r/min离心15 min分离血清，按照ELISA试剂盒说明书依次进行滴加标准品、加酶、冲洗、滴加显色液等操作，完成后酶标仪于450 nm处测定各孔吸光度A_{450 nm}，依据标准曲线计算IL-1β、TNF-α的浓度值。

1.2 电针对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的调控机制验证

1.2.1 动物分组

18只健康SPF级雄性SD大鼠，动物饲养环境同实验1。动物适应性喂养1周后，将其中的3只随机纳入空白对照组，其余15只用于建立KOA模型，将造模成功的12只大鼠随机分配至模型组、抑制剂组、电针组、假电针组，每组各3只。本研究所有动物实验操作均经安徽中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（伦理批号：AHUCM-rats-2023200）。

1.2.2 主要试剂

戊巴比妥钠（上海上药新亚），碘乙酸钠（MIA，武汉克米克），BCA蛋白定量试剂盒（上海赛默飞）、羊抗兔HRP标记二抗（Jackson），羊抗鼠HRP标记二抗、HMGB1抗体、MyD88抗体、NF-κBp65抗体（Proteintech）、TLR4抗体（Affinity），GAPDH（华安生物）、H3（武汉Abbkine）。

1.2.3 模型制备

实验2模型制备同实验1。

1.2.4 干预方法

电针组干预方法同实验1。

抑制剂组，将TLR4通路抑制剂TAK-242（武汉博尔夫）溶于二甲基亚砜（DMSO）中配成100 mg/mL储备液，-20℃避光保存。临用前，将储备液用无菌生理盐水稀释100倍，得到浓度为1 mg/mL的注射溶液，此时DMSO终浓度为1%。抑制剂组按3mL/kg腹腔注射^［14］。空白组、模型组、电针组和假电针组则腹腔注射等体积的溶媒，即含1%DMSO的无菌生理盐水。腹腔注射1次/d，于固定时间进行，持续14 d。

假电针组定位选取非经穴区，血海假穴：血海穴正上方5 mm处；犊鼻假穴：膝关节外侧副韧带体表投影区（位于股骨外侧髁与腓骨头之间）；内膝眼假穴：膝关节内侧副韧带体表投影区（位于股骨内侧髁与胫骨内侧髁之间）；阳陵泉假穴：阳陵泉穴后外侧5 mm（即腓骨小头后缘体表投影）。所有假穴处进针深度均为3~5 mm，针尖以触及韧带表面（犊鼻/内膝眼假穴）或皮下筋膜层（血海/阳陵泉假穴）为准，避免进入关节腔或损伤主要血管神经。操作由同一名实验者完成，以确保位置标准化。治疗周期及电针参数同实验1。

1.2.5 观察指标及检测方法

取材：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，通过趾夹反射确认大鼠意识完全丧失后，立即使用大鼠专用断头器对大鼠实施断头处死，以确保死亡。大鼠处死后，分离其右侧膝关节，充分暴露胫骨平台及对应股骨髁表面的软骨组织，之后在股骨外髁、内髁提取新鲜软骨组织，每组3只大鼠软骨组织用于RT-PCR及Western blotting检测。

1.2.5.1　Western blotting检测软骨组织中HMGB1、TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白水平

取适量低温保存的软骨组织（约0.1 g），加入RIPA裂解液进行充分匀浆，经12 000 r/min离心10 min后收集上清液，采用BCA比色法测定样本中的总蛋白浓度，并据此计算电泳上样量。后续依次进行蛋白电泳分离、转膜及5%脱脂牛奶封闭30 min，之后加入一抗稀释（（TLR4为1∶1000、MyD88为1∶2000，HMGB1、NF-κB p65、H3、GAPDH为1∶5000稀释），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗稀释液（1∶5000）中，于室温条件下孵育30 min后使用TBST缓冲液充分洗涤膜片。最后采用ECL化学发光试剂进行显影。利用ImageJ软件对目标条带进行灰度分析，以GAPDH作为HMGB1、TLR4、MyD88、p65胞质的内参蛋白，以H3为核内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量。

1.2.5.2 RT-PCR检测关节软骨组织

实验步骤及引物序列同实验1.1.10。

1.3 统计学分析

采用SPSS25.0统计软件进行统计学分析。计量资料经检验均符合正态分布，以均数±标准差表示。多组间比较用单因素方差分析，若差异具有统计学意义，则进一步进行两两比较：方差齐用LSD检验，方差不齐用Tamhane's T₂检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 电针对KOA大鼠软骨细胞凋亡及线粒体凋亡途径的影响

2.1.1 各组大鼠LequesneMG行为学量表评分比较

造模后，与空白组比较，模型组和电针组大鼠LequesneMG评分较造模前明显升高（P<0.01）。干预后，与模型组比较，电针组大鼠LequesneMG评分明显下降（P<0.05，图1）。

2.1.2 各组大鼠膝关节软骨细胞病理及超微结构比较

空白组大鼠膝关节软骨细胞数量正常，未见明显病变（图2A）；与空白组相比，模型组大鼠软骨膝关节细胞减少，可见细胞肿胀，细胞核固缩、消失（图2B）；与模型组相比，电针组大鼠膝关节软骨细胞病变减少（图2C）。

2.1.3 各组大鼠膝关节软骨细胞超微结构比较

空白组KOA大鼠的软骨细胞形态大致呈椭圆形，胞膜轮廓清晰、连续性好。细胞核形态规则，核膜完整，染色质分布均匀，无明显凝聚。胞质内线粒体形态正常，嵴结构清晰可见，并可见少量自噬体及溶酶体等囊泡结构散在分布（图3A）。模型组软骨细胞出现明显变性，胞膜破裂或不连续，核形不规则，染色质发生固缩并聚集成团。线粒体明显肿胀、嵴结构断裂或消失（图3B）。电针干预后，细胞形态趋于规则，胞膜完整性有所恢复，细胞核内染色质凝聚程度减轻，线粒体结构改善，肿胀不明显，嵴结构较为清晰（图3C）。

2.1.4 各组大鼠膝关节软骨组织TLR4、MyD88、NF-κBp65、COL2、COL10、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相对水平比较

较空白组相比，模型组大鼠软骨组织TLR4、MyD88、NF-κBp65、COL10、Bax、Caspase-3蛋白表达显著升高（P<0.01），COL2和Bcl-2蛋白表达明显降低（P<0.01）。电针干预后，大鼠软骨组织TLR4、MyD88、NF-κBp65、COL10、Bax、Caspase-3表达较模型组显著下降（P<0.01），而COL2和Bcl-2表达则升高（P<0.01，图4）。

2.1.5 各组大鼠软骨组织TLR4、MyD88、NF-κBp65mRNA表达水平比较

在模型组大鼠软骨组织中，TLR4、MyD88和NF-κB p65的mRNA表达水平较空白组均升高（P<0.01）；而经电针干预后，TLR4、MyD88、NF-κBp65mRNA的转录水平均较模型组出现下降（P<0.01，图5）。

2.1.6 各组大鼠血清中IL-1β、TNF-α表达比较

与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、TNF-α表达升高（P<0.01）；经电针干预后，大鼠血清中IL-1β、TNF-α表达较模型组下降（P<0.01，图6）。

2.2 电针对TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的调控机制验证

2.2.1 各组大鼠膝关节软骨组织HMGB1、TLR4、MyD88蛋白相对水平以及NF-κBp65入核情况比较

较空白组相比，模型组大鼠软骨组织HMGB1、TLR4、MyD88蛋白表达升高（P<0.01）。抑制剂干预后，大鼠软骨组织HMGB1蛋白表达较模型组未见下降（P>0.05），TLR4、MyD88蛋白表达较模型组下降（P<0.01）；电针干预后，大鼠软骨组织HMGB1、TLR4、MyD88表达较模型组下降（P<0.01）。假电针组干预后，大鼠软骨组织HMGB1、TLR4、MyD88表达较模型组未见下降（P>0.05）。

与空白组相比，模型组核内p65表达升高、胞质降低（P<0.01）。与模型组比较，电针组与抑制剂组核内p65均下降、胞质回升（P<0.01），两组间差异无统计学意义（P>0.05）。假电针组核内、胞质p65表达均与模型组差异无统计学意义（P>0.05），且与电针组和抑制剂组差异有统计学意义（P<0.01），说明假电针对p65入核无抑制作用（图7）。

2.2.2 各组大鼠软骨组织TLR4、MyD88、NF-κBp65mRNA表达水平比较

在模型组大鼠软骨组织中，TLR4、MyD88和NF-κB p65的mRNA表达水平较空白组均升高（P<0.01）；假电针组干预后，上述指标未见下降（P>0.05）；而经抑制剂与电针干预后，TLR4、MyD88、NF-κBp65mRNA的转录水平均较模型组出现下降（P<0.01，图8）。

3 讨论

电针具有疏通经络气血的作用，已被证实是有效治疗KOA的措施^［15-18］。本研究通过建立KOA大鼠模型，从TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导软骨细胞凋亡角度入手，观察电针调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制KOA大鼠关节软骨退变的分子机制，为电针治疗KOA的“抗炎-抗凋亡”协同效应提供新的实验依据。

关节软骨退变是KOA的核心病理特征，其进展与炎症介导的基质降解及软骨细胞过度凋亡密切相关^［19-21］。本研究中，模型组大鼠Lequesne MG评分显著升高，HE染色显示软骨细胞核固缩消失，透射电镜进一步观察到染色质边集、线粒体嵴断裂等凋亡执行期超微结构改变，这些形态学证据与TLR4/MyD88/NF-κB促凋亡通路过度激活的下游效应吻合^［22］。电针干预后，软骨细胞数量回升，核形态规则且线粒体结构改善，说明电针干预显著改善了KOA模型大鼠的软骨结构损伤，提示其对软骨基质具有保护作用。我们推测，这种保护效应可能与其抑制软骨细胞过度凋亡的能力相关。

炎症微环境是触发软骨细胞凋亡和基质降解的关键上游因素^［23］。在KOA进程中，炎性因子（如IL-1β、TNF-α）持续刺激软骨细胞，导致基质金属蛋白酶（MMPs）和组织蛋白酶等降解酶过度表达，进而破坏软骨基质中的胶原蛋白和蛋白多糖^{［24，25］}。COL2作为维持软骨结构和功能的主要胶原，其降解直接削弱关节的缓冲和承重功能^［26］。COL10是肥大软骨细胞最特异和最主要的分泌产物之一。当软骨细胞停止增殖并进入终末分化阶段时，它们合成和分泌的COL10可以通过改造周围的细胞外基质环境，为软骨细胞凋亡创造必要条件^［27］。本研究观察到，电针干预后血清IL-1β、TNF-α水平显著降低，同时软骨组织COL2表达上调而COL10表达下调。这些结果明确提示，电针能有效改善KOA关节内的炎症微环境，恢复基质代谢平衡，从而可能间接减轻对软骨细胞的凋亡刺激。

TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在介导KOA炎症反应和连接炎症与凋亡中扮演核心枢纽角色。该通路的异常活化是诱发关节软骨破坏性炎症的关键环节^［28-30］。关节内损伤相关分子模式激活TLR4受体后^［31］，通过衔接蛋白MyD88招募TNF受体相关因子6，激活IκB激酶复合物并促使κB抑制蛋白（IκB）磷酸化降解^［32］，最终导致NF-κBp65亚基核转位，启动IL-1β、TNF-α等促炎因子转录^［33］。活化的NF-κB直接调控凋亡相关基因表达，通过打破Bcl-2蛋白家族平衡驱动线粒体凋亡途径：促凋亡蛋白Bax在线粒体膜成孔，促使细胞色素C释放，进而激活caspase级联反应；而抗凋亡蛋白Bcl-2通过与Bax形成异源二聚体阻断该过程^［34-36］。

本研究的实验1显示，电针干预不仅有效抑制NF-κBp65核转位，上调Bcl-2表达并降低caspase-3活性，更通过透射电镜观察到其直接保护线粒体结构的形态学证据。上述结果证实，电针通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路，一方面下调促炎因子产生，另一方面通过稳定Bcl-2/Bax平衡保护线粒体完整性、抑制caspase激活，形成“抗炎-抗凋亡”协同机制，最终维持软骨细胞稳态。本研究在实验2中进一步检测了上游关键配体HMGB1的表达变化。结果显示，与空白组比较，模型组大鼠软骨组织中HMGB1蛋白表达显著升高，提示内源性DAMPs释放增加是TLR4激活的重要启动因素；电针干预后HMGB1表达显著下降，效果与TLR4抑制剂TAK-242相当，表明电针可能通过抑制HMGB1等DAMPs的释放，从源头上减少TLR4的激活信号。同时，针对下游NF-κBp65核转位这一关键环节，采用核质分离Western blot技术进行了直接验证。结果显示，模型组大鼠软骨细胞核内NF-κBp65蛋白表达显著升高而胞质表达降低，证实了p65的核转位；电针干预后，核内p65表达显著降低、胞质p65表达回升，与模型组比较差异显著，与抑制剂组效果一致。这一结果直接证明了电针能够阻断NF-κBp65向细胞核的迁移，从而抑制其下游促炎和促凋亡基因的转录。同时增设了假电针组，选取非经非穴点进行浅刺并施加相同电刺激，以排除位置非特异性效应。结果显示，假电针组大鼠软骨组织中HMGB1、TLR4、MyD88蛋白及mRNA表达水平与模型组比较无显著差异，NF-κBp65的核转位亦未见明显改善，且与电针组比较差异显著。这一结果有力地排除了麻醉、抓取、单纯针刺等非特异性刺激效应，证实了本研究所观察到的抗炎、抗凋亡作用源于特定穴位与特定电针参数组合的特异性调控，而非针刺的泛化效应。

本研究围绕 TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路开展探索，通过行为学评估、形态学观察和分子生物学检测等多方面实验发现，电针不仅能降低 TLR4、MyD88、NF-κB p65 等通路关键分子的 mRNA 及蛋白表达水平，还能同步改善关节内炎症环境，调节软骨细胞的凋亡平衡。这种 “抗炎-抗凋亡” 的协同作用，进一步说明该通路在电针治疗 KOA 的过程中，发挥着重要的调控作用。

本研究结果提示，电针可有效改善KOA大鼠膝关节功能并减缓软骨组织病理演变。其作用机制不仅与下调TLR4/MyD88/NF-κB信号通路关键分子表达有关，还可能通过抑制上游配体HMGB1的异常释放，减少TLR4通路的激活信号；同时，通过抑制NF-κB p65的核转位，降低炎症因子转录水平，进而调节Bcl-2/Bax表达平衡，抑制线粒体介导的软骨细胞凋亡过程。受实验条件限制，本研究机制验证部分样本量相对较小，但结合多指标一致性变化及TLR4抑制剂干预结果，从一定程度上支持了上述结论，其可靠性仍有待进一步扩大样本量加以验证。此外，本研究主要聚焦于经典MyD88依赖性通路，TLR4激活后是否存在非经典TRIF依赖途径的参与，以及电针是否通过调控该支路发挥协同作用，仍需进一步研究。

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