基于Th17/Treg免疫平衡探讨松节方对类风湿性关节炎风寒湿痹证模型大鼠的干预作用

Songjie Formula alleviates rheumatoid arthritis in rats with wind-cold-dampness syndrome by regulating Th17/Treg immune balance

摘要

目的 基于Th17/Treg免疫平衡，探讨松节方（SJF）对类风湿性关节炎（RA）及风寒湿痹证（WCDA）的治疗机制。 方法 建立RA及WCDA大鼠模型，造模成功大鼠分别分为模型组、松节方组（n=10），另设正常对照组10只。连续给药2周。观察大鼠体质量、一般状态及足跖肿胀度；以酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清白介素-10（IL-10）、白介素-17（IL-17）、白介素-21（IL-21）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平；流式细胞仪检测外周血、脾细胞T细胞亚群Th17、Treg细胞的比例；以实时荧光定量聚合酶链反应法检测大鼠踝关节滑膜中维甲酸相关孤儿受体γt（RORγt）、叉头转录因子3（Foxp3）mRNA的表达情况； Western blotting法检测踝关节滑膜组织RORγt和Foxp3蛋白表达水平。 结果 在类风湿性关节炎（RA）及风寒湿痹证（WCDA）模型中，松节方可明显改善模型大鼠的一般状况，显著抑制足肿胀，下调促炎因子IL-17、IL-21、TNF-α水平（P<0.05），上调抗炎因子IL-10（P<0.01），同时显著升高Treg细胞百分比（P<0.01），降低Th17细胞百分比（P<0.01），并能抑制RORγt mRNA及蛋白表达（P<0.01），促进Foxp3 mRNA及蛋白表达，显著改善滑膜炎症浸润。 结论 松节方干预后模型大鼠的炎症因子水平、Th17/Treg 比例及 RORγt/Foxp3 表达均发生显著变化，提示松节方改善模型大鼠关节炎症及病理损伤的作用可能与调节Th17/Treg平衡有关。

Abstract

Objective To investigate the therapeutic mechanism of Songjie Formula (SJF) for alleviating rheumatoid arthritis (RA) with wind-cold-dampness arthralgia syndrome (WCDA) from the perspective of Th17/Treg immune balance. Methods Twenty male SD rat models of RA with WCDA were randomized into two equal groups for daily gavage with saline (model group) or SJF for 14 consecutive days, with 10 normal rats serving as the normal control group. The changes in body weight, general condition, and plantar swelling of the rats were monitored. Serum levels of interleukin-10 (IL-10), IL-17, IL-21, and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) were measured using ELISA, and Th17 and Treg cell percentages in peripheral blood and splenic T cell subsets were analyzed by flow cytometry. RT-qPCR and Western blotting were used to detect the mRNA and protein expression levels of retinoic acid-related orphan receptor γt (RORγt) and forkhead box P3 (Foxp3) in the ankle joint synovial tissue. Results In the rats models of RA with WCDA, SJF gavage significantly improved the general condition, reduced foot swelling, downregulated serum levels of IL-17, IL-21, and TNF-α, upregulated IL-10 level, and obviously increased Treg cell percentage while decreasing Th17 cell percentage. SJF treatment also significantly suppressed the expressions of RORγt mRNA and protein, promoted Foxp3 mRNA and protein expressions, and alleviated synovial inflammatory cell infiltration in the rat models. Conclusion SJF regulates inflammatory cytokine levels, Th17/Treg ratio, and RORγt/Foxp3 expressions in RA rat model with WCDA, suggesting that its therapeutic efficacy for RA is mediated primarily by ameliorating joint inflammation and pathologies via modulating the Th17/Treg balance.

Graphical abstract

关键词

松节方 / 类风湿性关节炎 / 风寒湿痹证 / Th17/Treg平衡 / RORγt / 叉头转录因子3

Key words

Songjie Formula / rheumatoid arthritis / wind-cold-dampness arthralgia / Th17/Treg balance / retinoic acid-related orphan receptor γt / forkhead box P3

风湿性疾病是一类以关节滑膜慢性炎症为主要病理特征的全身性自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全明确。研究表明其发生、发展与淋巴细胞免疫功能紊乱密切相关，涉及T细胞分化异常、细胞因子网络失调以及B细胞介导的自身抗体产生等病理过程^［1-4］。进一步研究揭示，辅助性T细胞17（Th17）与调节性T细胞（Treg）之间的平衡失调是推动疾病进展的关键环节^［5-8］，调节Th17/Treg平衡是现阶段的研究热点。中医将风湿性疾病归属于痹证范畴，中医药在治疗痹证方面积累了丰富的经验，具有独特优势，方法和药物种类繁多。中药复方成分的多样性和复杂性，决定了其具有多靶点作用效应的特点，能够参与调控多种生物途径。从中医证候角度探究Th17/Treg平衡在痹证发病中的作用，对于阐明痹证的发病机制、指导新药研发及扩大临床应用均具有重要的意义。

松节方作为经典中药复方，具有散寒祛风、通经活络的功效，前期研究已明确发现松节方具有明显的抗类风湿性关节炎（RA）作用，能够有效抑制RA模型大鼠T淋巴细胞上游信号通路相关分子的表达^{［9， 10］}，但其发挥药效的物质基础和深层次作用机制仍需进一步深入研究。本研究从中医证候角度，通过建立RA及风寒湿痹证（WCDA）大鼠模型，探讨松节方对Th17/Treg平衡的调控作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠60只，体质量180~220 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，实验动物生产许可证 SCXK（京）2019-0008。动物饲养于符合 GLP 规范的实验室，实验动物使用许可证SYXK（渝）2022-0005，自由摄取饲料与饮水。本研究动物使用严格遵守重庆市中药研究院实验动物伦理规定（伦理批号： YLS2024-10）。

1.2 药物

松节方提取物（SJF）由羌活、独活及松节组成，药材均购自重庆德桂堂药房，由我院王昌华研究员鉴定羌活为伞形科羌活属植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T. Chang的干燥根茎和根，独活为伞形科当归属植物重齿毛当归Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根，松节为松科植物油松Pinus tabuliformis Carr.的干燥瘤状节或分枝节。

取羌活、独活及松节药材等分，加入10倍量75%乙醇浸泡0.5 h，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，过滤，减压回收乙醇，即得提取物浸膏，流浸膏得率为62.5%，其中蛇床子素、异欧前胡素质量分数分别为0.685、1.22 g/kg。将SJF提取物（1.6 g生药/mL，批号20251101）采用纯化水调配成浓度为0.616 g生药/mL的混悬液，以备后续实验使用。

1.3 主要仪器及试剂

Step One plus Real Time PCR System（ABI），电泳仪（Bio-rad），凝胶成像仪稳压DNA电泳仪（Tanon），垂直板电泳转移装置（Bio-Rad），Trans-Blot转膜装置（Bio-Rad），图像分析系统（Tanon），电泳仪（Bio-Rad），Varioskan LUX多功能酶标仪（Thermo Fisher Scientific），Tanon-4200凝胶成像系统（Tanon），除热原超纯水系统（Millipore），高速台式离心机（Beckman），PB-10电子酸度计（赛多利斯），GSP-9160MBE电热恒温水浴箱（上海博讯），XW-80A旋涡振荡器（海门其林贝尔），TS-85脱色摇床（海门其林贝尔），MCO-15AC-SC二氧化碳培养箱（sanyo），ECLIPSE Ti-s倒置荧光显微镜（Nikon），CytoFLEX流式细胞仪（Beckman），ASP300S组织自动脱水机（徕卡），HistoCore Arcadia H石蜡包埋机（徕卡），TK-218型恒温摊片烤片机（泰维），RM2235轮转切片机（徕卡），DP260全自动智能染色机（达科为），Mias-2000病理图象处理系统（四川大学），PV-200足趾容积测量仪（泰盟科技）。

完全弗氏佐剂（CFA）、戊巴比妥钠（sigma），RNAiso plus、BCA Protein Assay Kit（takara），Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（gDNA digester plus）、Hieff UNICON® Universal Blue Qpcr SYBR Green Master Mix、180 000 Prestained Protein Marker（上海翌圣生物），兔源ROR-γt一抗（博奥森生物），兔源Foxp3一抗（proteintech），兔源GAPDH内参一抗（华安生物），Tris（西亚试剂），甘氨酸（上海生工生物），SDS（BBI lifesciences），HRP标记山羊抗兔IgG二抗、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）、蛋白裂解液、青霉素-链霉素溶液（100×）（碧云天生物），TEMED（Amersham Pharmacia Biotech），30%丙烯酰胺溶液（上海懋康生物），介素-10（IL-10）、介素-17（IL-17）、介素-21（IL-21）、α-肿瘤坏死因子（TNF-α） ELISA试剂盒（上海酶联生物），胎牛血清（Gibco），细胞刺激混合物（加蛋白转运抑制剂）（500×）、Foxp3/转录因子流式固定破膜缓冲液、CD45单克隆抗体（OX1），PerCP-eFluor™ 710、CD3单克隆抗体（G 4.18），FITC、CD4单克隆抗体（OX35），APC、IL-17A单克隆抗体（eBio17B7），eFluor™ 450、CD25 单克隆抗体（OX39），Super Bright™ 436、Foxp3 单克隆抗体 （FJK-16s），PE（eBioscience）。

1.4 动物模型建立

CFA诱导的大鼠佐剂性关节炎模型（RA模型）建立：参照文献方法^［9-11］进行模型制备，25只雄性SD大鼠，于右后足趾皮内注射CFA 0.1 mL。

WCDA大鼠模型建立：参照文献方法^［12-15］采用多因素复合造模法进行模型制备，25只SD雄性大鼠右后足趾注射CFA（0.1 mL），CFA注射24 h后，对大鼠进行5~7 ℃冷水浴（水深2 cm）+风速10 m/s刺激，每日刺激20 min，连续刺激14 d。

1.5 分组与给药

造模结束后，依据关节肿胀度将造模成功的RA大鼠及风寒湿痹证大鼠分别分为模型对照组、SJF治疗组，每组各10只，剩余造模大鼠淘汰；另外选取10只正常大鼠作为正常对照组。药物组大鼠灌胃给予相应药物，剂量选用前期研究有效剂量生药6.16 g/kg^{［9， 10］}，给药体积为1 mL/100 g，给药1次/d，连续给药14 d。

1.6 样本收集

血液样本：末次给药后，大鼠按0.5 mL/100 g腹腔注射0.9%戊巴比妥钠（45 mg/kg）麻醉后，腹主动脉取血。一部分血液静置1.5 h后，3000 r/min离心15 min，随后吸取上清液，并将其在-80 ℃条件下保存，备用，用于ELISA法检测血清细胞因子；一部分血液肝素抗凝，流式细胞仪检测血T细胞亚群Th17、Treg细胞的比例。

组织样本：将取血后大鼠解剖，取大鼠病变侧踝关节。每组随机取7只大鼠踝关节置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，以备后续HE染色观察；每组剩余3只大鼠无菌状态剖取踝关节滑膜组织，-80 ℃条件下保存，备用。

脾细胞悬液：将取血后大鼠用酒精消毒后，在无菌条件下取出脾脏，并用5 mL注射器橡胶头在滤网上研磨脾脏成细胞悬液，待用。

1.7 指标检测

1.7.1 体质量及一般情况

造模及给药期间持续观察大鼠体质量、精神、毛色光泽等变化并记录。

1.7.2 足肿胀度

在造模前、造模后及末次给药后，用足肿胀仪检测大鼠足肿胀度。

1.7.3 血清炎症因子检测

取上述保存的血清样本，根据ELISA试剂盒说明书，检测血清炎症因子IL-10、IL-17、IL-21、TNF-α等含量。

1.7.4 流式细胞技术检测外周血及脾脏Th17和Treg细胞比例

每组随机选取3只大鼠的上述外周血、脾细胞悬液，制备外周血及脾脏淋巴细胞悬液，离心沉淀细胞。

Th17检测：向细胞沉淀中加入200 μL细胞刺激混合物，重悬细胞，于37 ℃活化5~18 h。活化后，PBS洗涤细胞，离心弃上清，每管加入100 μL PBS重悬细胞，再分别加入1 μL CD45、CD3、CD4流式抗体，同时设置空白对照管（空白管同样经历后续固定破膜步骤），避光室温孵育30 min，PBS洗涤后离心沉淀细胞。向细胞沉淀中加入500 μL固定破膜工作液，重悬细胞，于4 ℃避光孵育60 min，随后加入500 μL破膜剂洗涤细胞。弃上清，用100 μL破膜剂重悬细胞，加入IL-17A抗体，避光孵育30 min，PBS洗涤细胞。离心（1000 r/min，4 ℃，5 min），弃上清，加100 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。门控策略：单个细胞→CD45阳性→CD3阳性&CD4阳性→IL-17A阳性。Th17比例为占CD4+T细胞的比例。

Treg检测：向细胞沉淀中加入CD45、CD3、CD4、CD25流式抗体，同时设置空白对照管，避光室温孵育30 min后，PBS洗涤细胞。向细胞混悬液中加入500 μL固定破膜工作液，4 ℃避光孵育60 min，加入500 μL破膜剂洗涤细胞。弃上清，用100 μL破膜剂重悬细胞，加入Foxp3抗体，避光孵育30 min，PBS洗涤细胞。离心（1000 r/min，4 ℃，5 min），弃上清，加100 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。门控策略：单个细胞→CD45阳性→CD3阳性&CD4阳性→CD25阳性&Foxp3阳性。Treg比例为占CD4⁺T细胞的比例。

补偿设置：进行染色实验时，同时设置空白对照、单阳管、FMO对照。上机检测时通过单阳管进行荧光补偿。

1.7.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测滑膜组织RORγt和 Foxp3 mRNA表达量

将-80 ℃保存的滑膜组织剪碎，研磨后加入RNA iso试剂裂解，取裂解上清液加入氯仿，混合至乳化，静置5 min，12 000×g、4 ℃离心 15 min。取上清液提取总RNA。将RNA反转录后进行PCR反应、扩增，条件为95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。2^-△△Ct法计算相对表达量：ΔCt=目的基因平均Ct-内参基因平均Ct，ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt，实验组与对照组相对表达量=2^-ΔΔCt。扩增效率是通过QPCR标准曲线计算得出的。内参和目的基因引物由成都有康健兴生物科技有限公司合成（表1）。

1.7.6 Western blotting法检测滑膜组织RORγt和Foxp3蛋白表达水平

将-80 ℃保存的滑膜组织样本剪碎，加入RIPA裂解液匀浆20次。匀浆液12 000 r/min、4 ℃离心5 min，取上清用于后续实验操作。BCA法测定蛋白浓度。制胶后上样，电泳、转膜、洗膜，加入封闭液室温封闭1 h。一抗（1∶1000）孵育过夜，洗膜3次，二抗（1∶1000）孵育1 h，洗膜4次。ECL曝光液覆膜2 min后曝光检测蛋白。采用Tanon图像系统检测条带灰度值，采用目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值进行归一化，并以正常对照组均值为1计算相对表达量。

1.7.7 关节病理组织学观察

将4%多聚甲醛溶液固定48 h后的踝关节转入Schridde脱钙液中，常温下脱钙24 h，脱钙完成后进行常规脱水，石蜡包埋，并制作切片（厚度4 μm），HE染色后，采用OLYMPUS BX51生物学显微镜及病理组织图象分析系统观察关节滑膜增生及炎症程度，并进行半定量评分。评分标准为：踝关节组织结构正常，未见明显病理变化记0分；踝关节周围结缔组织灶性区域少量单核细胞浸润和纤维组织增生记1分；踝关节周围结缔组织局部区域较多单核细胞浸润和纤维组织增生记2分；踝关节周围结缔组织大片区域大量单核细胞浸润和纤维组织增生记3分。

1.8 统计学分析

采用GraphPad 8.0软件对各时间点实验数据分别进行分析，数据满足正态分布和方差齐性，以均数±标准差来表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量及一般情况

正常对照组大鼠活动、饮食等情况均正常；RA模型组大鼠活动减少，毛发欠光泽；风寒湿痹模型组大鼠活动明显减少，毛发欠光泽，同时可见溏软便。给药干预后，RA模型组及风寒湿痹模型组大鼠上述表现明显改善。

各组大鼠经随机分组，造模前体质量差异均无统计学意义。造模成功后给药前，RA模型组、风寒湿痹模型组大鼠体质量显著低于正常对照组，其中风寒湿痹模型组大鼠体质量降低最明显。给药后第7、14 d，各治疗给药组大鼠体质量较同批次模型组均有不同程度升高，有一定的恢复趋势（表2）。

2.2 足肿胀度

造模前，各组大鼠的足肿胀程度保持基本一致，未见明显差异。造模后，RA模型组和风寒湿痹模型组大鼠足肿胀程度显著增加，表明造模成功。给药14 d后，药物组大鼠的足肿胀程度相较于模型组有明显降低（表3）。

2.3 血清炎症因子水平

与正常对照组相比，RA模型组、风寒湿痹模型组大鼠血清中的IL-17、IL-21、TNF-α含量显著升高，而IL-10含量明显降低。给药后，松节方显著降低模型大鼠血清中IL-17、IL-21、TNF-α等促炎因子的水平，同时提高抗炎因子IL-10的表达（表4）。

2.4 SJF对外周血及脾脏Th17细胞及Treg细胞比例的影响

与正常对照组比较，RA模型组、风寒湿痹模型组大鼠外周血及脾脏Th17细胞百分比显著上调，而Treg细胞百分比下调。给药后，松节方组大鼠外周血及脾脏Th17细胞百分比显著下调，Treg细胞百分比上调（图1、2）。

2.5 滑膜组织RORγt、Foxp3 mRNA相对表达量

与正常对照组相比，RA模型组、风寒湿痹模型组大鼠Foxp3 mRNA的相对表达量显著降低，而RORγt mRNA的相对表达量则显著升高；与RA模型组比较，风寒湿痹模型组大鼠Foxp3 mRNA的相对表达量升高，而RORγt mRNA的相对表达量降低。给药后，与模型组比较，药物组大鼠Foxp3 mRNA相对表达量显著升高，RORγt mRNA相对表达量均显著降低；与RA+SJF比较，WCDA+SJF组大鼠RORγt mRNA相对表达量降低更为明显（图3）。

2.6 滑膜组织RORγt、Foxp3 蛋白表达水平

相较于正常对照组，RA模型组、风寒湿痹模型组大鼠滑膜组织中的Foxp3蛋白表达均明显降低，而RORγt蛋白表达则明显升高；与RA模型组比较，风寒湿痹模型组大鼠Foxp3 蛋白表达量升高，而RORγt 蛋白表达量降低。给药后，与模型组比较，药物组中的Foxp3蛋白表达量显著上升，而RORγt蛋白的表达量则明显下降；与RA+SJF比较，WCDA+SJF组大鼠RORγt 蛋白表达量降低更为明显（P<0.01，图4）。

2.7 踝关节病理组织学检查

病理组织学观察显示（表5、图5），正常大鼠踝关节组织光滑，无细胞浸润和组织增生现象；RA模型组和风寒湿痹模型组造模踝关节周围结缔组织均出现明显的单核细胞浸润和纤维组织增生现象。给药后，给药组显著减轻模型大鼠关节滑膜炎症和纤维组织增生，组织形态和结构得以部分恢复，组织半定量评分明显降低，呈现出对造模引起的踝关节病理损伤的显著改善效果。

3 讨论

风湿性疾病以关节滑膜慢性炎症为核心病理特征，主要表现为滑膜细胞异常增殖、血管翳形成及炎性细胞的浸润^［16-18］，其发病机制与淋巴细胞免疫失调及炎症因子网络紊乱密切相关^［19-22］。Th17 细胞与调节性 T 细胞（Treg细胞）作为免疫系统关键调控亚群，通过分别分泌 IL-17、TNF-α 等促炎因子与 IL-10 等抗炎因子维持机体免疫稳态^［23-26］，二者功能平衡失调是类风湿关节炎（RA）等自身免疫性疾病发生发展的核心病理机制^{［19， 20， 25， 27］}。其中，转录因子 Foxp3 是维持 Treg 细胞免疫抑制功能的关键分子^［28］，而 RORγt 则特异性调控 Th17 细胞的分化成熟及炎症效应^{［28， 29］}；二者表达失衡可直接导致 Th17/Treg 细胞比率异常，破坏外周免疫耐受，最终推动疾病进展^{［26， 29-31］}。

本研究通过构建 RA 模型与WCDA模型并进行对比分析，初步探讨了两种模型在免疫炎症调控中的共性特征与特异性差异。结果显示，与正常对照组相比，两种模型均呈现显著的炎症表型：足肿胀程度明显加重，IL-17、TNF-α等炎症因子水平显著升高，且Th17/Treg 细胞比例失衡，其中WCDA模型指标变化与张逢等^［32］报道的“风寒湿”外邪可诱导 RORγt/Foxp3 mRNA 异常表达的结论一致，提示免疫失衡可能是两种风湿性疾病模型的重要病理环节之一。尽管两种模型在足肿胀程度、炎症因子水平上无统计学差异，但分子层面存在显著差异：WCDA模型中 RORγt mRNA及蛋白表达比值显著低于RA模型，Foxp3 mRNA及蛋白表达比值显著低于RA模型。这一特异性差异提示，风寒湿外邪的叠加可能通过影响RORγt转录活性与Foxp3表达之间的调控关系，进一步强化Th17细胞的促炎优势。该机制与中医“风寒湿三气杂至，合而为痹”的理论具有一定相关性，提示外邪侵袭并非完全等同于RA的炎症病理过程，其可能通过影响Th17/Treg平衡的分子机制参与免疫紊乱的调节。

松节方对两种模型的干预实验均显示出显著的抗炎活性与免疫调节作用。在抗炎层面，松节方可有效降低关节肿胀程度，调节IL-10、IL-17、IL-21、TNF-α等炎症因子水平，同时减轻滑膜组织炎性细胞浸润；在免疫调控层面，其可能的作用机制包括：一是调节免疫细胞亚群比例，表现为提高外周血及脾脏中Treg细胞百分比、降低Th17细胞比例，有助于恢复Th17/Treg平衡；二是影响关键转录因子的表达，表现为抑制滑膜组织中RORγt的转录活性（尤其在WCDA模型中，对RORγt的下调作用较为明显），并上调Foxp3的表达，从分子层面参与免疫调节网络的修复。病理组织学观察进一步显示，松节方可有效减轻关节滑膜单核细胞浸润及纤维组织增生，促进受损关节组织修复，其多靶点、多途径的作用特点与中药复方“整体调节”的理念一致，尤其对WCDA模型中由外邪刺激所伴随的免疫失衡表现出一定的针对性调控作用。

综合来看，松节方可能通过调节Th17/Treg平衡改善RA及风寒湿痹证模型大鼠关节炎症及病理损伤。然而，本研究尚存在一定局限：两种模型在RORγt/Foxp3表达层面的差异机制（如上游信号通路的异同）有待进一步验证；松节方针对“风寒湿痹”证候的特异性有效成分及作用靶点尚需通过成分-靶点网络分析、敲除/抑制实验等现代技术手段加以明确；本研究未设置阳性药物对照及正常动物给药对照，因此尚不能评价松节方相对于常规抗RA药物的疗效强度，也不能充分判断其对正常免疫状态的影响；复方的整体质量控制仍需进一步完善。后续研究将结合中医证候本质，深入探索环境因素（风寒湿）与宿主免疫调节网络的交互作用，为中药复方的精准应用提供更坚实的理论基础。

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