常氧/缺氧人脐静脉内皮细胞来源的外泌体对心肌损伤和成纤维活化的抑制作用及其机制

Effects of exosomes derived from normoxic or hypoxic human umbilical vein endothelial cells on hypoxia-induced cardiomyocyte injury and cardiac fibroblast activation in vitro

摘要

目的 探究人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在常氧和缺氧环境下产生的外泌体（N-exo和H-exo）对缺氧诱导的人心肌细胞AC16细胞损伤和大鼠心脏成纤维细胞 （RCFs）活化的作用和机制。 方法 缺氧培养24 h诱导AC16细胞损伤和RCFs活化。差速离心法和蔗糖密度梯度离心法提取HUVECs来源的外泌体，利用透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析技术、考马斯亮蓝染色和Western blotting检测外泌体标志蛋白对外泌体进行鉴定。分别设置对照组：AC16和RCFs正常培养；Hypoxia组：1% O₂培养24 h；N-exo/H-exo组：N-exo/H-exo干预24 h；Hypoxia+N-exo/H-exo组：缺氧培养同时加入外泌体干预；Western blotting法检测蛋白表达水平；RT-qPCR检测mRNA表达水平；荧光探针DCFH-DA检测AC16细胞内活性氧水平；TUNEL法检测AC16细胞凋亡；EDU法检测RCFs的增殖能力。 结果 N-exo和H-exo电镜下为典型的茶托型双层囊泡状；N-exo和H-exo的浓度分别为1.5×10⁹ mL^-1和7.2×10⁸ mL^-1；考马斯亮蓝染色显示HUVEC-exo具有丰富的蛋白谱；HUVECs-exo中可检测出外泌体标志性蛋白HSP70条带；与对照组相比，Hypoxia组AC16细胞中CK-MB的mRNA表达水平上升，缝隙连接蛋白43（Cx43）和谷胱甘肽过氧化酶4（GPX4）的mRNA表达水平下降，ALP、IL-1β和cTnT的蛋白表达水平上升，细胞中活性氧含量升高，细胞凋亡增加（P<0.05）；与Hypoxia组相比，10⁷ mL^-1 N-exo组CK-MB水平降低，Cx43和GPX4水平上升，ALP、IL-1β和cTnT水平下降，细胞中活性氧含量降低，细胞凋亡减少（P<0.05）；而H-exo的作用与N-exo相反（P<0.05）。与对照组相比，Hypoxia组RCFs细胞中I型胶原蛋白（Collagen I）、III型胶原蛋白（Collagen III）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达水平上升，增殖能力提高（P<0.05）；与Hypoxia组相比，10⁷ mL^-1的N-exo组上述指标均降低（P<0.05）；而H-exo的作用与N-exo相反（P<0.05）。与对照组相比，Hypoxia组的AC16和RCFs中的缺氧诱导因子1亚基α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）水平上升，蛋白激酶B（AKT）磷酸化水平上升（P<0.05）；而与Hypoxia组相比，N-exo组的上述指标下降（P<0.05），H-exo组的上述指标上升（P<0.05）；HIF-1α抑制剂Px-478对缺氧诱导的AC16细胞损伤和RCFs细胞活化有抑制作用（P<0.05）。 结论 常氧环境下HUVECs来源的外泌对缺氧诱导的AC16细胞损伤和RCFs活化有抑制作用，缺氧环境下HUVECs来源的外泌体则加重缺氧诱导的AC16细胞损伤和RCFs活化，该作用机制可能涉及HIF-1α信号通路。

Abstract

Objective To investigate the effects of exosomes derived from human umbilical venous endothelial cells (HUVECs) cultured in normoxic and hypoxic conditions (N-exo and H-exo, respectively) on hypoxia-induced injury of human cardiomyocyte AC16 cells and activation of rat cardiac fibroblasts (RCFs) in vitro. Methods N-exo and H-exo were extracted from HUVECs by differential centrifugation and sucrose density gradient centrifugation and characterized. AC16 cells and RCFs in normoxic culture or hypoxic culture (1% O₂ for 24 h) were treated with N-exo or H-exo, and the changes in protein and mRNA levels were examined with Western blotting and RT-qPCR. Intracellular ROS levels and apoptosis in AC16 cells were assessed by DCFH-DA staining and TUNEL staining, and the changes in proliferation of RCFs were evaluated with EdU assay. Results N-exo and H-exo with densities of 1.5×10⁹ and 7.2×10⁸ mL^-1 were obtained, respectively, which showed abundant protein components and expressed the exosomal marker HSP70. In AC16 cells, hypoxic exposure significantly upregulated CK-MB mRNA and downregulated Cx43 and GPX4 mRNA levels, causing also enhanced expressions of ALP, IL-1β and cTnT proteins and increased intracellular ROS content and cell apoptosis. These changes were effectively alleviated by treatment with 10⁷ mL^-1 N-exo but worsened after treatment with H-exo. In RCFs, hypoxia significantly increased the expressions of collagen I, collagen III and α‑SMA and cell proliferation, which were suppressed by N-exo treatment but further enhanced by H-exo treatment. Hypoxia exposure increased HIF-1α and VEGF expression and phosphorylation level of AKT in both AC16 cells and RCFs; N-exo obviously inhibited while H-exo further enhanced these changes. Px-478, a specific HIF-1α inhibitor, significantly inhibited hypoxia-induced AC16 cell injury and RCF activation. Conclusion N-exo derived from HUVECs inhibits while H-exo exacerbates hypoxia-induced AC16 cell injury and RCF activation possibly via the HIF-1α pathway.

Graphical abstract

关键词

人脐静脉内皮细胞 / 心脏成纤维细胞 / 心肌细胞 / 缺氧诱导因子

Key words

human umbilical vein endothelial cells / cardiac fibroblasts / cardiomyocyte / hypoxia-inducible factor

心血管疾病（CVD）在全球范围内带来了重大健康风险，每年导致至少1700万人死亡。随着人口老龄化问题的日益严重，心血管疾病患者的数量也在增长。其中缺血性心脏病已被确定为心血管疾病患者的主要死因^［1］。在CVD早期阶段，心肌细胞通过限制心肌病灶区域的扩展。但过度自噬会导致心肌细胞的自噬死亡。心肌细胞的凋亡会激活心脏成纤维细胞，产生胶原蛋白和纤维素。纤维状瘢痕通过维护心室结构完整性，防止心室壁破裂。但细胞外基质（ECM）蛋白和胶原蛋白在心肌中的过度沉积，扰乱心肌结构，致使心功能障碍，最终导致心力衰竭。因此，心肌细胞凋亡和心脏成纤维细胞活化的调控在心血管疾病的发展中起着关键作用^［2-6］。

心脏的主要细胞类型为心肌细胞、内皮细胞和心脏成纤维细胞，这些细胞通过直接接触或旁分泌等方式相互调节，共同维持心脏稳态。在心血管稳态的维持和病理性血管重塑过程中，细胞外囊泡（EVs）的分泌是细胞间通信的重要机制。EVs作为细胞间信使，可根据其大小、脂质成分或形成和释放机制分为外泌体、微囊泡和凋亡体。外泌体是最小的EVs，可以负载有许多功能性蛋白质、脂质和核酸，这些功能性物质介导细胞间通信，形成一种新型的细胞间通信方式^［7-10］。Tian 等^［11］的研究表明，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）来源外泌体中的miR-204-5p可抑制高脂诱导的血管平滑肌钙化。此外，外泌体具有生物相容性、生物屏障通透性、低毒性和低免疫原性等优点，使其成为心血管疾病治疗的一大热点。然而，并不是所有的外泌体组分都是有益的。Otani等^［12］的研究发现，正常血压大鼠（WKY）的血浆外泌体可以降低自发性高血压大鼠（SHR）的收缩压以及减轻血管纤维化，而SHR的血浆外泌体会升高WKY的收缩压以及促进血管纤维化。这些发现提示正常生理状态下和病理状态下产生的外泌体可能会产生截然不同的作用。本研究提取HUVECs在常氧条件培养和缺氧条件培养分泌的外泌体，分别作用于缺氧24h诱导的AC16和大鼠心脏成纤维细胞 （RCFs），初步探索HUVECs源性外泌体对缺氧诱导的AC16细胞损伤和RCFs细胞活化的作用及其机制，以期为缺血性心血管疾病的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 试剂

青霉素-链霉素溶液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、4% 多聚甲醛（白鲨）；细胞上清外泌体提取试剂盒（宇玫博）；AG RNAex Pro RNA提取试剂、RNA 提取辅助试剂、Evo M-MLV反转录预混型试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒（艾科瑞）；ECL发光液（赛默飞）；DMEM/F-12、TBS缓冲液、10%PAGE 胶快速制备试剂盒、RIPA裂解液（强）、蛋白酶抑制剂PMSF、磷酸化蛋白酶抑制剂、Prestained Protein Marker II （塞维尔）；5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲溶液、BSA Fraction V、BeyoClick™ EdU-488细胞增殖检测试剂盒、一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（碧云天）；脱脂奶粉（BD）；细胞计数板（Invitrogen）；Reactive Oxygen Species Assay Kit 活性氧（ROS）检测试剂盒（翌圣）。

1.2 细胞来源和培养

SD大鼠乳鼠购自广州锐格生物科技有限公司许可证号：SCXK（粤）2023-0059。乳鼠处死后取心脏，去除心耳、血管和肺组织等，II型胶原酶和胰酶37 ℃消化，终止消化后完全培养基重悬培养得到RCFs。HUVECs细胞购自武汉华尔纳公司（WN-10112），AC16细胞购自武汉普诺赛公司（CL-0790）。AC16和RCFs用含10%的胎牛血清和1%的双抗的DMEM培养基培养；用于培养细胞的培养箱需设定37 ℃恒温、5% CO₂浓度，缺氧培养时将培养基更换为无糖无血清的DMEM培养基，培养箱设置为5% CO₂浓度和1% O₂浓度。该研究通过深圳市荣湾生物医学实验动物中心动物伦理委员会审批（RW-IACUC-25-0093）。

1.3 Western blotting检测蛋白表达水平

经药物干预24 h后，6 cm细胞培养皿每皿加入 500 μL裂解液，细胞刮刀刮取细胞裂解液，于冰上裂解 30 min，期间每隔5~10 min进行吹打混匀；4 ℃离心收集上清液，BCA试剂盒检测各个样品的蛋白质浓度，并使用裂解液将样品调整至相同浓度，加入5×loading buffer 充分混匀后，100 ℃变性 10 min，随后置于-80℃ 冰箱保存。SDS-PAGE电泳每泳道上样量为10~15 μg。电泳结束后转膜至0.45 μm PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，一抗HSP70（1∶5000）、ALP（1∶2000）、p-IKBα（1∶5000）、IKBα（1∶5000）、IL-1β（1∶3000）、GAPDH （1∶10 000）Collagen I（1∶5000）、Collagen III（1∶1000）、α‑SMA（1∶5000）、p-AKT（1∶5000）、AKT（1∶5000）、VEGF（1∶5000）、HIF-1α（1∶2000），4 ℃孵育过夜，1∶10 000稀释二抗室温孵育1 h后显影成像。

1.4 RT-qPCR 检测mRNA水平

加药处理24 h后，预冷PBS洗涤细胞2次，提取细胞RNA，Nano Drop 对 RNA 进行定量，Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒进行反转录，产物 cDNA 应用 SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒对靶基因进行定量检测。使用GAPDH作为内参， mRNA表达量以2^-ΔΔCt 公式计算。引物（捷瑞生物）序列见表1。

1.5 细胞培养上清外泌体提取

正常培养的HUVECs弃去旧培养基，PBS洗涤3次，加入无外泌体培养基，常氧培养箱或缺氧培养箱培养24 h，收集培养基。4 ℃，3000×g离心10 min，保留上清，4 ℃，10 000×g离心10 min，收集上清，加入ECS试剂涡旋混匀后4 ℃静置过夜，4 ℃，10 000×g离心60 min，弃上清，PBS重悬沉淀，重悬的外泌体加入纯化柱中，4 ℃、3000×g离心10 min，即可得到纯化的HUVECs源性外泌体。

1.6 活性氧含量检测

加药处理24 h后，吸除诱导用药物，共聚焦皿每皿加1 mL DCFH-DA工作液，37 ℃细胞培养箱内避光孵育30 min，无血清培养液洗涤细胞2次，共聚焦显微镜观察并拍摄图像。

1.7 EDU细胞增殖检测

加药处理24 h后，PBS洗涤2次，共聚焦皿每皿加1 mL EDU工作液，37 ℃培养箱孵育2 h，PBS洗涤2次，4% PFA固定20 min，PBS洗涤2次，0.3% Triton X-100通透20 min，洗涤液洗涤2次，每皿加入0.5 mL Click反应液避光孵育30 min，洗涤液洗涤3次，用含DAPI的封片剂封片，共聚焦显微镜观察并拍摄图像。

1.8 TUNEL法检测细胞凋亡

加药处理24 h后，PBS洗涤2次，共聚焦皿每皿加1 mL 4%PFA室温固定30 min，PBS洗1次，加入0.3% Triton室温孵育10 min，PBS洗2次，每皿加50 μL TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗2次，用含DAPI的封片剂封片，共聚焦显微镜观察并拍摄图像。

1.9 统计学分析

实验数据以均数±标准差表示，用 GraphPad Prism 9.0进行数据可视化与统计分析。多组数据的差异，运用单因素方差分析进行对比分析，进一步两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。所有的实验都是独立重复3次。

2 结果

2.1 HUVECs源性外泌体的分离提纯与鉴定

从常氧培养的HUVECs和缺氧处理24 h的HUVECs培养上清中均提取到了外泌体，分别为N-exo和H-exo。TEM观测表面形貌，可见HUVECs源性外泌体呈典型的茶托型双层囊泡状；NTA检测粒径，显示HUVECs源性外泌体颗粒大小较为均一，集中在50~200 nm，N-exo和H-exo在形态学上无差异（图1A），N-exo和H-exo的浓度分别为1.5×10⁹ mL^-1和7.2×10⁸ mL^-1；通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，可视化HUVECs源性外泌体中蛋白质的组成及相对分子质量分布（图1B）；Western blotting法可检测出HUVECs源性外泌体中的外泌体标志性蛋白HSP70条带（图1C）。

2.2 HUVECs源性外泌体对缺氧环境下AC16细胞损伤的作用

qPCR结果显示，缺氧24 h可使AC16中Cx43和GPX4的mRNA表达量下降，CK-MB表达量上升（P<0.001，图2A）；与缺氧组相比，缺氧+N-exo的Cx43和 GPX4表达量上升，缺氧+H-exo的Cx43和GPX4表达量下降（P<0.05，图2A）；缺氧+N-exo的CK-MB表达量下降，缺氧+H-exo的CK-MB表达量增加（P<0.01，图2A），因此我们选择10⁷ mL^-1的N-exo和H-exo进行后续实验。Western blotting和活性氧检测结果显示，缺氧24 h可使AC16中ALP、cTnT和IL-1β的蛋白表达量上升，活性氧含量上升，细胞凋亡增加（P<0.05，图2B、C）；与缺氧组相比，缺氧+N-exo组的ALP、cTnT和IL-1β的蛋白表达量下降，活性氧含量下降，细胞凋亡减少（P<0.05，图2B、C）；缺氧+H-exo组的ALP、cTnT和IL-1β的蛋白表达量上升，活性氧含量上升，细胞凋亡增加（P<0.05，图2B、C）。

2.3 HUVECs源性外泌体对缺氧环境下RCFs活化的作用

qPCR和Western blotting结果显示，缺氧24 h可使RCFs中Col 3a1、Col 1a1和α-SMA的mRNA和蛋白表达量上升（P<0.001，图3A、B）；与缺氧组相比，缺氧+N-exo的Col 3a1、Col 1a1和α-SMA表达量下降（P<0.05，图3A、B）；缺氧+H-exo的Col 3a1、Col 1a1和α-SMA表达量增加（P<0.05，图3A、B），因此我们选择10⁷ mL^-1的N-exo和H-exo进行后续实验。EDU检测结果显示，缺氧24 h可使RCFs增殖能力提高（P<0.01，图3C）；与缺氧组相比，缺氧+N-exo组的增殖能力降低（P<0.05，图3C）；缺氧+H-exo组的增殖能力提高 （P<0.05，图3C）。

2.4 HUVEC源性外泌体对AC16和RCFs的作用可能涉及HIF-1α通路

Western blotting结果显示，缺氧24 h可使AC16和RCFs中HIF-1α和VEGF的蛋白表达量上升，AKT的磷酸化增加（P<0.05，图4）；与缺氧组相比，缺氧+N-exo组的AC16和RCFs中的HIF-1α和VEGF的蛋白表达量下降，AKT的磷酸化减少（P<0.05，图4）；缺氧+H-exo组的AC16和RCFs中的HIF-1α和VEGF的蛋白表达量上升，AKT的磷酸化增加（P<0.05，图4）。

2.5 HIF-1α抑制剂px-478对AC16和RCFs的作用

与缺氧组相比，缺氧+HIF-1α抑制剂组的AC16中ALP、cTnT、IL-1β和VEGF蛋白表达量减少， AKT的磷酸化减少，细胞中活性氧含量减少，细胞凋亡减少（P<0.05，图5）；RCFs中Collagen I、Collagen III、α-SMA和VEGF蛋白表达量减少，AKT的磷酸化减少，细胞增殖能力减弱（P<0.05，图6）。

3 讨论

心脏是一个复杂且重要的器官，不同类型心脏细胞之间的细胞间通讯和协调对于器官的完整性和正常功能至关重要，外泌体是这个过程中的重要信使，通过传递多种功能蛋白、脂质和核酸发挥重要作用^［13］。例如缺氧心肌细胞分泌的外泌体可通过携带的miRNA（miR-222和miR-143）促进内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，同时可通过miR-195和miR-208促进纤维化反应^［14］；M1型巨噬细胞来源的外泌体可抑制血管生成和成纤维细胞增殖^［15］，本研究提取了HUVECs在常氧环境和缺氧环境下产生的外泌体，分别作用于缺氧处理的AC16和RCFs。本研究实验结果表明，常氧环境下HUVECs分泌的外泌体N-exo可以降低缺氧处理的AC16中ALP、cTnT和IL-1β的蛋白表达水平，同时降低细胞中的活性氧水平，减少细胞凋亡，表明N-exo可以修复缺氧引起的AC16细胞损伤；相反地，缺氧环境下HUVECs分泌的外泌体H-exo加强缺氧引起的AC16细胞损伤。我们在RCFs中得到了相似的实验结果：N-exo降低缺氧处理的RCFs中Collagen I、Collagen III、α-SMA的蛋白表达水平，抑制增殖能力，从而抑制缺氧诱导的RCFs活化；H-exo则加重缺氧诱导的RCFs活化。

缺氧是心血管疾病中最重要的致病因素之一。HIF-1α是调控缺氧反应基因的转录因子，广泛表达于心血管疾病中，标志着动脉粥样硬化、肺动脉高压、心律失常、先天性心脏病、心力衰竭等多种心血管疾病的发生^［16-21］。有研究表明HIF-1α可通过上调下游基因VEGF增加心肌梗死小鼠模型的心血管密度，抑制心肌细胞凋亡，改善心脏功能^［22］，HIF-1α的表达增加在心肌缺血（如急性心肌梗塞）和缺血再灌注损伤中起保护作用^{［23，24］} ；尽管HIF-1α的表达发挥多种积极作用，但HIF-1α的过度表达也与炎症和氧化应激反应密切相关，甚至引起细胞凋亡和纤维化^［25-27］ ，如Wang等^［28］的研究表明，HIF-1α的过度表达会诱导p53依赖性细胞凋亡，进而导致心脏破裂；Sui 等^［29］发现缬沙坦可通过阻断HIF-1α通路抑制AngII诱导的心脏纤维化；Viswanadha 等^［30］发现胡椒碱通过抑制HIF-1α/VEGF通路减轻心肌梗死大鼠的炎症反应和心脏纤维化；Refaie等^［31］发现磷酸二酯酶1抑制剂长春西汀通过抑制HIF-1α/VEGF通路发挥抗凋亡、抗炎和抗氧化作用，从而抑制多柔比星诱导的心脏毒性。本研究实验结果表明，缺氧处理24 h后，AC16和RCFs中的HIF-1α和VEGF的表达水平增加，AKT的磷酸化增加，N-exo下调HIF-1α和VEGF的表达水平，降低AKT的磷酸化水平，而H-exo则相反，表明HUVECs来源的外泌体对AC16和RCFs的作用可能涉及HIF-1α通路。为了验证以上实验结果，本研究使用了HIF-1α的抑制剂px-478，实验结果表明HIF-1α抑制剂可增强N-exo对缺氧诱导的AC16细胞损伤的修复作用，拮抗H-exo对诱导的AC16细胞损伤的促进作用；HIF-1α抑制剂可增强N-exo对缺氧诱导的RCFs活化的抑制作用，拮抗H-exo对诱导的RCFs活化的促进作用。

本研究创新性地发现常氧培养和缺氧培养下HUVECs源性外泌体对AC16和RCFs的双重作用，但研究仍存在局限：本研究并未进行动物实验探究HUVECs源性外泌体对心肌梗死小鼠模型的作用。后续将在动物实验中验证HUVECs源性外泌体的作用，以期为心血管心血管疾病的治疗提供新思路。

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基金资助

广东省自然科学基金区域联合基金-地区培育项目(2023A1515140174)

广东省基础与应用基础研究基金(2026A1515010655)

深圳市科技计划项目(JCYJ20230807150802005)

深圳市科技计划项目(JCYJ20230807150803007)

深圳市盐田区卫生科技计划项目(YTWS20220209)

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