消核冲剂激活ASK1/MKK4/JNK通路促进乳腺上皮细胞凋亡改善大鼠乳腺增生分子机制

Xiaohe Granule improves breast hyperplasia in rats by promoting mammary epithelial cell apoptosis via activating the ASK1/MKK4/JNK signaling pathway

摘要

目的 探究中药复方消核冲剂（XHGs）通过调控ASK1/MKK4/JNK信号通路促进细胞凋亡改善乳腺增生机制。 方法 苯甲酸雌二醇（0.5 mg·kg^-1·d^-1）和孕酮（5 mg·kg^-1·d^-1）肌肉注射未孕雌性SD大鼠构建乳腺增生模型，设置分组：对照组、模型组、低、中、高剂量消核冲剂灌胃组、高剂量消核冲剂加GS-444217灌胃组。分组给药处理后，记录乳头高度、直径，子宫指数；HE染色观察乳腺结构变化；免疫组化染色检测Ki-67和caspase-3蛋白表达；TUNEL染色检测组织凋亡；ELISA检测血清中E2、P、PRL、FSH、IL-1β和TNF-α的表达；RT-qPCR和Western blotting检测ASK1/MKK4/JNK及凋亡相关蛋白表达。 结果 结果显示模型组较对照组，乳房直径和乳头高度及子宫指数增加（P<0.05）；乳腺组织腺泡明显增生、导管显著扩张及炎性细胞浸润明显增多；Ki-67表达增加，caspase-3降低（P<0.05）；细胞凋亡降低（P<0.01）；E2、P、PRL、FSH、IL-1β和TNF-α水平也显著升高；Bcl-2表达升高，caspase-3、Bax降低；p-ASK1/ASK1、p-MKK4/MKK4、p-JNK/JNK、caspase-3和Bax蛋白降低，Bcl-2蛋白表达升高（P<0.01）。而给予消核冲剂治疗后，逆转了各指标的变化，且呈现出浓度依赖性改善（P<0.01）。同时GS-444217和XHGs-H灌胃处理组相较于XHGs-H又逆转了XHGs的改善效果。 结论 XHGs通过激活ASK1/MKK4/JNK信号通路促进乳腺增生细胞凋亡改善大鼠乳腺增生。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Xiaohe Granule (XHG) for alleviating mammary hyperplasia in rats. Methods A non-pregnant female SD rat model of mammary hyperplasia was established by intramuscular injections of estradiol benzoate (0.5 mg/kg) and progesterone (5 mg/kg). With untreated rats as the control group, the rat models were treated with saline (model group) or low-, medium- or high-dose XHG daily gavage, or with high-dose XHG plus oral administration of GS-444217. After the treatments, nipple height, diameter, and uterine index of the rats were measured, and histological changes in the mammary tissue were observed with HE staining. The expressions of Ki-67 and caspase-3 protein in the mammary tissue were detected using immunohistochemistry, and mammary epithelial cell apoptosis was examined using TUNEL staining. Serum levels of E2, P, PRL, FSH, IL-1β, and TNF-α were detected using ELISA, and the expressions of ASK1/MKK4/JNK and apoptosis-related proteins were analyzed using RT-qPCR and Western blotting. Results Compared with the normal control rats, the rats in the model group showed significantly increased mammary diameter, nipple height, and uterine index with obvious acinar hyperplasia, ductal dilation, and inflammatory cell infiltration in the mammary tissue. The rat models also showed significantly increased Ki-67 expression and serum levels of E2, P, PRL, FSH, IL-1β and TNF-α, markedly increased Bcl-2 expression, and lowered protein levels of p-ASK1/ASK1, p-MKK4/MKK4, p-JNK/JNK, caspase-3, and Bax in the mammary tissue. Treatment with XHG significantly reversed these changes in a dose-dependent manner. Treatment with GS-444217 significantly attenuated the ameliorative effect of high-dose XHG on mammary hyperplasia in the rat models. Conclusion XHG alleviates mammary hyperplasia in rats by promoting apoptosis of hyperplastic mammary epithelial cells via activating the ASK1/MKK4/JNK signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

乳腺增生 / 消核冲剂 / 细胞凋亡 / ASK1/MKK4/JNK通路 / 雌激素 / 孕激素

Key words

mammary gland hyperplasia / Xiaohe Granule / cell apoptosis / ASK1/MKK4/JNK pathway / estrogen / progesterone

乳腺增生（MGH）是一种常见乳腺疾病，严重影响患者身心健康^［1］。或许由于现代生活节奏加快，加上职场压力和竞争加剧，导致该病发病率持续攀升^［2-4］。乳腺增生症是中年女性中最常见的疾病^［5］。越来越多的证据表明，MGH的进一步恶化与乳腺癌的发生密切相关^［6］。乳腺增生症的诱发受女性年龄、月经史、孕育史、哺乳史等因素的影响，好发于30~50岁的女性^［7］。不同程度的乳腺增生占所有女性乳腺疾病的70%~80%，患者常感到乳房胀痛、触痛，有时伴有肿块或结节，这些症状在月经前后尤为明显，乳腺增生已成为中年女性最常见的疾病，严重影响女性患者的身心健康^{［5， 8］}。乳腺增生症主要发病机理是雌二醇（E）和孕酮（P）分泌失衡，导致乳腺上皮细胞过度增殖和乳腺组织增生，是一种起源于乳腺发育和退化过程紊乱的良性疾病，临床常规治疗策略主要为内分泌治疗和手术^{［2， 9， 10］}。内分泌治疗通常包括使用激素调节药物来平衡体内雌激素和孕激素水平，而手术则多用于处理严重的病例或疑似恶性病变的情况，目前针对MGH的临床治疗既不精准也不完全有效，激素疗法或内分泌疗法常被用来短期缓解症状，但这些治疗手段副作用严重、并发症多，长期疗效也存疑^{［11， 12］}，局部手术治疗也未获多数患者认可，且容易引发复发性症状。相较于西医治疗，中药方剂在治疗中展现出独特优势^［13］。因此，许多患者不得不选择中医药疗法，并且在民众中普遍被认为安全有效。根据中医理论，MGH的主要发病机理是肝气郁结所致^［14］，痰血瘀阻冲任二脉，属“瘀”类证候^［15］，故中医治疗MGH常选用具有疏肝、理气、行瘀、止痛、调冲任功能的中药^［16］。早在中国古代就有相关记载和论述，中医药在治疗乳腺增生症领域有着悠久历史，其疗效与患者情绪、生活习惯等因素密切相关^［2］。现代临床研究表明，中药复方及其有效成分通过整体调理、多环节、多途径、多靶点协同作用，在治疗乳腺增生方面具有可靠疗效且毒性较低^{［13， 16］}。

细胞凋亡参与多种疾病的发生发展，如癌症、神经退行性疾病和自身免疫病等^［17］，与乳腺增生密切相关^［18］。细胞凋亡过程中的关键分子，如Fas/FasL和Bcl-2家族蛋白，在乳腺增生中扮演重要角色，Fas突变会导致自身免疫和恶性或良性淋巴增生^［19］，Bcl-2蛋白与原发性乳腺弥漫性大 B 细胞淋巴瘤密切相关^［20］。研究表明，乳腺增生的发生发展源于乳腺上皮细胞增殖增加和凋亡减少^［21］。Bcl-2蛋白作为Bcl-2原癌基因的编码产物，是一种抗凋亡基因，能够延长细胞存活时间、抑制细胞凋亡，并定位于线粒体、内质网及核周膜^{［22， 23］}。在大鼠增生性乳腺组织中，Bcl-2的过表达程度与增生程度密切相关^［24］。ASK1抑制剂GS-444217是一种口服、强效且具有选择性的小分子ASK1抑制剂^［25］。细胞凋亡信号通路调节激酶1（ASK1）/丝裂原活化蛋白激酶激酶（MKK4）/c-Jun氨基末端激酶（JNK）（ASK1/MKK4/JNK）通路的激活与细胞凋亡密切相关^［26］。因此，靶向ASK1/MKK4/JNK通路抑制凋亡可以作为治疗乳腺增生的潜在依据，并为临床治疗提供新的视角。

中药复方消核冲剂是安徽中医药大学第一附属医院院内复方制剂，在临床治疗乳腺增生有着良好的治疗效果，其主要成分由柴胡、当归、路路通、瓜蒌皮、白芥子、桃仁、白芍、青皮、合欢皮及夏枯草组成，具疏肝解郁、活血祛瘀、化痰散结、通络止痛，共奏解郁、补肾、调理冲任之功效^［27］；有助于肝脏对雌激素的灭活以及对内分泌紊乱的调节作用^［28］。尽管中药复方消核冲剂对治疗乳房疼痛和结节有一定效果，但其作用机制仍存在诸多未解之谜。因此，探索中药复方治疗乳腺增生症的机制研究一直是该领域研究的重点课题。该病的发病机制复杂，本文旨在对中药复方消核冲剂在治疗乳腺增生症的抑增殖，促凋亡方面作用机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雌性SD大鼠，7~8周龄，体质量200±20 g，由河南斯克贝斯生物科技股份有限公司提供，许可证号：SCXK（豫）2020-0005，大鼠饲养于温度为26±1 ℃、相对湿度为60%、清洁级动物实验室内，自由饮水进食，实验前适应性饲养7 d。

1.2 药物与试剂

消核冲剂由安徽中医药大学第一附属医院中药房提供（每剂组分：柴胡：6 g，当归：10 g，路路通：10 g，瓜蒌皮：12 g，白芥子：10 g，桃仁：10 g，白芍：10 g，青皮：10 g，合欢皮：12 g，夏枯草：15 g）；所有饮片均由安徽宏方药业有限公司提供，所有饮片均符合2020版《中国药典》标准。煎煮参照《中药汤剂煎煮技术规范》，最后合并2次滤液并浓缩至含2.0 g/mL生药的药液，分装后-20 ℃保存备用。苯甲酸雌二醇和孕酮（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；一抗ASK1、MKK4、JNK、p-JNK、Bax、caspase-3和β-actin（武汉三鹰生物公司），Bcl-2、p-MKK4和Ki-67、c-JUN、p-c-JUN、cleaved caspase-3（江苏亲科生物研究中心有限公司），p-ASK1（成都正能生物技术有限责任公司）；荧光TUNEL染色试剂盒（兰杰柯科技有限公司）；大鼠E2、P、FSH、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒均（武汉科鹿生物科技有限责任公司）。

1.3 仪器

JB-P5包埋机（武汉俊杰）；RM2016病理切片机（上海徕卡）；Labserv K3 touch全自动多功能酶标检测仪（Thermo）；SH-523化学发光成像系统（杭州申花）；LightCycler 480实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（罗氏）；T51491超微量分光光度计（IMPLEN）；H1650R冷冻离心机（湖南湘仪）。

1.4 动物造模与分组

选择雌性SD大鼠（未孕，体质量180~220 g），随机分为以下 6 组（n=10）：正常对照组（Control组）给予生理盐水灌胃，1次/d；模型组（Model组）通过肌肉注射苯甲酸雌二醇（0.5 mg·kg^-1·d^-1）连续25 d，后5 d肌肉注射孕酮（4 mg·kg^-1·d^-1）诱导乳腺增生^［29］，同时给予生理盐水灌胃，1次/d；按照人与大鼠体表面积换算公式，根据易维真等前期研究^［26］，设置消核冲剂低、中、高剂量组，消核冲剂低剂量组（XH-L）在模型诱导成功后，给与消核冲剂低剂量（0.5 g·kg^-1·d^-1）灌胃，1次/d；消核冲剂中剂量组（XH-M）在模型诱导成功后，给与消核冲剂中剂量（1 g·kg^-1·d^-1）灌胃，1次/d；消核冲剂高剂量组（XH-H）在模型诱导成功后，给与消核冲剂高剂量（2 g·kg^-1·d^-1）灌胃，1次/d；消核冲剂高剂量组（XH-H）+ASK1抑制剂组在模型诱导成功后，给与消核冲剂高剂量（2 g·kg^-1·d^-1）灌胃，1次/d；同时，ASK1抑制剂GS-444217，经口灌胃给药30 mg/kg，2次/d^{［30， 31］}；所有分组持续给药30 d，对照组及模型组予以灌胃等体积纯净水。实验第30 天，大鼠禁食12 h后，使用戊巴比妥钠（30 mg/kg，腹腔注射）进行麻醉，腹主动脉采血，离心收集血清，同时迅速取出双侧乳腺组织和子宫，随机取出3只进行4%多聚甲醛固定，剩余7只置于-80 ℃冰箱中冷冻，用于后期分子病理检测。本实验项目得到安徽中医药大学科技伦理委员会批准（伦理批号：AHUCM-rats-2025101）。

1.5 大鼠一般情况统计观察

统计测量乳头高度、直径，子宫指数：在实验第 30 天称量大鼠体质量及取出大鼠子宫组织称质量；测量大鼠乳头高度和直径；计算子宫指数=W子宫 （mg）/W体质量（g）。

1.6 HE染色

取材大鼠乳腺组织，用4%多聚甲醛固定24 h后，经梯度浓度乙醇和二甲苯脱水处理，随后包埋于石蜡中，最终切片制备约5 μm厚的石蜡切片，采用HE染色并用树脂封片。使用光学显微镜观察皮层组织学结构，观察腺泡增生、导管扩张及炎性细胞浸润。

1.7 免疫组化进行Ki-67和caspase-3染色

石蜡脱蜡及抗原修复后，使用5%山羊血清在室温下对石蜡切片进行20 min封闭处理。随后将切片于4 ℃条件下孵育一抗Ki-67（1∶100）和caspase-3（1∶300）过夜。接着在室温下用HRP聚合物显色30 min，次日置于暗处保存。最后用DAB混合液对切片进行5~10 min染色，使用显微镜进行拍照，使用Image J软件计算平均光密度。

1.8 TUNEL染色评估乳腺组织凋亡水平

石蜡切片后，首先使用梯度无水乙醇溶液脱水，然后在室温下用蛋白酶K孵育20 min，接着将TUNEL检测试剂应用于样品，而阴性对照则暴露于荧光标记溶液并在黑暗条件下孵育。洗涤后，将含有4'，6-二氨基-2-苯基吲哚的抗淬灭剂涂覆在板上以最小化荧光干扰。在荧光显微镜下观察图像。使用Image J软件计算阳性细胞率，TUNEL阳性率按照（阳性细胞数/总细胞数）×100%公式计算。

1.9 ELISA检测各组大鼠血清中E2、P、FSH、IL-1β、TNF-a表达差异

按照厂家试剂盒说明书步骤，ELISA检测E2、P、FSH、IL-1β、TNF-a。

1.10 Western blotting检测各组乳腺组织ASK1、p-ASK1、MKK4、p-MKK4、JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Bcl-2、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白表达水平差异

从冻存的7只大鼠乳腺组织中随机取出3个组织样本，提取总蛋白，各组取50 μg蛋白样本加入含有还原剂的上样缓冲液后，在沸水中煮沸8 min，使蛋白质变性并解开复杂的结构。然后进行SDS-PAGE电泳，通过聚丙烯酰胺凝胶将不同大小的蛋白质分离。接下来采用湿法转膜技术（恒定电流250 mA，持续70 min），将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。PVDF膜随后放入含有5%脱脂奶粉的封闭液中，在室温下封闭1 h，以减少非特异性结合。接着在4 ℃环境下，分别将一抗ASK1（1∶1000）、p-ASK1（1∶1000）、MKK4（1∶1000）、p-MKK4（1∶1000）、JNK（1∶3000）、p-JNK（1∶1000）、c-Jun（1∶1000）、p-c-Jun（1∶1000）、Bax（1∶8000）、Bcl-2（1∶500）、caspase-3（1∶1000）、cleaved caspase-3（1∶1000）、β-actin（1∶20 000）溶液覆盖在膜上，孵育过夜，确保抗体与目标蛋白充分结合。次日，用TBST缓冲液清洗膜以去除未结合的一抗。然后在室温条件下，加入二抗（1∶10 000）溶液孵育1 h，进一步增强信号强度。再次使用TBST缓冲液清洗膜，以去除多余的二抗。最后，以β-actin作为内参蛋白，利用化学发光试剂盒进行发光反应，并通过X光片显影，拍摄结果图像。随后使用ImageJ软件对这些条带进行灰度值定量分析，精确测量目标蛋白的表达水平。

1.11 Real time q-PCR检测各组大鼠乳腺组织Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA表达水平

从剩余的4只大鼠冻存的乳腺组织中随机取出3个组织样本，RNA提取试剂盒提取各组乳腺组织总RNA，质检合格（A₂₈₀/A₂₆₀=1.7~2.0）后，反转录产物-20 ℃保存，RT-qPCR扩增，安徽通用生物公司进行设计合成引物，2^－△△CT公式进行定量分析，引物序列见表1。

1.12 统计学分析

采用 SPSS 25.0 版本进行数据统计分析，实验数据用均数±标准差表示，采用Shapiro-Wilk检验数据正态性，随后进行单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey's t检验方差齐性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠体质量及子宫指数统计分析

对各组大鼠体质量及子宫质量统计分析显示，动物建模分组处理后，Model组较Control组，体质量明显降低，子宫指数显著升高（P<0.05）。XHGs灌胃治疗后，较Model组XHGs-L，XHGs-M及XHGs-H体质量变化无显著差异；子宫指数方面，XHGs-L，XHGs-M组和XHGs-H组均显著降低（P<0.05）。相较于XHGs-H组，XHGs-H+GS-444217组体质量变化无显著差异，子宫指数显著增高（P<0.05，图1）。

2.2 大鼠左右乳房高度，直径统计分析

大鼠左右乳房高度及直径测量统计分析表明，动物建模分组处理后，Model组较Control组，左右乳房高度及直径均明显升高（P<0.01）。XHGs灌胃治疗后，较模型组XHGs-L左侧乳房直径显著减小（P<0.05），左侧乳房高度无显著差异性；右侧乳房直径及高度均显著减小（P<0.05）；XHGs-M和XHGs-H较模型组左右侧乳房直径及高度均显著减小（P<0.05）。同时采用抑制剂GS-444217和XHGs-H灌胃处理又逆转了XHGs-H的改善效果，相较于XHGs-H组，XHGs-H+GS-444217左右侧乳房直径及高度均显著增高（P<0.05，图2）。

2.3 大鼠乳腺组织病理结果

大鼠乳腺组织HE结果显示，Model组较Control组，大鼠乳腺组织中腺泡数量显著增加，腺泡形态饱满且排列紧密。乳腺导管显著扩张，管腔内壁光滑，充满大量脱落的上皮细胞，这些细胞呈现出不规则的形状和大小，部分细胞核明显增大，显示出活跃的增殖状态。XHGs处理后，较Model组呈浓度依赖性的显著改善；相较于XHGs-H组，XHGs-H+GS-444217组逆转了XHGs-H的改善效果（图3）。

2.4 大鼠乳腺组织免疫组化染色

免疫组化染色结果显示，Model组较Control组，caspase-3表达显著降低，Ki67显著升高（P<0.01）；XHGs处理后，较Model组呈浓度依赖性的显著改善，caspase-3表达逐渐升高，Ki67逐渐降低（P<0.05）。XHGs-H+GS-444217组逆转了XHGs-H的改善效果（P<0.01，图4）。

2.5 TUNEL检测各组大鼠乳腺组织上皮细胞凋亡情况

TUNEL染色结果表明，Model组较Control组，大鼠乳腺组织中细胞凋亡率显著降低（P<0.01）。XHGs处理后，较Model组细胞凋亡率呈浓度依赖性的显著升高（P<0.01），XHGs-H+GS-444217组逆转了XHGs-H的改善效果，XHGs-H+GS-444217组相较于XHGs-H组细胞凋亡率显著降低（P<0.01，图5）。

2.6 Western blotting检测各组乳腺组织ASK1、p-ASK1、MKK4、p-MKK4、JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Bax、Bcl-2、caspase-3和cleaved caspase-3蛋白表达情况

Western blotting检测结果表明，Model组较Control组，大鼠乳腺组织中p-ASK1/ASK1，p-MKK4/MKK4，p-JNK/JNK，p-c-Jun/p-c-Jun，caspase-3，cleaved caspase-3及Bax指标蛋白水平相对表达量显著降低，Bcl-2相对表达量显著增加（P<0.05，P<0.01）。XHGs处理后，较Model组组织中p-ASK1/ASK1，p-MKK4/MKK4，p-JNK/JNK，p-c-Jun/p-c-Jun，caspase-3，cleaved caspase-3及Bax指标蛋白水平相对表达量呈浓度依赖性的显著升高，Bcl-2相对表达量呈浓度依赖性的显著降低（P<0.05，P<0.01）。XHGs-H+GS-444217组同样逆转了XHGs-H的改善效果，XHGs-H+GS-444217组相较于XHGs-H组，p-ASK1/ASK1，p-MKK4/MKK4，p-JNK/JNK，p-c-Jun/p-c-Jun，caspase-3，cleaved caspase-3及Bax指标蛋白水平相对表达量显著降低，Bcl-2相对表达量显著升高（P<0.01，图6）。

2.7 Real-time q-PCR检测各组大鼠乳腺组织caspase-3、Bcl-2、Bax核酸表达情况

Real-time q-PCR检测结果表明，Model组较Control组，大鼠乳腺组织中caspase-3和Bax指标mRNA水平相对表达量显著降低，Bcl-2相对表达量显著增加（P<0.01）。XHGs处理后，较Model组组织中caspase-3和Bax指标mRNA水平相对表达量呈浓度依赖性的显著升高，Bcl-2相对表达量呈浓度依赖性的显著降低（P<0.05，P<0.01）。XHGs-H+GS-444217组同样逆转了XHGs-H的改善效果，XHGs-H+GS-444217组相较于XHGs-H组，caspase-3和Bax指标mRNA水平相对表达量显著降低，Bcl-2相对表达量显著升高（P<0.01，图7）。

2.8 ELISA检测各组大鼠血清中相关指标表达情况

ELISA检测结果表明，较Control组，Model组各组大鼠血清中E2，P，FSH，TNF-a和IL-1β指标表达水平显著增加（P<0.01）。较Model组，XHGs处理后血清中E2，P，FSH，TNF-a和IL-1β指标表达水平XHGs-L无显著差异性，XHGs-M和XHGs-H呈浓度依赖性的显著降低（P<0.05，P<0.01）。XHGs-H+GS-444217组同样逆转了XHGs-H的改善效果，XHGs-H+GS-444217组相较于XHGs-H组，E2，P，FSH，TNF-a和IL-1β指标显著升高（P<0.05，P<0.01，图8）。

3 讨论

本研究通过大鼠模型评估了消核冲剂对MGH的影响。在给予消核冲剂灌胃后，多种血清中生化指标包括E2，P，FSH，TNF-a和IL-1β均出现显著降低，病理HE染色及免疫组化结果表明，病理形态明显改善，抑制了增殖相关蛋白Ki67的表达及促进了凋亡相关蛋白caspase3的表达，TUNEL也佐证了这一结果，另外ASK1/MKK4/JNK通路也被有效的激活，同时各种改善均与给药剂量呈浓度梯度依赖性。更有趣的是，在同时给予消核冲剂和ASK1抑制剂GS-444217灌胃后，逆转了单纯给与消核冲剂的改善效果。这些药效学研究结果为消核冲剂治疗MGH提供了有力支持。

细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡方式，对于维持组织内环境的稳定至关重要^{［32， 33］}。研究报道，乳腺增生与细胞凋亡水平的减少密切相关，乳腺成纤维细胞减少器官型 MCF7 衍生导管模型中的细胞凋亡同时诱导乳腺细胞增生^［34］。中医通过调控细胞凋亡治疗乳腺增生有着丰富经验，商陆总皂苷通过诱导细胞凋亡对乳腺增生大鼠起到抗增生作用^［21］，蒙药乳腺-I号通过CRYAB促进细胞凋亡对雌激素/黄体酮诱导的乳腺增生也有着较好的治疗效果^［18］。本研究也和前面研究结果一致，消核冲剂显著抑制了乳腺上皮细胞的增殖，促进了乳腺上皮细胞的凋亡，抑制了乳腺组织的增生。

ASK1/MKK4/JNK通路作为凋亡信号的主要通路之一，与乳腺增生患者的凋亡减少密切相关^［35］。当该信号通路被激活后，JNK被磷酸化并转位至细胞核内，它可以磷酸化多种转录因子，如c-Jun、ATF2等，从而激活下游与细胞凋亡相关的基因表达^{［36， 37］}。同时，激活的JNK还可以调控线粒体相关的凋亡途径^［38］。它还可以磷酸化Bcl - 2家族的成员，如Bax，使其从胞浆转位至线粒体膜上，导致线粒体膜通透性改变，释放细胞色素C（Cyt c）到胞浆中，进而激活caspase-9和caspase-3，引发内源性凋亡途径^［39-41］。同时JNK通路可通过调控AP-1等转录因子参与炎症反应，抑制通路过度激活可能减轻乳腺组织炎症微环境，间接缓解增生^{［42， 43］}。先前的研究报道了中药复方如消癥丸通过Raf/ERK/ELK通路发挥抗HMG的作用^［44］。通过本实验，我们检测到XHGs干预激活ASK1/MKK4/JNK信号通路后，乳腺上皮细胞的凋亡率明显升高，凋亡相关蛋白如Bax、caspase-3等的表达增加，而抗凋亡蛋白如Bcl - 2的表达降低。这些结果表明，激活ASK1/MKK4/JNK信号通路可以促进乳腺上皮细胞的凋亡，同时回复实验结果表明ASK1抑制剂GS-444217很明显的抑制了XHGs的改善效果。国内外研究表明，细胞内的信号通路激活或抑制往往受到多种内外因素的调控^［45-47］。ASK1是MAP3K家族的成员，它在静息状态下与硫氧还蛋白（Trx）结合而处于失活状态，当细胞受到氧化应激、内质网应激、钙超载等刺激时，Trx与ASK1解离，使得ASK1能够发生自身磷酸化而被激活^{［48， 49］}。激活的ASK1进一步磷酸化并激活下游的MKK4（丝裂原活化蛋白激酶激酶4）^［50］。MKK4属于MAP2K家族，它通过对JNK（c-Jun氨基末端激酶）的特定位点进行磷酸化修饰，使得JNK被激活^［26］。同时，研究结果表明激活的ASK1会触发细胞的凋亡反应，这也与其他课题组ASK1作为不同刺激诱导细胞死亡的调节因子的作用一致^{［26， 51］}。

研究结果表明，XHGs通过调控ASK1/MKK4/JNK信号通路抑制乳腺组织细胞增殖、促进细胞凋亡，显著缓解了乳腺增生的症状。同时，ASK1抑制剂抑制剂GS-444217逆转了XHGs的改善效果。基于本研究结果，针对乳腺增生患者仍需开展更多临床试验及细胞基础实验。本研究从ASK1/MKK4/JNK信号通路和细胞凋亡的角度出发，探讨乳腺增生的发病机制和治疗方法，在动物水平揭示了ASK1/MKK4/JNK信号通路在乳腺增生发病机制中的关键作用，为乳腺增生的发病机制理论提供新的突破。在实践方面，发现基于该信号通路的新型治疗靶点，为乳腺增生的治疗提供新的药物研发方向。同时，研究结果还可能为乳腺增生的早期诊断和预防提供新的方法和指导。当然，本文也存在一定的研究局限和不足，中药复方具有多成分、多靶点的作用特点，仅依赖单一通路验证难以全面阐释其整体机制，后续研究中将结合网络药理学及生物信息学方法，对消核冲剂中各药材的有效成分进行系统筛选，及其潜在作用靶点的富集，从系统层面揭示该复方治疗乳腺增生的多靶点协同机制，提升研究的整体严谨性和诠释力。

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基金资助

安徽省卫生健康委员会卫生健康科研项目(AHWJ2023A20096)

安徽医科大学第一附属医院临床研究启动计划项目(LCYJ2021YB008)

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