五子衍宗丸通过调控TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路抑制颗粒细胞凋亡改善卵巢储备功能减退

Wuzi Yanzong Pill ameliorates diminished ovarian reserve in mice by inhibiting granulosa cell apoptosis via the TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR pathway

摘要

目的 探讨五子衍宗丸对卵巢储备功能减退小鼠的治疗作用及潜在机制。 方法 利用雷公藤多苷建立卵巢储备功能减退小鼠模型，将雌性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、五子衍宗丸低剂量组（五子衍宗丸-L，1.82 g·kg^-1·d^-1）和五子衍宗丸高剂量组（五子衍宗丸-H，3.64 g·kg^-1·d^-1），8只/组，灌胃给药28 d。计算小鼠卵巢指数，通过ELISA检测激素水平，HE染色观察卵巢组织形态。利用RNA-seq筛选五子衍宗丸治疗卵巢储备功能减退的关键信号通路。结合网络药理学，使用多重数据库分析五子衍宗丸的潜在作用靶点与通路。通过免疫组化和Western blotting检测小鼠卵巢组织中TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路关键蛋白表达，TUNEL染色及Western blotting评估颗粒细胞（GCs）凋亡水平。此外，收集人GCs样本进行Western blotting，验证该通路在卵巢储备功能减退患者中的表达。 结果 与模型组相比，五子衍宗丸使卵巢指数恢复（P<0.05），抗缪勒管激素及雌二醇水平升高，卵泡刺激素降低（P<0.05），并改善卵巢组织形态，使GCs功能恢复，闭锁卵泡减少。RNA-seq显示PI3K/Akt通路在五子衍宗丸治疗后显著富集。网络药理学显示，TGF-β、PI3K-Akt及凋亡通路是五子衍宗丸潜在作用的关键通路。免疫组化及Western blotting提示五子衍宗丸上调卵巢组织TGF-β1、PI3K、Akt和mTOR蛋白表达（P<0.05），TUNEL染色及Western blotting表明五子衍宗丸抑制GCs凋亡（P<0.05）。卵巢储备功能减退患者GCs中TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达下调（P<0.05）。 结论 五子衍宗丸通过上调TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR信号通路，抑制GCs过度凋亡，从而改善卵巢储备功能。

Abstract

Objective To investigate the efficacy of Wuzi Yanzong Pill (WZYZP) for improving diminished ovarian reserve (DOR) in mice and explore the underlying mechanism. Methods Female C57BL/6J mice were randomly divided into control group, Tripterygium wilfordii polyglycoside-induced DOR model group, and two WZYZP groups treated with WZYZP at daily doses of 1.82 or 3.64 g/kg for 28 days (n=8). Ovarian index of the mice was calculated, hormone levels were detected with ELISA, and ovarian histopathological changes were observed using HE staining. RNA sequencing was performed to identify the key signaling pathways involved in WZYZP treatment for DOR. Network pharmacology analysis was used to predict the potential targets and pathways of WZYZP. Immunohistochemistry and Western blotting were used to detect ovarian expressions of the key proteins in the TGF‑β1/PI3K/Akt/mTOR pathway. Granulosa cell (GC) apoptosis levels were assessed with TUNEL staining and Western blotting. In addition, human GCs samples were collected from DOR patients for validating the expressions of the TGF‑β1/PI3K/Akt/mTOR pathway using Western blotting. Results In the mouse models of DOR, WZYZP treatment significantly improved the ovarian index, increased anti-Müllerian hormone (AMH) and estradiol (E₂) levels, decreased follicle stimulating hormone (FSH) level, alleviated ovarian pathologies, enhanced GC function, and reduced atretic follicles. RNA-seq revealed significant enrichment of the PI3K/Akt pathway after WZYZP treatment. Network pharmacology analysis suggested that the TGF‑β, PI3K‑Akt, and apoptosis pathways were the key pathways potentially targeted by WZYZP. WZYZP treatment significantly upregulated the expressions of TGF‑β1, PI3K, Akt, and mTOR in mouse ovarian tissues and inhibited GC apoptosis. Western blotting of human GCs further verified the down‑regulation of TGF‑β1/PI3K/Akt/mTOR pathway in DOR patients. Conclusion WZYZP improves ovarian reserve by upregulating the TGF‑β1/PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and inhibiting excessive apoptosis of GCs.

Graphical abstract

关键词

卵巢储备功能减退 / 五子衍宗丸 / 颗粒细胞 / 凋亡 / TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路

Key words

diminished ovarian reserve / Wuzi Yanzong Pill / granulosa cells / apoptosis / TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR pathway

卵巢储备功能减退（DOR）是一种以卵母细胞数量减少和质量下降为主要特征的生殖内分泌疾病，临床表现为生育能力降低、月经紊乱及性激素水平异常，严重影响女性生殖健康^［1］。其发病机制涉及年龄、医源性损伤、环境污染物、生活习惯、遗传等多种因素^［2］。DOR在不孕女性中发病率约为10%^［3］，且有年轻化趋势^［4］。若不及早干预，会进一步发展为早发性卵巢功能不全和卵巢早衰^{［5， 6］}。

现代医学多采用激素替代疗法、脱氢表雄酮和辅酶Q10等治疗DOR，但疗效有限，且长期使用存在风险^［7］。中医药在“肾主生殖”理论指导下，在改善卵巢功能方面显示出独特优势^［8］。五子衍宗丸（WZYZP）具有补肾填精、调节生殖功能等作用，被誉为“古今种子第一方”^［9］，常用于治疗男性生殖系统疾病^［10］。近年来，临床研究表明WZYZP及其化裁方治疗DOR疗效显著，能有效改善DOR患者的卵巢反应性和激素水平，促进卵泡发育成熟，提高卵母细胞质量^{［11， 12］}，但其作用机制尚不明确。

颗粒细胞（GCs）作为卵泡结构和功能的关键组成部分，参与调控卵泡发育及卵母细胞成熟^［13］。研究表明DOR致病的核心驱动因素是GCs过度凋亡，导致卵泡发育不良或闭锁^［14-16］。因此推测WZYZP可能通过抑制GCs过度凋亡，发挥改善卵巢储备的作用。

PI3K/Akt/mTOR通路在调控颗粒细胞增殖与凋亡中发挥核心作用，参与原始卵泡激活和发育^{［17，18］}。该通路的异常抑制导致的GCs凋亡和原始卵泡耗竭是DOR发生的关键环节^{［8， 19-22］}，而激活该通路能促进细胞增殖和存活^［23］。此外，转化生长因子-β1（TGF-β1）作为一类多效性细胞因子，不仅参与卵泡生长发育，还通过调控下游PI3K/Akt信号通路影响细胞增殖和凋亡^［24-26］。

本研究综合运用动物实验、RNA-seq、网络药理学及人GCs实验验证，系统论证了WZYZP通过调控TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制GCs过度凋亡，从而改善DOR，为WZYZP防治DOR的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

雷公藤多苷片（TWP，浙江得恩德制药股份有限公司）；生理盐水（万物生物科技有限公司）；五子衍宗丸（北京同仁堂股份有限公司）；4%多聚甲醛溶液（科隆化学品有限公司）；小鼠抗缪勒管激素（AMH）、卵泡刺激素（FSH）、雌二醇（E₂） ELISA试剂盒（Elabscience）；抗TGF-β1、PI3K、Akt、mTOR、BAX、Bcl-2、Caspase3、GAPDH、β-actin抗体（Cell Signaling Technology）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔/鼠IgG、BCA试剂盒、RIPA裂解缓冲液、TUNEL凋亡试剂盒、DAPI染色试剂（Beyotime）；ECL试剂盒（Biosharp）；PVDF膜（Millipore）；DAB、HE染色试剂盒（Servicebio）；酶标仪、离心机（Bio Tek）；电泳仪、转膜仪（Tanon）。

1.2 动物实验

1.2.1 药品制备

对于体质量60 kg的成年女性标准，WZYZP公认临床剂量为12 g/d，按体表面积换算得小鼠等效剂量为1.82 g·kg^-1·d^-1，据此设WZYZP低、高剂量组分别为1.82 g·kg^-1·d^-1和3.64 g·kg^-1·d^-1。TWP的公认临床剂量为1~1.5 mg·kg^-1·d^-1，根据文献研究，设定小鼠给药剂量为50 mg·kg^-1·d^{-1［27， 28］}。WZYZP和TWP均制备成混悬液。

1.2.2 实验动物及分组

32只SPF级C57BL/6J雌性小鼠，6~8周龄，体质量16~18 g［苏州斯贝福生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（苏）2022-0006］。实验经南京中医药大学附属医院伦理委员会批准（伦理批号：2024DW-060-01）。小鼠饲养于室温22~25 ℃、12 h光暗周期环境中，自由饮食饮水。按随机数字表法将小鼠分为对照组（CON）、模型组（DOR）、WZYZP低剂量组（WZYZP-L）和WZYZP高剂量组（WZYZP-H），8只/组。

1.2.3 DOR模型建立及给药

适应性喂养7 d后，DOR组、WZYZP-L组和WZYZP-H组小鼠每日灌胃TWP 50 mg·kg^-1·d^-1，持续14 d，以建立DOR模型。CON组每日灌胃等体积生理盐水。在TWP灌胃首日起，WZYZP-L和WZYZP-H组每日分别灌胃WZYZP 1.82 g·kg^-1·d^-1和3.64 g·kg^-1·d^-1，CON组和DOR组灌胃等体积生理盐水，持续28 d。实验结束后小鼠安乐死，采集血清和卵巢组织。

1.2.4 卵巢指数计算

去除卵巢脂肪和结缔组织后称质量，计算卵巢指数：卵巢指数（%）=卵巢湿质量（mg）/体质量（g）×100 %。

1.2.5 血清激素检测

使用ELISA试剂盒测量小鼠血清AMH、FSH和E₂水平。使用酶标仪测定吸光度A_{450 nm}，计算激素浓度。

1.2.6 卵巢HE染色

卵巢组织经4%多聚甲醛固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度6~7 μm，进行HE染色。

1.2.7 小鼠卵巢GCs的RNA测序（RNA-seq）

提取卵巢组织总RNA，进行分光光度纯度验证、浓度检测以及RNA完整性评估。使用mRNA富集方案制备测序文库并进行双端测序。原始测序数据过滤后获得干净读数，与参考基因组比对。使用DESeq R包鉴定差异表达基因（DEG），标准为Fold Change≥2且P<0.05。对DEGs进行GO分类和KEGG富集分析。

1.2.8 网络药理学

WZYZP由枸杞子、菟丝子、覆盆子、车前子、五味子组成，在TCMSP、TCMID、BATMAN等数据库中依次检索。活性成分的筛选标准为口服生物利用度（OB）≥30%以及类药性（DL）≥0.18。利用Uniprot数据库对靶点基因名称标准化并去重，得到药物活性成分及作用靶点。从GeneCards和OMIM数据库获取DOR相关靶点，汇总后去重得到DOR疾病靶点。使用Venny在线工具绘制WZYZP和DOR靶点交集的韦恩图。采用Cytoscape软件构建“药物-成分-靶点-疾病”网络。通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。使用R clusterProfiler包对交集靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，以P<0.05为筛选条件进行可视化分析。

1.2.9 免疫组织化学

卵巢组织切片脱蜡、水化，柠檬酸盐缓冲液中高温抗原修复，3%过氧化氢溶液孵育。BSA封闭后分别与一抗TGF-β1、PI3K、Akt （1∶1000）及辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（1∶100）孵育。DAB显色，苏木精复染，乙醇脱水、二甲苯透明后封片。在光学显微镜下观察，每张切片随机采集6个视野的图像（×200，×400），阳性表达为棕黄色，采用Image J提取图片阳性平均光密度值，GraphPad Prism绘制柱状图。

1.2.10 Western blotting

使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液提取卵巢组织总蛋白。经SDS-PAGE凝胶分离后转移至PVDF膜，与一抗TGF-β1、PI3K、Akt、mTOR、Caspase3、BAX、Bcl-2、GAPDH、β-actin （1∶1000） 4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（1∶1000）孵育后显影曝光。

1.2.11 TUNEL染色

切片脱蜡、水化，蛋白酶K处理，加入现配的TdT和dUTP酶反应混合液孵育。DAPI复染，滴加荧光封片液，在显微镜下观察。

1.3 人颗粒细胞Western blotting

随机选取2022年9月~2023年12月在南京中医药大学附属医院生殖医学中心行IVF/ICSI的DOR患者和对照患者各3例，取卵时收集GCs。本研究经南京中医药大学附属医院伦理委员会批准（伦理批号：2022NL-200-03）。所有参与者均签署知情同意书。提取GCs总蛋白，SDS-PAGE凝胶分离后转移至PVDF膜，与一抗TGF-β1、PI3K、Akt、mTOR、Caspase3、BAX、Bcl-2、GAPDH、β-actin （1∶1000） 4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（1∶1000）孵育后显影曝光。

1.4 统计学分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 8.0软件通过Student's t检验和单因素方差分析等方法进行评估。计量资料表示为均数±标准差。P<0.05为差异有统计学意义。所有实验均独立重复3次。实验流程示意图采用BioGDP.com绘制^［29］。

2 结果

2.1 WZYZP恢复DOR小鼠的卵巢指数、激素水平及组织形态学改变

通过TWP构建DOR小鼠模型并予WZYZP治疗（图1A）。与CON组相比，DOR组卵巢指数降低（P<0.05），WZYZP低、高剂量组卵巢指数较DOR组升高（P<0.05，P<0.01，图1B）。

ELISA检测显示，DOR组AMH及E₂水平显著低于CON组（P<0.001），FSH显著升高（P<0.001）。与DOR组相比，WZYZP-L组AMH及E₂升高（P<0.05），FSH降低（P<0.05），WZYZP-H组AMH及E₂水平升高（P<0.001、P<0.01），FSH降低（P<0.001，图1C~E）。

HE染色显示，CON组小鼠卵巢结构正常，各级卵泡发育良好，卵母细胞形态饱满，GCs呈多层致密排列。与对照组相比，DOR组卵巢体积缩小，生长卵泡和成熟卵泡数量减少，卵母细胞萎缩，GCs出现排列无序和层数减少等凋亡改变，闭锁卵泡占比增加。WZYZP治疗后，卵巢体积增大，生长卵泡和成熟卵泡数量增加，卵母细胞形态饱满，GCs排列紧密有序、层数增多，闭锁卵泡减少（图1F）。

2.2 RNA-seq提示PI3K/Akt通路为WZYZP治疗DOR的核心通路

对小鼠卵巢组织进行RNA-seq分析，与DOR组相比，WZYZP处理后共鉴定出603个DEGs，包括414个上调基因和189个下调基因（图2A、B）。GO分类分析表明DEGs主要富集于细胞过程、单细胞生物过程、代谢过程等生物学过程，细胞器、细胞膜等细胞组分，以及结合、催化活性、信号转导活性等分子功能（图2C）。KEGG通路富集分析提示PI3K/Akt通路为最显著富集的通路（图2D）。

2.3 网络药理学分析WZYZP治疗DOR的机制

通过检索数据库，并剔除重复的成分及靶点后，共得到99个活性成分和969个药物靶点。在数据库中检索DOR靶点，去重后得到1311个靶点。将药物靶点和疾病靶点取交集后得到313个共同靶点（图3A）。

利用Cytoscape构建“药物-成分-靶点-疾病”网络（图3B），包含412个节点和2893条边，节点代表成分和靶点，边代表成分与靶点之间的靶向关系。该网络图可见93个活性成分作用于313个靶点。通过STRING数据库构建PPI网络，鉴定出IL6、AKT1、TP53、EGFR、IL1B、TNF等核心靶点（图3C）。

对交集靶点进行GO功能富集分析，生物学过程主要涉及TGF-β1生成调控、PI3K/PKB信号传导及凋亡信号通路的调控等；分子功能主要包括TGF-β受体结合、PI3K结合等（图3D）。KEGG共富集到208条信号通路，关键靶点显著富集于TGF-β信号通路、PI3K-Akt信号通路、mTOR信号通路及细胞凋亡等（图3E）。

2.4 WZYZP上调TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路

免疫组化显示，TGF-β1、PI3K、Akt集中在颗粒细胞及卵母细胞的细胞质和细胞核中（图4A）。与对照组相比，DOR组GCs中TGF-β1、PI3K、Akt表达降低（P<0.05）。与DOR组相比，WZYZP-L组PI3K、Akt表达量升高（P<0.05），TGF-β1略有升高，但差异无统计学意义（P>0.05），WZYZP-H组TGF-β1、PI3K、Akt表达量均显著升高（P<0.01，图4B~D）。

Western blotting表明，与对照组相比，DOR组TGF-β1、PI3K、Akt、mTOR表达均下降（P<0.05）。与DOR组相比，WZYZP-L组TGF-β1、Akt、mTOR表达量升高（P<0.05），PI3K升高不显著（P>0.05），WZYZP-H组TGF-β1、PI3K、Akt、mTOR表达量均显著升高（P<0.01，图5）。

2.5 WZYZP抑制DOR小鼠颗粒细胞凋亡

TUNEL染色显示，DOR组GCs凋亡率显著高于对照组（P<0.001），WZYZP低、高剂量组GCs凋亡率显著低于DOR组（P<0.001，图6A、B）。

Western blotting检测凋亡相关蛋白显示，与对照组相比，DOR组促凋亡蛋白Caspase3、BAX表达量升高（P<0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2下降（P<0.05）。与DOR组相比，WZYZP-L组Caspase3、BAX表达下降（P<0.05），Bcl-2表达上升（P<0.05），WZYZP-H组Caspase3、BAX表达量下降（P<0.05），Bcl-2显著升高（P<0.001，图6C~F）。

2.6 DOR患者GCs中TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路下调及凋亡水平升高

与对照组相比，DOR组患者GCs中TGF-β1、PI3K、Akt、mTOR、Bcl-2表达量均显著下降（P<0.01），Caspase3、BAX表达量显著升高（P<0.001，图7）。

3 讨论

DOR作为一种复杂的生殖内分泌疾病，严重影响女性生育能力及内分泌平衡^［30］。现代医学仍以激素替代等疗法为主，难以从根本上逆转卵巢功能的衰退趋势^［31］。而中医药具有多成分、多靶点、整体调节等特点^［32］，能够通过调控不同通路改善DOR，有效调节患者激素水平，缓解临床症状，改善妊娠结局^{［33， 34］}。

中医认为DOR属于“闭经”“不孕”等范畴，其根本病机在于肾精亏虚，冲任失调^［35］。WZYZP作为补肾填精的经典名方，方中菟丝子温补肾阳，枸杞子滋补肾阴，二者阴阳双补，共为君药；覆盆子、五味子补肾涩精，共为臣药；车前子利水渗湿，平衡全方温补之性，为佐药。诸药相配，补中寓泻，补而不腻，共奏益肾填精、调理冲任之效^［9］。目前，已有临床研究证实WZYZP对DOR有改善作用^［36］。

研究表明，TWP通过加速原始卵泡激活和增加闭锁卵泡，以及改变GCs凋亡机制，引发卵巢损伤，导致DOR的发生^［19］。因此，TWP的生殖毒性可用于诱导DOR小鼠模型。本研究采用50 mg·kg^-1·d^-1的TWP建立DOR小鼠模型。TWP处理后，小鼠AMH和E₂水平降低，FSH升高。AMH由生长卵泡的GCs分泌，能准确反映窦卵泡池的大小，是卵巢储备最可靠的标志物之一^［37］。AMH水平降低，表明GCs功能受损，卵巢储备减少。高度异常的FSH对DOR有特异性，也是DOR的可靠预测指标，且FSH升高可刺激GCs分泌E₂，导致E₂水平升高^［38］。经WZYZP干预，DOR小鼠卵巢指数升高，激素水平和卵巢组织结构恢复，GCs层数增多，闭锁卵泡减少，证明WZYZP可以减轻TWP诱导的卵巢毒性，保护GCs，改善DOR小鼠的卵巢功能。

本研究通过转录组学分析，将PI3K/Akt通路鉴定为WZYZP干预后最显著富集的信号通路。PI3K/Akt/mTOR通路在细胞增殖、凋亡、DNA修复和蛋白质合成等过程中起关键作用，广泛分布于卵巢组织中，参与调控GCs凋亡、原始卵泡募集、卵母细胞成熟^{［39， 40］}。随后，通过网络药理学分析了WZYZP的潜在作用靶点与通路，发现TGF-β通路、PI3K-Akt通路及凋亡是其主要涉及的通路，说明WZYZP通过调控该通路抑制GCs过度凋亡，改善DOR。作为卵泡微环境中的关键细胞因子，TGF-β1在卵母细胞和GCs中广泛存在，可以通过调节GCs的增殖和凋亡来影响卵泡发育^［41］。PI3K/Akt/mTOR作为TGF-β1的下游通路已被广泛报道^［42］，TGF-β1能通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有效抑制细胞凋亡和自噬能力^{［43， 44］}。本研究通过免疫组化和Western blotting检测了TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路在小鼠卵巢中的表达水平，结果表明该通路在DOR小鼠卵巢中下调，WZYZP干预后上调，证实WZYZP通过该通路发挥作用。

GCs在卵母细胞发育和成熟中起关键作用，GCs异常凋亡会导致卵泡丢失^［45］。DOR状态下，卵巢GCs凋亡被过度激活^［46］。Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调控因子，通过促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白Bcl-2发挥作用，BAX通过与Bcl-2形成异二聚体来抑制其功能，Bcl-2和BAX之间的动态平衡是调控细胞凋亡和存活的关键^［47］。Bcl-2抑制细胞色素c的释放和Caspase-3的激活。作为细胞凋亡执行阶段的关键蛋白，Caspase-3直接反映细胞凋亡的程度^［48］。通过分析TUNEL染色和凋亡相关蛋白表达，发现DOR小鼠卵巢中Caspase3、BAX表达量升高，Bcl-2表达减少，凋亡水平升高，WZYZP干预后Caspase3、BAX表达量降低，Bcl-2表达减少，说明WZYZP能有效抑制GCs凋亡，保证营养物质和信号分子正常分泌，进而改善卵巢功能。

本研究还通过人GCs实验验证了TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路对DOR的关键作用。Western blotting结果显示DOR患者GCs中该通路的关键蛋白及抗凋亡蛋白表达均显著下调，促凋亡蛋白显著上调，表明DOR患者GCs中该通路下调，GCs过度凋亡。这不但与小鼠模型中的发现相互印证，还将动物实验的结论直接与人类DOR联系起来，极大地增强了本研究发现的临床相关性与转化潜力。

本研究仍存在一定局限，如DOR小鼠模型虽被广泛应用，但难以完全模拟人类DOR的复杂病因，未检测TGF-β1等关键分子的mRNA表达水平，未使用特异性抑制剂验证TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路在WZYZP作用中的必要性等，这些问题将在后续研究中进一步探索。

综上所述，本研究系统阐明了WZYZP通过调控TGF-β1/PI3K/Akt/mTOR通路，抑制GCs过度凋亡，有效改善DOR的分子机制。这些发现不仅支持WZYZP的临床推广应用，也为中医药在生殖医学领域的现代化研究提供了新的思路和实验依据。

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基金资助

国家自然科学基金(82474567)

国家自然科学基金(82074479)

江苏省自然科学基金(BK20251964)

宜兴市“陶都之光”科技攻关计划项目(2023SF12)

江苏省前沿技术研发计划（卫生健康领域）项目(BF2025618)

2025年度江苏省中医院院级课题(Y25004)

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