CDKN3高表达促进胃癌细胞的迁移和侵袭：基于调控p53/NF-κB信号通路和抑制胃癌细胞凋亡

High expression of CDKN3 promotes migration and invasion of gastric cancer cells by regulating the p53/NF-κB signaling pathway and inhibiting cell apoptosis

摘要

目的 探究周期蛋白依赖性激酶抑制因子3（CDKN3）在胃癌中的表达情况，并分析其影响胃癌患者预后的潜在作用机制。 方法 纳入114例胃癌患者资料，分析CDKN3在胃癌组织中表达水平及其对胃癌患者术后5年生存率的影响；GO及KEGG富集分析预测CDKN3的生物学功能及可能的作用机制；通过慢病毒转染技术干预CDKN3的表达。采用Transwell、CCK-8、TUNEL染色、流式细胞术及Western blotting验证生物学功能。 结果 CDKN3在胃癌组织的表达水平显著高于癌旁组织（P<0.01），且CDKN3的表达水平与CEA、CA19-9、T分期及N分期相关（P<0.05）。单因素联合多因素分析显示，CDKN3高表达是影响胃癌患者术后5年生存率的独立风险因子（P<0.05）且CDKN3高表达对胃癌患者远期预后具有预判价值（P<0.01）。生物信息学富集分析提示CDKN3的功能可能与凋亡有关。Transwell实验结果显示，下调CDKN3可抑制胃癌细胞迁移、侵袭，上调则反之（P<0.01）。TUNEL染色结果显示，癌旁组织中细胞凋亡水平高于胃癌组织（P<0.01）。CCK-8和流式结果显示，降低CDKN3表达可抑制胃癌细胞的增殖，升高胃癌细胞凋亡率（P<0.05）。Western blotting结果显示过表达CDKN3后，p53、p21和促凋亡蛋白Bax表达降低，p-p65和抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高（P<0.05）。 结论 CDKN3在胃癌组织中高表达并影响患者预后，其可能通过p53/NF-κB信号通路调控胃癌细胞凋亡并抑制其增殖、侵袭与迁移有关。

Abstract

Objective To investigate the expression of CDKN3 in gastric cancer and its impact on prognosis of gastric cancer patients. Methods We analyzed CDKN3 expression in clinical specimens from 114 gastric cancer patients and assessed its association with 5-year postoperative survival of the patients. GO and KEGG enrichment analyses were used to predict the biological function and possible mechanism of CDKN3. The effects of lentivirus-mediated CDKN3 knockdown on biological behaviors of gastric cancer cells were evaluated using Transwell assay, CCK-8 assay, TUNEL staining, flow cytometry, and Western blotting. Results CDKN3 expression was significantly higher in gastric cancer tissues than in the adjacent tissues with significant correlations with CEA level, CA19-9 level, and T and N staging (P<0.05). High CDKN3 expression was an independent risk factor affecting 5-year postoperative survival of the patients and predictive for long-term prognosis (P<0.01). Enrichment analyses suggested a probable association of CDKN3 with apoptosis. In MGC-803 cells, CDKN3 knockdown significantly lowered migration and invasion capacities of the cells, while CDKN3 overexpression produced the opposite effects. TUNEL staining revealed a significantly lower level of cell apoptosis in gastric cancer tissues than in adjacent tissues (P<0.01). CDKN3 knockdown obviously inhibited proliferation and increased apoptosis of MGC-803 cells. CDKN3 overexpression down-regulated the expressions of p53, p21 and Bax and up-regulated the expressions of p-p65 and Bcl-2. Conclusion CDKN3 is highly expressed in gastric cancer tissues and affects patient prognosis. CDKN3 overexpression promotes proliferation, invasion and migration and suppressed apoptosis of gastric cancer cells possibly through the p53/NF-κB signaling pathway.

Graphical abstract

关键词

胃癌 / CDKN3 / 凋亡 / 增殖 / 预后 / p53/NF-κB

Key words

gastric cancer / CDKN3 / apoptosis / proliferation / prognosis / p53/NF-κB

胃癌是起源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，是我国消化道中最常见的恶性肿瘤之一^{［1， 2］}，具有高度侵袭性、转移性和预后差等特点^［3］。据最新数据显示，胃癌死亡率居恶性肿瘤第3位且呈逐年增长的趋势，严重危害人类健康^［4］。虽然放化疗联合手术治疗已大范围应用于胃癌，提高了胃癌的诊疗水平，但患者术后5年生存率目前仍然处于较低水平。研究表明肿瘤细胞的迁移、侵袭等恶性行为是影响胃癌复发转移的关键因素，且受到一系列分子信号的严格调控，对该领域的进一步探究有望为胃癌的临床靶向治疗提供新策略。周期蛋白依赖性激酶抑制因子3（CDKN3）属于双特异性蛋白磷酸酶家族，在调节细胞分裂中发挥关键作用^［5］。研究表明，CDKN3参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡^{［6， 7］}，在多种类型的恶性肿瘤中表达异常，被认为是一个独立的预后因子^{［8， 9］}。有研究发现，CDKN3的过表达与直肠癌、肾癌等多种实体瘤的增殖密切相关，并影响患者的远期预后^［10-12］。然而，CDKN3在胃癌中的表达情况及其影响胃癌患者病情发展和预后的潜在分子机制和作用途径尚未有相关文献报道。

本研究利用本机构临床患者病历资料明确CDKN3在胃癌组织中的表达对患者远期生存的影响，并采用GEO和DAVID公共数据库预测其影响预后的潜在机制，并结合体外实验进行验证，旨在为胃癌患者远期预后和临床诊疗靶点的选择提供新的参考。

1 资料和方法

1.1 研究对象和资料

选取2015年1月~2017年12月在我院接受胃癌根治术的患者。纳入标准：确诊为原发性胃癌；临床病历和病理资料完整；术后随访数据完整。排除标准：合并其他恶性肿瘤、死于胃癌以外的其他因素的患者；术前接受放疗或化疗的患者。经患者知情同意后，本研究共纳入患者114例，并通过本院电子病历系统收集患者如下信息：性别、年龄、术前外周血癌胚抗原（CEA）、糖类抗原19-9（CA19-9）和手术病理诊断等临床信息；术后通过电话随访获取患者术后5年生存情况。胃癌和配对癌旁组织（选择距离癌灶边缘5 cm以上的组织样本）的病理蜡块由我院病理科提供。本研究获得我院伦理委员会的批准（伦科批字［2021］第204号）。

1.2 主要试剂与仪器

胃癌细胞株（MGC803）购于国家生物医学实验细胞资源库；兔抗CDKN3多克隆抗体、兔抗Bcl-2、Bax、 p53、p21、p65、p-p65多克隆抗体（Cell Signaling Technology），兔抗β-actin单克隆抗体（Abcam），二抗（HRP标记山羊抗兔/鼠IgG聚合物），胎牛血清、RPMI 1640培养基、0.25%胰酶（Gibco），SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（biosharp），底物显色试剂（MerckMillipore），TUNEL检测试剂盒（碧云天），细胞凋亡检测试剂盒（贝博生物），特异性过表达和干扰CDKN3基因的慢病毒载体及对照空载质粒（上海吉玛基因），流式细胞仪（贝克曼）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化检测CDKN3在胃癌组织中的表达情况 将胃癌患者手术病理蜡块制成4 μm厚度的切片，置于60 ℃烘箱中烤片2 h，脱蜡水化及抗原修复后阻断内源性过氧化物酶，血清封闭后将切片孵育在一抗CDKN3（1∶1000）及酶标二抗（1∶2000）中，DAB 显色 10 min后封片并于显微镜下观察并采集图片，Image-J软件分析CDKN3积分光密度值。

1.3.2 细胞转染及分组

常规培养MGC803细胞至细胞达到对数生长期后，分别将对照空载体、干扰CDKN3载体和过表达CDKN3载体转染至MGC803细胞中，并使用嘌呤霉素筛选出稳定表达的细胞株用于后续实验，采用Western blotting验证转染效果（实验分组：Control，Si-CDKN3，LVCDKN3）。

1.3.3 Transwell实验检测CDKN3对胃癌细胞迁移和侵袭的影响

侵袭实验：Transwell小室上层加入30 µL基质胶，于37 ℃培养4 h使基质胶凝固，将转染成功的MGC803细胞（1×10⁴）加入Transwell上室，下室加入600 µL完全培养基常规培养24 h，棉签擦去上层残留细胞，下层细胞经4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色后，于显微镜下观察并拍照。同法进行迁移实验但小室上层不加基质胶。

--引用第三方内容--

1.3.4 生物信息学预测CDKN3调控胃癌的途径和机制 通过GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库获取CDKN3在胃癌组织中的表达文件，以|log2（FC）|>1，P<0.05为筛选条件选取前50的差异基因，接着通过DAVID进行基因本体注释（GO）功能富集分析（P<0.05）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）信号通路富集分析（P<0.05），以预测CDKN3调控胃癌细胞可能的功能学途径和信号机制。

1.3.5 TUNEL染色检测胃癌及癌旁组织凋亡情况

将胃癌患者手术病理蜡块制成4 μm厚度的切片，置于60 ℃烘箱中烤片2 h脱蜡后依次加入20 μg/mL不含 DNase蛋白酶 K和3%过氧化氢各孵育15 min、20 min，再依次加入生物素标记液和Streptavidin-HRP工作液各孵育60 min、30 min。DAB显色10 min后于显微镜下观察并采集图片。

1.3.6 CCK-8法检测CDKN3对胃癌细胞增殖的影响

按照设计好的实验分组将转染成功的MGC803细胞以2×10³/孔的密度接种于96孔板中，常规培养24、48、72 h时，每孔加入10 µL CCK-8试剂，孵育3 h后酶标仪检测450nm处吸光度值。

1.3.7 流式细胞术检测凋亡

按照设计好的实验分组将转染成功的MGC803细胞以2×10⁵/孔的密度接种于6孔板中，24 h后收集细胞1500 r/min离心8 min，PBS清洗细胞两次后依次加入400 µL Binding Buffer，1 µL Annexin V-FITC重悬，混匀后4 ℃、避光孵育15 min，加入2 µL PI，混匀后继续4 ℃、避光孵育5 min，最后使用300目纱网将样品过滤至流式管中，1 h内检测，并使用Flowjo软件进行分析。

1.3.8 Western blotting法检测蛋白表达

提取MGC803细胞总蛋白后BCA法定量，按预先设计好的实验方案上样、电泳，再经转膜、封闭后，孵育一抗CDKN3、Bax、Bcl-2、p53、p21、p65、p-p65（1∶1000）、β-actin（1∶1000），4 ℃摇床孵育过夜；洗膜后孵育二抗，经凝胶成像仪拍照后使用ImageJ软件进行分析。

1.4 统计学分析

统计学分析使用SPSS 26.0软件，计量资料以均数 ±标准差表示，计数资料以率表示，两组比较采用t检验和χ²检验；通过K-M曲线对患者术后5年生存率进行比较；利用单因素和多因素Cox回归分析明确影响胃癌患者术后5年生存率的独立风险因素；采用受试者工作曲线（ROC）评估CDKN3预测胃癌患者术后5年生存率的诊断价值；胃癌细胞中CDKN3表达水平、细胞迁移、增殖能力及通路相关蛋白表达水平、细胞凋亡率的比较使用单因素方差分析，实验至少重复3次，P<0.05表明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDKN3在胃癌组织中高表达

免疫组织化学染色结果发现，CDKN3主要定位于癌细胞胞质中，且胃癌组织中CDKN3的表达高于癌旁组织（P<0.01，图1）。

2.2 CDKN3高表达参与肿瘤恶性进展

分析结果显示，CDKN3高表达组患者CA19-9≥37 kU/L、CEA≥5 μg/L、T分期（T₃~T₄）及N分期（N₂~N₃）的比例显著高于CDKN3低表达组（P<0.01，表1）。进一步相关性分析结果表明，胃癌组织中CDKN3相对表达量与患者外周血肿瘤标志物CA19-9（r=0.617，P< 0.001）和CEA（r=0.569，P<0.001）均存在正相关关系（图2）。

2.3 CDKN3在胃癌中高表达影响患者远期预后

K-M生存曲线结果显示，CDKN3高表达组患者术后5年生存率低于CDKN3低表达组（P<0.001，图3）。

2.4 CDKN3高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素

单因素及多因素分析结果表明，CDKN3高表达、 CEA≥5 μg/L、CA19-9≥37 kU/L、T_3-4期、N_2-3期是影响胃癌患者术后5年生存率的独立危险因素（P<0.05，表2）。

2.5 CDKN3高表达可预测患者术后5年生存期

ROC分析结果表明，以CDKN3相对表达量3.34为截点值，CDKN3预测胃癌患者术后5年死亡的敏感性为75.00%，特异性为74.14%，曲线下面积为0.783（P<0.001，图4）。

2.6 CDKN3促进胃癌细胞的迁移和侵袭

Western blotting结果显示胃癌细胞MGC803慢病毒转染成功（P<0.05，图5A、B）。Transwell结果显示，下调CDKN3可抑制MGC803细胞的迁移和侵袭，上调CDKN3则反之（P<0.01，图5C~E）。

2.7 GO和KEGG富集分析预测CDKN3的作用途径和机制

KEGG通路富集分析发现：CDKN3可能通过抑制胃癌细胞凋亡和p53信号通路参与胃癌的发生与发展（图6A）。GO富集分析发现：CDKN3可能与T、B细胞稳态等功能相关（图6B）。

2.8 癌旁组织中细胞凋亡水平显著高于胃癌组织

TUNEL染色实验结果显示，与胃癌组织相比，癌旁组织中细胞凋亡水平升高（P<0.01，图7）。

2.9 CDKN3抑制胃癌细胞凋亡并促进其增殖

流式细胞术结果表明，与Control组相比，下调CDKN3可显著增加胃癌细胞凋亡率，上调CDKN3后则反之（P<0.01，图8A、B）；Western blotting实验结果证实，敲低CDKN3可显著增加促凋亡蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，过表达CDKN3则反之（P<0.01，图8C、D）；CCK-8结果显示，过表达CDKN3促进胃癌细胞增殖，敲低CDKN3则反之（P<0.05，图8E）。

2.10 CDKN3通过p53/NF-κB信号通路调控胃癌细胞凋亡并影响其增殖

Western blotting结果显示，与Control组相比， CDKN3过表达抑制胃癌细胞中p53蛋白和p21蛋白表达，促进p-p65蛋白的表达，敲低则反之（P<0.05，图9）。

3 讨论

本研究发现CDKN3在胃癌组织中高表达，并影响胃癌发病进程和患者术后5年生存率，同时揭示了CDKN3对胃癌细胞迁移、侵袭、增殖的作用可能与调控胃癌细胞凋亡有关。有研究表明，癌细胞可通过异常增殖活化参与恶性肿瘤的发生与发展，且这一生物过程受到多种因素调控^［13］。对该领域的进一步探索有望为临床患者预后评估、胃癌的临床诊疗提供新的依据。CDKN3，作为双特异性蛋白磷酸酶家族的一员，其在调控细胞分裂周期与进程方面展现出了核心功能^［14］，以往研究发现，该因子不仅参与正常细胞的周期调控，更在肿瘤细胞的生长增殖、侵袭性行为及细胞凋亡的调控中扮演了至关重要的角色，其在直肠癌、肾癌等恶性肿瘤中表达异常，被认为是一个独立的预后因子，与肿瘤的恶性发展密切相关^［15-17］，这一发现为肿瘤治疗策略的开发提供了新的视角和潜在靶点，对肿瘤的靶向治疗具有重大意义，既往研究表明，胃癌的恶性进展可通过多种途径导致胃癌患者的不良预后，但CDKN3在胃癌中的表达情况及其影响胃癌患者疾病进展和预后的潜在作用机制尚未见报道。

本研究通过对纳入胃癌患者的临床数据分析发现，与癌旁组织相比，CDKN3在胃癌组织中的表达水平显著升高，同时与外周血CEA、CA19-9水平，T分期和N分期等临床病理参数存在正相关关系。K-M生存曲线结果提示，CDKN3高表达可作为独立危险因素对胃癌患者术后远期预后不良产生影响，此外，ROC 分析结果显示CDKN3对胃癌患者术后5年生存率具有较好的预后评估价值，以上结果提示我们CDKN3在胃癌中高表达且影响患者预后，但其在胃癌细胞中的具体调控机制尚不明确。

越来越多的研究表明胃癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学行为与胃癌的进一步恶化密切相关^［18-20］，而CDKN3参与多种恶性肿瘤的增殖和侵袭。为了探究CDKN3与胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的关系，我们采用慢病毒介导的基因转染技术，对CDKN3的表达量进行了调控，CCK-8实验表明下调CDKN3降低了胃癌细胞的增殖能力。我们采用Transwell小室迁移与侵袭实验，结果显示，CDKN3表达水平的降低同样导致了胃癌细胞迁移与侵袭能力的显著抑制，从而进一步证实了CDKN3在胃癌细胞恶性行为调控中的关键作用。

为探究CDKN3在胃癌细胞迁移和侵袭能力中的潜在作用机制，我们通过生物信息学分析发现CDKN3作用于胃癌细胞可能与细胞凋亡和p53信号通路有关^{［21， 22］}。既往研究揭示了肿瘤细胞的标志性特征，即其失控的增殖能力及对细胞凋亡的逃逸能力，后者为机体抵御肿瘤侵袭的关键防线^{［23， 24］}。细胞凋亡是一种高度调控的程序性细胞死亡方式，其过程被划分为内源性与外源性两大凋亡途径^{［25， 26］}。具体而言，内源性凋亡途径的核心调控机制涉及Bcl-2蛋白家族成员的相互作用，而外源性凋亡途径则主要依赖于外部信号触发的死亡受体。这两条途径均通过引发一系列级联反应激活半胱氨酸蛋白酶，实现细胞的程序性死亡^［27-30］。p53蛋白在癌细胞中的激活不仅可以促进细胞周期阻滞和DNA损伤修复，还可以促进细胞外源性和内源性凋亡，启动Bax、Bcl-2、p21等多个基因表达，从而促进肿瘤细胞凋亡^［31］。为了探究CDKN3与胃癌细胞凋亡和p53信号通路的关系，我们通过流式细胞术检测成功转染后的胃癌细胞，并采用Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。通过流式细胞术和Western blotting观察到下调CDKN3可显著增加胃癌细胞凋亡率，同时调控促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调CDKN3可降低p53和p21的表达。核因子-κB（NF-κB）是转录因子家族的成员之一，与免疫、癌症和炎症息息相关^［32］。NF-κB信号通路在肿瘤的发生和发展中扮演着重要角色，参与细胞的增殖、迁移与侵袭。研究报道，活化的NF-κB可诱导p53磷酸化和乙酰化，同时二者可以互相影响干预肿瘤细胞。Western blotting结果显示，过表达CDKN3增加p-p65的蛋白表达水平，激活了胃癌细胞中磷酸化NF-κB信号通路^［33］。以上实验结果提示，下调CDKN3抑制胃癌细胞迁移和侵袭能力并影响其凋亡的潜在作用机制可能与p53/NF-κB信号通路有关。

本研究尚存在一些不足之处。首先本研究仅采集114例胃癌患者，因研究样本量相对较少，后期需要扩大样本量对所得结果加以验证，进一步明确CDKN3在胃癌发展中的作用。此外，细胞凋亡的作用机制较为复杂，尽管本研究证实了CDKN3可能通过调控胃癌细胞凋亡来抑制胃癌细胞迁移和侵袭能力，但其他潜在机制有待进一步探究。

综上所述，本研究揭示了CDKN3在胃癌组织中高表达，且其表达水平与多个反映胃癌恶性进展的关键临床病理参数呈现正相关性关系。进一步分析表明，CDKN3高表达可能通过p53/NF-κB信号通路调控胃癌细胞的凋亡机制，进而对胃癌细胞的迁移与侵袭能力产生影响，这一发现为研究CDKN3在胃癌进展过程中的潜在作用提供了新的视角，拓展了对CDKN3生物学功能的认识，并提示其可能是影响胃癌患者远期预后的重要因素，有望为胃癌的临床诊疗提供新的靶点。

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