剪接因子HNRNPH1通过调控Circ-MYOCD的反向剪接影响心肌肥厚的发生

The splicing factor HNRNPH1 regulates Circ-MYOCD back-splicing to modulate the course of cardiac hypertrophy

摘要

目的 探索Circ-MYOCD的反向剪接机制及该分子的反向剪接是如何调控心肌肥厚的发生的。 方法 Sanger测序和RNase R实验验证Circ-MYOCD的呈环性和稳定性，核质分提确定Circ-MYOCD的分布情况。生物信息学分析及pull-down的质谱结果分析预测与Circ-MYOCD结合的RNA结合蛋白（RBPs）。敲低心肌细胞中HNRNPH1和HNRNPL筛选可能影响到Circ-MYOCD反向剪接的RBPs，过表达HNRNPH1确定影响Circ-MYOCD反向剪接的RBPs。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导建立大鼠心肌肥大模型，检测HNRNPH1在肥大心肌细胞中的表达情况。敲低和过表达心肌细胞中HNRNPH1检测其对心肌肥厚进程的影响。在大鼠心肌肥大细胞模型中敲低HNRNPH1的表达，检测HNRNPH1对 Circ-MYOCD反向剪接的影响及对心肌肥厚进程的影响。 结果 Sanger测序结果显示，接头引物可以扩增出正确的Circ-MYOCD的序列；RNase R实验和核质分提实验结果显示Circ-MYOCD具有稳定性且主要分布在细胞质中（P<0.001）。生物信息学分析及Circ-MYOCD的pull-down的质谱结果分析显示HNRNPH1和HNRNPL是与Circ-MYOCD结合的RBPs。敲低和过表达心肌细胞中RBPs，检测Circ-MYOCD与MYOCD的表达情况，结果显示HNRNPH1影响且抑制Circ-MYOCD的反向剪接（P<0.01，P<0.05）。AngⅡ诱导建立小鼠心肌肥大模型中，检测到HNRNPH1的表达升高（P<0.001）。过表达HNRNPH1可以增加心肌肥厚标志物分子ANP、BNP的表达（P<0.05），敲低的结果与之相反（P<0.05，P<0.001）。在肥大的心肌细胞中敲低HNRNPH1后，Circ-MYOCD表达升高（P<0.001），MYOCD的表达降低（P<0.01）；检测心肌肥大相关分子ANP、BNP的表达均降低（P<0.05，P<0.001）。讨论 Circ-MYOCD的反向剪接受剪接因子HNRNPH1的调控进而影响了心肌肥厚的进程。

Abstract

Objective To explore the mechanism of Circ-MYOCD back-splicing and its regulatory role in myocardial hypertrophy. Methods Sanger sequencing and RNase R assays were performed to verify the circularity and stability of Circ-MYOCD, whose subcellular distribution was determined by nuclear-cytoplasmic fractionation. Bioinformatics analysis and mass spectrometry from pull-down assays were conducted to predict the RNA-binding proteins (RBPs) interacting with Circ-MYOCD. In rat cardiomyocytes H9C2 cells, the effects of HNRNPH1 and HNRNPL knockdown and overexpression on Circ-MYOCD back-splicing were evaluated. In a H9C2 cell model of angiotensin II (Ang II)-induced myocardial hypertrophy, the expression of HNRNPH1 was detected, the effects of HNRNPH1 knockdown and overexpression on progression of myocardial hypertrophy were assessed, and the regulatory effect of HNRNPH1 on Circ-MYOCD back-splicing was analyzed. Results Sanger sequencing confirmed that the junction primers could amplify the correct Circ-MYOCD sequence. RNase R and nuclear-cytoplasmic fractionation assays showed that Circ-MYOCD was stable and predominantly localized in the cytoplasm. Bioinformatics analysis and mass spectrometry from the Circ-MYOCD pull-down assay identified HNRNPH1 and HNRNPL as the RBPs interacting with Circ-MYOCD. In H9C2 cells, HNRNPH1 knockdown significantly enhanced while its overexpression inhibited Circ-MYOCD back-splicing; HNRNPH1 overexpression obviously increased the expressions of myocardial hypertrophy markers ANP and BNP, while its knockdown produced the opposite effect. In Ang II-induced H9C2 cells, which exhibited a significant increase of HNRNPH1 expression and increased expressions of ANP and BNP, HNRNPH1 knockdown obviously increased Circ-MYOCD expression, decreased MYOCD expression and lowered both ANP and BNP expressions. Conclusion HNRNPH1 regulates Circ-MYOCD back-splicing to influence the progression of myocardial hypertrophy.

Graphical abstract

关键词

心肌肥厚 / 反向剪接 / 环状RNA / 剪接因子 / HNRNPH1

Key words

cardiac hypertrophy / back-splicing / circular RNA / splicing factors / HNRNPH1

心肌肥厚是心肌细胞通过增大细胞体积来增强心肌收缩力、减轻心室壁压力的一种代偿性和适应性反应，但长期的心肌肥厚可能导致心脏收缩和舒张功能受损，最终引发心力衰竭 ^{［1］［2］}。心肌肥厚分为生理性肥厚和病理性肥厚，前者通过心脏的形态和功能适应维持泵血功能，后者则因心肌细胞受损及心脏缺血、缺氧而重构，伴随心力衰竭、心律失常甚至死亡^［3］。研究表明，心肌肥厚贯穿于心力衰竭的全过程^［4］，因此，对心肌肥厚的干预对于心衰的治疗具有重要意义。

环状RNA（CircRNA）的形成始于前体mRNA（pre-mRNA）的反向剪接，通过特定的剪接机制将一个外显子的3'端与另一个外显子的5'端连接，形成闭合的环状结构^{［5， 6］}。研究发现，心肌肥厚发生时，CircRNA的表达谱显著上调或下调，提示其在心肌肥厚的发生和发展中可能发挥重要作用^［7］。具体来说，CircRNA通过其独特的“海绵”效应，即吸附并隔离miRNA，影响下游靶基因的表达，从而参与心肌肥厚的调控^［8］。特定CircRNA的过表达或沉默能够直接影响心肌细胞的增殖和凋亡，进而影响心肌肥厚的发生^［9］。此外，CircRNA的稳定性和特异性为其在心血管疾病的靶向疗法中提供了潜在的应用前景^［10］。目前对于CircRNA的研究仍处于起步阶段，许多具体机制尚不清楚，因此深入探讨CircRNA在心肌肥厚中的作用机制对于理解其发病机制和寻找新疗法具有重要意义。

前期研究已筛选，由MYOCD的pre-mRNA反向剪接形成，在心肌中特异性表达且有差异性表达的Circ-MYOCD，并初步确定其具有抑制心肌肥厚的功能^［11］。但目前尚未有关调控Circ-MYOCD反向剪接表达的报道。在反向剪接过程中，剪接因子SRSFs（富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子）与HNRNPHs（异质核核糖核蛋白）家族成员发挥关键调控作用^{［12， 13］}。它们可以特异性地识别并结合RNA中剪接信号的RNA结合蛋白（RBPs），这些蛋白家族在mRNA剪接中相辅相成^［14］，促进反向剪接的发生^［15］。本研究通过生物信息学分析发现HNRNPHs和SRSFs蛋白存在可能调控Circ-MYOCD反向剪接的RBPs。因此，本研究将深入探讨在心肌肥厚模型中SRSFs蛋白家族和HNRNPs蛋白家族对Circ-MYOCD反向剪接的影响，以及这一调控关系是否可以调控心肌细胞肥大的进程，以期为心血管疾病的临床治疗提供一个新的策略。

1 材料和方法

1.1 细胞、试剂和器械

H9C2大鼠心肌细胞来自于上海生命科学研究院。PBS、DMEM、50×TAE、琼脂糖粉（武汉赛维尔生物科技有限公司）；胎牛血清（赛默飞）；胶回收试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂，脂质体核酸转染试剂，2×Hieff PCR Master Mix（翌圣生物科技股份有限公司）；PVDF膜（默克）；本研究中使用的抗体包括GAPDH、HNRNPH1、HNRNPL（ABclonal）、山羊抗兔IgG-HRP（Abways），化学发光系统（新赛美生物科技）；siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成；所有引物均由金维智有限公司合成。pAd-Track-cmv-GFP质粒为本实验室前期构建。PCR仪、琼脂糖凝胶电泳仪（翌圣生物科技股份有限公司）；离心机（海尔生物科技有限公司）、细胞培养箱、无菌超净工作台（ThermoFisher）；隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 H9C2细胞培养及AngⅡ诱导的心肌肥大模型建立

将H9C2细胞使用10%牛血清的DMEM培养，并置于37 ℃、5% CO₂的恒温培养箱中，待细胞密度达到80%，用0.25%胰蛋白酶消化后再传代。将细胞接种与6孔板后，加入AngⅡ后使最终浓度为10^-7 mol/L，刺激24 h使心肌细胞肥大。

1.2.2 实验分组及处理

AngⅡ组：在AngⅡ的浓度为10^-7 mol/L的DMEM完全培养基中培养24 h的H9C2细胞；control组：正常培养24 h的H9C2细胞。NC组：转染si-NC阴性对照的H9C2细胞培养24 h；si-HNRNPH1组：转染si-HNRNPH1的H9C2细胞培养24 h；si-HNRNPL组：转染si-HNRNPL的H9C2细胞培养24 h。GFP组：感染1 OD的Ad-GAP腺病毒培养24 h的H9C2细胞；Ad-HNRNPH1组：感染1 OD的Ad-HNRNPH1腺病毒培养24 h的H9C2细胞；si-HNRNPL组：转染si-HNRNPL的H9C2细胞。AngⅡ+si-HNRNPH1：在心肌肥厚模型基础上转染si-HNRNPH1后培养24 h；AngⅡ+NC：在心肌肥厚模型基础上转染si-NC后培养24 h；AngⅡ+Ad-HNRNPH1：在心肌肥厚模型基础上感染Ad-HNRNPH1后培养24 h；AngⅡ+GFP：在心肌肥厚模型基础上感染Ad-GFP后培养24 h。参照siRNA说明书，使用脂质体核酸转染试剂进行细胞转染。

1.2.3 PCR扩增

提取H9C2细胞的RNA将其反转录为cDNA，设计用于合成Circ-MYOCD的引物，序列为5'-TCACGGAAGAATCCATAGGC-3'和5'-ACGGC TTCAACAGAGAAGGA-3'，进行聚合酶链式反应（PCR反应），35个循环后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，30 min后，紫外下显影并拍照。

1.2.4 CircRNA富集实验

首先从H9C2中提取的总RNA，将原始的RNA分为2份，每份取5 μg的RNA，一份用RNase R处理，标记为 RNase R（+），另一份不做处理，标记为RNase R（-）。按试剂说明配制所需的反应体系，待RNase R酶消化后，提取RNA进行RT-qPCR检测Circ-MYOCD和MYOCDD的RNA水平。

1.2.5 核质分离实验

首先细胞收集，PBS清洗2遍，使用 Thermo Fisher 公司的核质分提试剂盒（PARISTM Kit Protein and RNA Isolation System）进行实验，加入ice-cold Cell Fractionation Buffer冰上裂解10 min，离心后去除上清的细胞质，沉淀为细胞核，细胞核沉淀部分加入ice-cold Cell Disruption Buffer，将样品转移到套管中后续逐步用，洗液清洗最终的到得胞质和胞核的RNA。

1.2.6 qRT-PCR

使用试剂盒（捷飞）提取各组细胞总RNA，根据反转录试剂盒HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）试剂盒合将 RNA 逆转录为cDNA，使用SYBR® Green Pro Taq HS 预混型试剂进行qRT-PCR检测。以GAPDH和U6作为检测内参，用2^-△△CT法计算基因表达（表1）。

1.2.7 Western blotting

使用RIPA裂解液在冰上裂解后提取细胞的总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。经SDS-PAGE将蛋白分离后、将蛋白转移至PVDF膜、5%脱脂奶粉封闭2 h后，加入相应的一抗（HNRPNH1、HNRNPL抗体的稀释浓度为1：1000；GAPDH抗体的稀释浓度为1∶3000），4 ℃ 孵育过夜，TBST洗3遍，加入二抗（山羊抗兔IgG的稀释浓度为1∶3000），室温慢摇孵育1 h，再次TBST洗3遍，使用ECL显色在暗室下显影。所有蛋白条带均以GAPDH为内参。

1.2.8 过表达HNRNPH1重组腺病毒的构建

首先在NCBI 中查询到HNRNPH1序列，以H9C2的cDNA为模板经PCR扩增，将扩增产物定向插入pAd-Track-cmv-GFP载体中构成重组质粒。然后将重组质粒线性化后，在BJ5183大肠杆菌中与已有的pAd-Easy-I骨架质粒进行重组成重组腺病毒载体。最后，使用限制酶PmeⅠ将重腺病毒质粒线性化，转染到293A细胞中包装成Ad-HNRNPH1重组腺病毒。同时，用同样的方法制备了Ad-GFP作为对照腺病毒。

1.2.9 统计学分析

应用GraphPad Prism8.0统计软件进行数据分析。数据采用均数±标准差表示，两组间的差异比较采用配对t检验。以P<0.05（双侧）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Circ-MYOCD在H9C2细胞中的成环性、分布和稳定性鉴定

Circ-MYOCD由MYOCD的外显子2~5组成（图1A），PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳的结果显示在300 bp~400 bp有片段存在，可以正确扩增出360 bp大小的Circ-MYOCD片段（图1B），Sanger测序结果显示，PCR产物中包含的Circ-MYOCD接头序列正确（图1C）。RNase R实验结果显示RNase R处理后线性MYOCD的mRNA出现严重的降解（P<0.001），Circ-MYOCD的降解不明显（图2D）。核质分离实验和RT-qPCR结果显示，Circ-MYOCD主要分布在细胞质中（P<0.001，图2E）。

2.2 预测与Circ-MYOCD结合的RNA结合蛋白

在RBPmap数据库中预测可以与 Circ-MYOCD相互结合的蛋白质，其中包含了SRSFs蛋白家族成员中SRSF1、SRSF2、SRSF4、SRSF5、SRSF8、SRSF9、SRSF10；以及HNRNPs蛋白家族中HNRNPA0、HNRNPA1、HNRNPA2B1、HNRNPDL、HNRNPF、HNRNPH1、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPLL，将预测的结果与Circ-MYOCD的pull-down的质谱结果中的HNRNPA3、HNRNPH1、HNRNPL、SRSF3取交集，结果显示HNRNPH1和HNRNPL可以与Circ-MYOCD相结合（图2）。

2.3 敲低HNRNPH1和HNRNPL后对Circ-MYOCD与MYOCD的影响

RT-qPCR及Western blotting结果显示si-HNRNPH1在H9C2细胞中有较明显的敲低效率（P<0.001，图3A、B）。RT-qPCR结果显示H9C2细胞中敲低HRNPH1后Circ-MYOCD的表达升高（P<0.01），MYOCD的表达降低（P<0.05，图3C）；敲低HNRNPL后Circ-MYOCD降低（P<0.001），而MYOCD的表达没有明显的变化（图3D）。

2.4 HNRNPH1可能调控Circ-MYOCD的反向剪接

荧光显微镜成像结果显示，Ad-HNRNPH1重组腺病毒对心肌细胞具有较高的感染效率（图4A）；RT-qPCR及Western blotting结果显示，与GFP组相比，Ad-HNRNPH1组中检测到该重组腺病毒具有较高的过表达效率（P<0.001，图4B）。Ad-HNRNPH组与GFP组相比Circ-MYOCD表达下降（P<0.01），MYOCD表达升高（P<0.05，图4C）。

2.5 HNRNPH1可能促进心肌肥厚的发生

AngⅡ构建的心肌肥大细胞模型中检测到ANP、BNP这两种心肌肥厚标志物分子的表达上升（P<0.001），心肌细胞肥大模型构建成功（图5A）。AngⅡ组中HNRNPH1在mRNA和蛋白水平相比于Control对照组的表达均升高（P<0.001，图5B）。si-HNRNPH组与NC相比肥厚标志物分子ANP和BNP的表达降低（P<0.05，图5C）。Ad-HNRNPH1组与GFP组相比ANP和BNP的表达升高（P<0.05，图5D）。

2.6 HNRNPH1影响Circ-myocd的反向剪接且调控心肌肥厚的进展

RT-qPCR和Western blotting的结果显示，AngⅡ+NC组与Control+NC组相比，AngⅡ+NC组的HNRNPH1的表达升高（P<0.05）；AngⅡ+si-HNRNPH1与AngⅡ+NC组相比，AngⅡ+si-HNRNPH1组中HNRNPH1的表达出现降低（P<0.05，图6A）。RT-qPCR的结果显示，AngⅡ+NC组与Control+NC组相比，AngⅡ+NC组的Circ-MYOCD的表达降低（P<0.05），MYOCD的表达升高（P<0.05），ANP和BNP的水平表达均有明显的升高（P<0.001）；AngⅡ+si-HNRNPH1与AngⅡ+NC组相比，AngⅡ+si-HNRNPH1组中Circ-MYOCD的表达升高（P<0.001），MYOCD的表达降低（P<0.01），ANP和BNP的水平表达均有明显的降低（P<0.05，P<0.001，图6B）。

3 讨论

CircRNA是一种单链共价闭合环状 RNA 分子，是通过线性RNA反向剪接形成的，在心肌肥厚的发生和发展中起着重要的调控作用^［16］，CircRNA的形成与剪接因子的调控密不可分^［17］，与此同时，有研究指出剪接因子通过调控基因的剪接事件影响心肌细胞的肥大和重构，参与心肌肥厚的调控^［18］。目前大量的研究已经证明通过CircRNA与相应的miRNA相互作用，影响细胞的自噬、凋亡等过程，从而参与心肌肥厚的调控^［19］，但是关于CircRNA如何受到剪接因子调控的研究尚显不足，因此深入研究剪接因子与CircRNA之间的作用机制是十分有意义的，从而不仅为深入理解心肌肥厚的分子机制提供了新的视角，并为心血管疾病的预防和治疗提供新的思路和策略。本研究发现HNRNPH1抑制了Circ-MYOCD的反向剪接，验证了在肥大的心肌细胞中减少HNRNPH1的表达可以逆转心肌肥大的发生。

CircRNA是一种独特的RNA分子，它是由线性mRNA前体经过反向剪接而形成的闭合环形结构^［22］。相较于线性mRNA，CircRNA展现出更高的稳定性^［21］。本研究针对MYOCD基因的外显子2和外显子5的接头处设计了引物，成功地扩增出了正确的Circ-MYOCD，并验证了接点的准确性。为了进一步确认其稳定性，我们进行了RNase R实验。实验结果显示，Circ-MYOCD比其宿主基因MYOCD的mRNA具有更强的稳定性，能够更好地抵抗RNase R的降解作用。此外，我们还验证了Circ-MYOCD主要存在于细胞质中，是一种环形分子。前期研究结果中已经验证Circ-MYOCD在心肌中特异性表达，在肥大的心肌细胞中的表达降低，过表达Circ-MYOCD可以抑制心肌肥大的发生。综上，Circ-MYOCD在心肌细胞质中可以稳定存在，其动态变化可能参与心肌肥厚的发生。因此，Circ-MYOCD有可能成为相关疾病的潜在生物标志物，为未来心血管疾病诊断和治疗提供了新的思路和方向。

剪接因子在CircRNA的反向剪接过程中扮演着不可或缺的角色，通过精确调控剪接位点的选择和剪接体的组装，确保了CircRNA的稳定生成和功能发挥^［22］。在反向剪接的过程中，剪接体需精确识别并结合至特定的剪接位点，这一过程涉及一系列复杂的蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA相互作用^［23］。目前已知，多个剪接因子参与了这一复杂的生物过程，其中，SRSFs蛋白家族和HNRNPs蛋白家族是两种关键的RBPs白家族，它们在细胞内各自扮演着独特的角色，特别是在前体mRNA的剪接调控中发挥着相反或互补的作用^{［24， 25］}。本研究中，我们利用RBPmap数据库及Circ-myocd的pull-down质谱技术，深入分析了与Circ-MYOCD相互作用的蛋白质。结果发现，HNRNPH1和HNRNPL可能与Circ-MYOCD相结合，并对其反向剪接过程产生影响。通过敲低HNRNPH1的实验，我们发现Circ-MYOCD的表达水平显著上升，而MYOCD的表达则显著下降。通过过表达实验，我们得到了与之相反的结果，我们推测剪接因子HNRNPH1抑制了Circ-MYOCD的反向剪接过程。为了更深入地探究Circ-MYOCD在心肌肥厚中的反向剪接机制，我们在心肌肥厚模型中检测了HNRNPH1的表达水平。结果显示，HNRNPH1的表达水平在心肌肥大时上升。在心肌肥大且敲低HNRNPH1的实验中，我们发现Circ-MYOCD的表达水平上升，而MYOCD的表达水平下降，这一结果进一步证实了HNRNPH1对Circ-MYOCD的负向调控作用。综上，我们的研究结果表明HNRNPH1在肥厚的心肌中表达升高，抑制了Circ-MYOCD的反向剪接过程。

HNRNPH1在心血管疾病领域的研究中，展现了多方面的角色和重要性，它不仅作为生物标志物在诊断中发挥作用，还参与了心肌纤维化和代谢性心血管疾病的调控过程^［26］。首先，HNRNPH1被确认为肺动脉高压（PAH）诊断的潜在重要生物标志物之一^［27］。此外，HNRNPH1还参与了DICAR代谢的调节过程，特别是对OGDHL、谷氨酰胺及谷胱甘肽的合成具有关键作用。在糖尿病相关的心血管疾病中，这一调节作用可能发挥着举足轻重的作用^［28］。在心肌梗死后的心肌纤维化研究中，可以通过直接注射重组腺相关病毒9（rAAV9）短发夹RNA（shRNA）来抑制circHNRNPH1的方法，可以有效降低心肌中circHNRNPH1的水平^{［29， 30］}。尽管这种方法对mRNA-HNRNPH1的影响不明显，但它揭示了HNRNPH1在心肌纤维化过程中的潜在调控作用。作为RNA结合蛋白，HNRNPH1在RNA的成熟及转录后加工修饰过程中发挥着至关重要的作用。这一特性使其在心血管疾病的研究中具有潜在的应用价值。本研究实验首次探究了HNRNPH1在心肌肥厚中的作用。实验结果表明，HNRNPH1可以促进心肌肥厚标志物分子ANP、BNP的表达，具有促进心肌肥厚的效果。具体来说，在肥大的心肌细胞中，它通过抑制MYOCD的反向剪接，导致心肌细胞内MYOCD的积累，减少Circ-MYOCD的产生促使细胞的肥大发生。对于肥大的心肌细胞而言，降低HNRNH1的表达可以提升Circ-MYOCD的表达，从而减少MYOCD的表达，进而有可能逆转心肌肥厚的发生。这一发现与以往关于circ-MYOCD和MYOCD在心肌肥厚中作用的认知相吻合，即MYOCD促进心肌细胞的增殖和肥厚。HNRNPH1与MYOCD之间的相互作用，为理解心肌肥厚的发生机制提供了新的视角，也为心血管疾病的治疗提供了新的潜在靶点。

综上所述，本研究证明Circ-MYOCD的反向剪接过程受到HNRNPH1的调控作用。在心肌肥厚发生的过程中，剪接因子HNRNPH1的表达显著上升，这进而抑制了Circ-MYOCD的反向剪接活动。这一抑制作用导致Circ-MYOCD的水平降低，而MYOCD的含量上升，从而促成了心肌肥厚的发生。通过抑制HNRNPH1在肥厚过程中的表达，可以有效地减轻对Circ-MYOCD反向剪接的抑制效应。这一操作能使Circ-MYOCD的表达水平显著提高，从而有可能逆转心肌肥厚的发展。这一发现为未来心肌肥厚治疗的研究提供了新的思路和科学依据。未来，我们将继续深入研究Circ-MYOCD在抑制心肌肥厚作用中的下游靶标。我们将探索其具体的分子机制以及涉及的信号通路，以期在整体动物水平上更准确地明确Circ-MYOCD对心肌肥厚的调控作用。这些研究将为基于CircRNA的心肌肥厚治疗研究提供宝贵的科学资料，为临床治疗提供新的可能性和方向。

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