唾液链球菌K12对肺炎支原体感染小鼠的预防作用

Protective effect of Streptococcus salivarius K12 against Mycoplasma pneumoniae infection in mice

摘要

目的 探讨唾液链球菌K12对肺炎支原体（Mp）感染小鼠是否具有预防作用。 方法 20只雄性BALB/c小鼠随机分为：正常对照组、单纯益生菌组（K12+PBS组）、单纯Mp感染组（PBS+Mp组）、益生菌预防组（K12+Mp组），5只/组。Mp感染3 d后进行支气管肺泡灌洗液（BALF）计数；ELISA检测血清中分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的表达；RT-qPCR检测肺组织中Mp的P1和社区获得性呼吸窘迫综合征（CARDS）毒素，肺组织炎症因子TNF-α、IL-6、趋化因子1（CXCL1）、肺部重塑功能基质金属酶9（MMP9）、粘蛋白5ac（MUC5ac）、胶原蛋白3a1（Col3a1）、Toll样受体2（TLR2）及TLR4的mRNA表达；Western blotting检测肺组织中TLR2和TLR4蛋白水平变化；HE染色和AB/PAS染色观察肺组织病理变化和肺部气道重塑变化。 结果 K12+Mp组的P1、CARDS mRNA表达和BALF中白细胞数量较PBS+Mp组相比降低（P<0.05）。K12+Mp组血清中的炎症因子差异无统计学意义；但是肺组织中TNF-α（P<0.001）、IL-6（P<0.01）和CXCL1（P<0.05）的mRNA表达都呈下降趋势，且TLR2（P<0.01）和TLR4（P<0.001）的表达也降低。K12+Mp 组肺组织中MMP9（P<0.001）、MUC5ac （P<0.001）和COL3A1（P<0.0001）的mRNA表达呈现下降的趋势，AB/PAS 染色显示粘液分泌降低。 结论 K12益生菌在一定浓度和时间范围内预防给药能有效减轻Mp感染小鼠肺部炎症反应，同时能够有效改善肺组织气道重塑功能和肺部损伤，对Mp感染小鼠有一定的预防作用。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of the probiotic bacterium Streptococcus salivarius K12 (K12) against Mycoplasma pneumoniae (Mp) infection in mice. Methods Forty male BALB/c mice were randomized into normal control group, K12 treatment group, Mp infection group, and K12 pretreatment prior to Mp infection group. The probiotic K12 was administered daily by gavage for 14 days before Mp infection induced by intranasal instillation of Mp. Three days after Mp infection, the mice were euthanized for analysis of bronchoalveolar lavage fluid (BALF) cell counts and serum levels of secretory immunoglobulin A (sIgA), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), and interleukin-6 (IL-6). RT-qPCR was performed to detect the P1 and community-acquired respiratory distress syndrome ( CARDS ) toxin of Mp in the lung tissues and the mRNA expressions of TNF-α, IL-6, chemokine 1 (CXCL1), matrix metalloproteinase 9 (MMP9), mucin 5ac (MUC5ac), collagen 3a1 (Col3a1), Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4; the protein expressions of TLR2 and TLR4 in the lung tissue were detected using Western blotting. Pathological changes in the lung tissue and airway remodeling were examined with HE staining and AB/PAS staining. Results Compared with the Mp-infected mice with PBS treatment, the infected mice with K12 treatment showed significantly lowered mRNA levels of P1 and CARDS in the lung tissue and reduced white blood cell counts in the BALF (P<0.05). In spite of the absence of significant differences in serum levels of inflammatory factors between the two groups, the mRNA expressions of TNF‑α, IL-6, CXCL1, MMP9, MUC5ac and COL3A1 and the mRNA and protein levels of TLR2 and TLR4 in the lung tissues were significantly lower in K12-treated mice, in which AB/PAS staining showed obviously decreased mucus secretion. Conclusion K12 pretreatment can effectively reduce pulmonary inflammatory responses, improve airway remodeling and alleviate lung injury in Mp-infected mice.

Graphical abstract

关键词

唾液链球菌K12 / 肺炎支原体 / 口腔益生菌 / 肺炎支原体感染模型 / BALB/c小鼠

Key words

Streptococcus salivarius K12 / Mycoplasma pneumoniae / oral probiotics / Mycoplasma pneumoniae infection model / BALB/c mice

肺炎支原体（Mp）基因组简单，无细胞壁，是在无生命培养基上生长的原核细胞型微生物^{［1， 2］}。Mp常引起非典型肺炎，引起明显的肺部损伤；主要表现为Mp可引起的急慢性气道相关炎症，如气管支气管炎、哮喘和慢性阻塞性疾病；此外还能引起其他肺外相关疾病，如肾炎、心肌炎、脑膜脑炎、皮肤黏膜破损和动脉粥样硬化等^［3］。研究表明Mp流行爆发大约每3~7年出现1次，随着COVID-19大流行结束后，可能是由于群体免疫力的下降，去年全国许多地方出现Mp流行及发展为重症肺炎的情况^{［4， 5］}，其中Mp肺炎的加重常被认为是宿主对Mp的过度炎症反应^［4］。另外，抗生素的滥用导致Mp出现大环内酯类耐药，易形成难治性肺炎^［6］。因此，加强Mp感染的预防与治疗是非常重要的。

近年来，益生菌的应用研究取得较大的发展，其中唾液链球菌K12（K12）作为口腔中的一种优势益生菌，常定植于上呼吸道，能通过产生唾液素A、唾液素B和细菌素抑制细菌的生长；能影响细菌生物膜形成从而抑制化脓链球菌和念珠菌的生长^{［7， 8］}。研究发现K12益生菌能黏附于人鼻咽上皮细胞上调宿主细胞的抗炎反应，从而为宿主提供保护，使其免受病原体引起的炎症刺激和细胞凋亡的影响^［9］。K12益生菌可通过改善口腔和肺部微生物群，提高机体免疫力从而防御新冠病毒入侵^［10］。除了在口腔健康方面的作用外，K12益生菌常被用于治疗链球菌引起的咽炎和扁桃体炎^［11］。目前国内外未见唾液链球菌用于Mp感染防治的报道。本研究主要探讨口腔K12益生菌对Mp感染小鼠的预防作用，首先对小鼠连续口服K12益生菌进行预防，然后再用Mp感染预防后的小鼠，最后检测小鼠的血清、BALF和肺组织的相关炎症变化和病理变化，为Mp的致病机制研究及防治提供实验依据和研究方向。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性BALB/c小鼠，4~6周龄，体质量20±2 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲养于南华大学实验动物部［SCXK（湘）2020-0002］，普通维持饲料和垫料由南华大学实验动物部提供。SPF环境饲养期间各组正常饮水，昼夜12 h节律分笼饲养，保持适宜湿度和温度及充足通风，小鼠适应1周后进行实验。本研究经南华大学伦理委员会审批通过（伦理批号：USC202201XS78）

1.1.2 药物与菌株

药物：K12益生菌片（NOW Foods），每片含有10⁹ CFU K12益生菌。K12益生菌的给药浓度参考《药理实验方法学》^［12］中人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值表。20 g小鼠与成人体表面积指数为0.0026，每片研磨成粉剂，每片实际质量为52 mg，按照成人1片/d，计算得出小鼠每天所需益生菌粉剂为6.76 mg/kg，每只小鼠每天给予40倍益生菌粉剂5.95 mg。菌株：Mp菌株（M129，ATCC29342）由南华大学衡阳医学院病原微生物实验室保存并惠赠。

1.1.3 其它

PPLO粉（BD），胎牛血清（上海依科赛），DNA提取试剂（南京诺唯赞），ELISA试剂盒：sIgA（武汉华美）、TNF-α和IL-6（中国欣博盛）；Western blotting抗体：TLR2（1∶1000，Abcam），TLR4（1∶1000，Proteintech），β-actin（1∶3000，Absin），羊抗兔二抗（1∶5000，泊湾生物）和兔抗鼠二抗（1∶3000，Absin），BCA试剂盒（中国全式金），RNA-easy Isolation Reagent试剂说明书（南京诺唯赞），逆转录试剂盒和SYBR Green荧光定量试剂盒（北京天根）。

1.2 方法

1.2.1 Mp的培养、CFU测定和DNA测定

Mp的培养：将Mp按照1∶10在PPLO液体培养基中传代接种培养，3~4 d后待培养基变橙黄后，收集Mp沉淀物，在4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，弃上清再用PBS润洗1遍，用无菌27G针头吹打混匀，制成Mp混悬液。CFU测定：吸取Mp悬液接种到Mp固体培养基上，5~7 d后计算Mp菌落数量以确定感染剂量。Mp DNA测定：根据课题组前期研究^［13］，合成上下游引物和探针，序列见表1，提取Mp和肺组织的DNA。PCR扩增反应条件为：预变性，94 ℃，3 min，1个循环；变性94 ℃，30 s，退火58 ℃，30 s，延伸72 ℃，1 min，32个循环。为保证对小鼠感染的效果，固定Mp感染浓度为（1~9）×10⁶ copies/μL，浓缩后立即感染。

1.2.2 Mp感染小鼠模型的构建

按照Mp DNA载量10⁷ copies/只，滴鼻感染1次（n=3），按照0、3、7、14 d处理小鼠，观察小鼠出现的症状和检测Mp DNA。

1.2.3 K12益生菌预防模型构建

探究K12益生菌对Mp感染小鼠的的最适浓度，随机分为6个组（正常对照组、10倍、20倍、40倍、80倍、160倍益生菌组），3~5只/组。先将K12益生菌片按照上述倍数用PBS溶解，益生菌组均给小鼠口服K12益生菌，其余给予等量的PBS，28 d后，按照Mp DNA载量10⁷ copies/只，滴鼻感染1次，滴鼻前，先称质量再感染。Mp感染3 d后，即可进行眼眶取血，后续在生物安全柜中进行支气管肺泡灌洗和肺组织取样。随后分0、7、14、21、28 d组用最适的K12益生菌浓度摸索给药最适时间，除对照组3只外，其余各组5只。

1.2.4 K12益生菌预防Mp感染模型分组

随机将20只小鼠分为正常对照组、单纯益生菌组（K12+PBS组）、单纯Mp感染组（PBS+Mp组）、益生菌预防组（K12+Mp组），5只/组。最适浓度K12益生菌预防给药14 d后，对小鼠进行Mp感染，感染3 d后处死小鼠。考虑K12益生菌的持续性地预防作用和感染的随机性，感染期间K12益生菌不中断给药。

1.2.5 BALF细胞计数

将小鼠用异氟烷麻醉脱颈处死后固定在生物安全柜中解剖板上，用眼科剪从脖颈出剪开，显现出气管，用留置管和灌胃针组装成灌洗装置，将气管和装置固定好，开始用1.0 mL注射器抽取0.6 mL预冷好的PBS灌洗，灌洗2次，注入到准备好的紫色血常规管中，将BALF进行细胞计数。

1.2.6 ELISA检测sIgA、TNF-α和IL-6

收集BALF上清液和小鼠血清，分别检测BALF或血清中sIgA、TNF-α和IL-6的表达。先按说明书制备标准品，制作标准曲线；分别加入待测样本100 μL，小心气泡轻轻晃动混匀，覆上板贴，37 ℃孵育2 h；弃去液体，甩干；加生物素标记抗体工作液100 μL，换上新的板贴，防止污染，37 ℃孵育1 h；甩干，拍板和洗板3次，每孔加100 μL的辣根过氧化物酶亲和素工作液，注意不要留有气泡，覆上新的板贴，继续放入37 ℃温箱温育1 h；甩干，甩掉孔内液体，手工洗板5次，每孔洗涤液不要溢出到旁的孔，手工轻微晃动，浸泡2 min左右，在无尘纸上拍干；每孔加入90 μL底物溶液，盖上新的避光贴纸，在37 ℃温箱中避光显色20 min；撕去贴纸，每孔加50 μL终止液体，终止反应；用酶标仪测量每孔的光密度A_{450 nm}。

1.2.7 Western blotting检测肺组织TLR2和TLR4的表达

每份样本剪取20 mg左右的肺组织，置入EP管中，用PBS清洗多次，加入200 μL裂解液，在冰上用研磨器研磨至肺组织完全裂解，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，缓慢吸取上清液即为实验所需的总蛋白。BCA法测定肺组织总蛋白浓度，蛋白变性，根据BCA浓度测定调整样本浓度，用5X SDS-PAGE上样缓冲液按1∶4加入蛋白质样品中，100 ℃煮沸10 min，SDS-PAGE凝胶电泳：梯度电泳80 V，20 min；120 V，90 min，电泳时间可适当延长；转膜：恒流（电流300 mA）低温湿转45~80 min，可根据目的蛋白相对分子质量调整湿转时间，相对分子质量大转膜时间更长可随时调整。室温摇床封闭60 min；孵育一抗：TLR2（1∶1000，Abcam），TLR4（1∶1000，Proteintech），β-actin （1∶3000，Absin），4 ℃摇床孵育过夜；随后选择适宜的二抗：羊抗兔二抗（1∶5000，泊湾生物）和兔抗鼠二抗（1∶3000，Absin），室温孵育1 h；显影：使用ECL化学发光试剂盒（中国新赛美）用化学发光成像系统拍照并保存图像。

1.2.8 RNA提取和RT-qPCR检测

取小鼠每20 mg肺组织加入500 μL RNA-easy，用PBS清洗多次，冰上研磨组织裂解后，抽提RNA逆转成cDNA，检测cDNA浓度。Mp的P1蛋白和社区获得性呼吸窘迫综合征（CARDS）毒素以亲环蛋白Cyclophilin作为内参基因^［13］，细胞因子以GAPDH作为内参基因，CT值再根据2^-ΔΔCT公式计算出目的基因mRNA的转录水平，对照组均归一化处理。反应条件：预变性95 ℃，15 min，1个循环，95 ℃、10 s、60 ℃、30 s，40个循环，熔解曲线根据仪器ABI7500程序自动设置。Mp DNA引物和探针由南京金斯瑞公司合成，其余基因的引物序列由上海生工生物公司合成（表1）。

1.2.9 肺组织HE染色

将感染后小鼠处死后，将整个右肺浸入4%多聚甲醛（固定液）的EP管中固定，4 ℃冷藏保存。送长沙维世尔生物科技有限公司进行石蜡包埋，组织切成，评估肺部炎症^［15］。

1.2.10 肺组织AB/PAS染色

同肺组织HE染色，切片后使用阿新蓝和PAS染色的组合来定量中性（洋红）和酸性（深蓝色）粘蛋白。含有中性和酸性粘蛋白的细胞被染成紫色。采像为普通光学显微镜采集，倍数为20×10和10×10。然后由设盲的参与者在15分量表上对这些载玻片进行评分^［15］。洋红、深蓝色和紫色的强度各自以1~5的标度量化，并且将分数相加，得到0至1~5的总评分范围。

1.3 统计学分析

本实验所有数据均使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示。多组样本间比较采用单因素方差分析检验中的Tukey's 多重比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Mp感染小鼠模型的构建及K12益生菌最佳条件的摸索

通过培养Mp（图1A），用浓缩后的Mp菌液滴鼻感染小鼠，实验过程中均未出现小鼠死亡。实验期间发现小鼠在感染1 d出现气促，感染2 d开始抱团竖毛、易燥（图1B），感染3 d体质量相比于对照组略微下降（图1C），小鼠易激惹，有明显的应激反应，且感染后的小鼠Mp DNA检测结果均为阳性（图1D），说明Mp感染小鼠模型构建成功，选择感染后3 d为最佳检测时间。

在40倍K12益生菌给药时，小鼠肺组织中TNF-α和IL-6mRNA表达量最低（图1E、F）。随后用40倍K12益生菌分别对小鼠预防给药7、14、21和28 d，再用Mp感染3 d后取材。结果发现，肺组织中TNF-α和IL-6 mRNA在14 d和21 d表达下降（P<0.05，图1G、H）。考虑TNF-α是炎症反应的主要因子，表达最为明显，因此选择40倍K12益生菌浓度预防给药14 d为后续K12益生菌预防实验的最佳条件。

2.2 K12益生菌预防给药后Mp载量和BALF计数

与PBS+Mp组相比，K12+Mp组的P1蛋白和CARDS mRNA表达降低（P<0.05，图2A、B）。相对于PBS+Mp组，K12+Mp组WBC数量降低（P<0.01，表2）。

2.3 K12益生菌预防给药后Mp小鼠血清和肺组织中炎症变化

K12+Mp组血清中的sIgA、TNF-α和IL-6与PBS+Mp组相比差异无统计学意义（图3A~C），但是单独加K12益生菌组即K12+PBS组的sIgA高于后两组（P<0.05，图3A）。相较于PBS+Mp组，K12+Mp组的肺组织中CXCL1、IL-6和TNF-α的mRNA表达降低（P<0.05，图3D~F）。相对于PBS+Mp组，K12+Mp组炎症程度减轻，肺组织评分下降（P<0.05，图3G、H）；同样，K12+Mp组中TLR2和TLR4的表达明显降低（P<0.001，图3I~L）。

2.4 肺组织中MMP9、MUC5ac、COL3A1 mRNA水平和AB/PAS染色

与PBS+Mp组相比，K12+Mp组MMP9、MUC5ac和COL3A1的mRNA水平呈现下降的趋势（P<0.001，图4A~C）。根据AB/PAS染色，K12+Mp组小鼠肺组织的AB/PAS染色粘液分泌降低（P<0.05，图4D、E）。

3 讨论

Mp是引起非典型肺炎的常见病原菌，主要通过黏附于呼吸道上皮细胞，释放毒力因子引起肺部炎症反应，其中P1蛋白和CARDS毒素是Mp非常重要的黏蛋白和毒素蛋白，可反映Mp载量^［16］。K12益生菌已被证明可以抑制多种微生物的活性，减轻病原菌在口腔和呼吸道的定植，刺激机体有益反应，平衡宿主菌群^［17］。因此，我们推断K12益生菌能有效预防Mp感染。为了验证这一假说，我们通过用K12益生菌预防处理后，再进行Mp小鼠感染，结果显示：K12益生菌显著降低Mp中P1蛋白和CARDS毒素的mRNA表达，说明K12益生菌可预防减轻肺组织中Mp负荷。Mp感染后中性粒细胞会在支气管肺泡腔中大量聚集释放过多的致炎因子，并浸润到肺部，从而加重宿主组织损伤^{［14， 18］}，本研究结果显示，K12益生菌处理后BALF中WBC数量明显降低，表明K12益生菌能有效减轻中性粒细胞在肺泡支气管的浸润，而中性粒细胞在肺部的具体机制还有待进一步证明。

K12益生菌处理的Mp感染小鼠血清中sIgA和TNF-α的表达明显降低，而IL-6的表达无明显变化；同时肺组织中促炎细胞因子TNF-α、IL-6和CXCL1的mRNA表达水平明显降低，其中TNF-α降低最为显著，且肺组织变化明显减轻。研究指出，Mp感染后TNF-α常显著升高，并被证明易致气道高反应性和引起中性粒细胞的炎症级联反应^［18］。另外，有研究表明TNF-α和CARDS毒素的高共表达是难治性肺炎支原体肺炎的良好预测因子^［20］。随后，在猪肺炎支原体感染后，芹菜素可通过干预TNF-α启动子的DNA甲基化来抑制TNF-α mRNA的产生从而达到治疗效果^［21］。以上说明TNF-α在Mp感染模型中发挥关键作用，可能是其关键的炎症因子或预测因子。在本研究中血清IL-6无明显变化，可能原因是：Mp感染小鼠时间太短，不足以影响到小鼠血清IL-6的含量。研究阐明Mp可结合TLR2/4受体，激活MyD88-NF‑κB通路，促进肺组织释放炎症因子TNF-α^{［22， 23］}，已知TLR受体是先天性和适应性免疫的关键参与者^［18］，但TLR受体是否直接介导TNF-α释放尚不明确。为进一步研究K12益生菌调控Mp感染的受体蛋白，本研究发现利用K12益生菌处理的Mp感染小鼠TLR2和TLR4的表达明显降低，TLR2的转录水平降低倍数明显高于TLR4，提示K12益生菌可能主要通过影响TLR2受体的表达抑制肺部炎症因子的释放。

肺部气道重塑被证明是肺部损伤恢复的关键因素，其中MMP9、MUC5ac和Col3a1是肺部气道重塑的关键因子。在肺部感染中，MMP9常通过趋化肺部炎性细胞，破坏肺泡弹性导致肺部水肿，从而引起肺损伤^{［14， 24］}。MUC5ac是由气道杯状细胞产生的黏蛋白，可反映气道高反应、黏液化生和气道黏液阻塞的病理恶化程度^［25］。Col3a1是气道蛋白重塑因子，在长期Mp感染过程中胶原蛋白沉积增加^{［24， 25］}。在生理条件下维持健康的粘液屏障对于消除肺部内的病原体和刺激物至关重要。因此，本研究检测Mp感染小鼠的肺部气道重塑相关因子和粘液屏障，结果发现，K12益生菌处理后MMP9、MUC5ac和Col3a1的mRNA表达明显下降，AB/PAS染色显示肺组织中粘液减少，表明K12益生菌能恢复Mp引起的肺部损伤以及恢复肺组织粘液屏障。而K12益生菌其它种属如唾液链球菌24SMBc和M18株分别具有对肺炎链球菌抗菌作用和肺炎克雷伯菌的致病作用^{［26， 27］}。另外，在Mp感染模型中，干酪乳杆菌可促进M1肺泡巨噬细胞活化并减轻Mp肺炎^{［28， 29］}，但K12益生菌是否更优于这些益生菌还有待进一步研究。本文不足的是，未能阐明K12益生菌预防Mp感染小鼠中性粒细胞发挥的功能和调控TNF-α的具体机制。此外，K12益生菌是否能有效治疗Mp感染小鼠以及能否通过改变肺部优势菌群防治Mp感染是我们后续的研究方向。

综上所述，K12益生菌预防给药能有效减轻Mp感染小鼠肺部炎症反应，同时能够减轻肺部损伤和改善肺组织气道重塑功能。

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