外源性瘦素通过上调星形胶质细胞GLT-1和GLAST的表达减轻小鼠脑缺血再灌注引起的谷氨酸兴奋毒性损伤

Exogenous leptin improves cerebral ischemia-reperfusion-induced glutamate excitotoxic injury in mice by up-regulating GLT-1 and GLAST expression in astrocytes

摘要

目的 探究外源性瘦素（Leptin）对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及其内在机制。 方法 将100只C57BL/6小鼠随机分为5组：假手术（Sham）组、脑缺血/再灌注模型组（I/R组）、瘦素低剂量组（Leptin-L组，0.5 mg/kg）、瘦素中剂量组（Leptin-M组，1 mg/kg）和瘦素高剂量组（Leptin-H组，2 mg/kg），20只/组。采用改良线栓法复制小鼠局灶性脑缺血/再灌注模型，缺血1.5 h再灌注24 h后进行神经功能评分评估神经功能缺损程度，TTC染色测定脑梗死面积，HE染色观察皮层脑组织病理变化，退化神经元染色观察皮层神经元变性损伤程度，免疫组织化学染色测定皮层脑组织胶原酸性纤维蛋白的表达和形态变化，Western blot测定皮层脑组织胶原酸性纤维蛋白蛋白表达。在此基础上，另将45只C57BL/6小鼠随机分为Sham组、I/R组和Leptin组（1 mg/kg），15只/组。谷氨酸检测试剂盒检测皮层脑组织谷氨酸含量，免疫组织化学染色测定皮层谷氨酸-天冬氨酸转运体（GLAST）和谷氨酸转运体1（GLT-1）表达，Western blotting测定GLAST、GLT-1蛋白表达。 结果 与I/R组比较，瘦素明显降低小鼠神经功能缺损评分（P<0.0001），缩小脑梗死面积（P<0.001），减轻皮层脑组织病理损伤程度，降低皮层神经元损伤程度（P<0.0001），维持星形胶质细胞正常形态及降低星形胶质细胞的过度增生和表达（P<0.01），使GLT-1、GLAST表达上调（P<0.01、P<0.05），脑组织谷氨酸含量降低（P<0.01）。 结论 外源性瘦素对小鼠脑缺血再灌注损伤具有明显的神经保护作用，其机制可能与调节星形胶质细胞过度增生和上调GLT-1、GLAST的表达从而降低谷氨酸的兴奋毒性损伤有关。

Abstract

Objective To investigate the protective effect of exogenous leptin against focal cerebral ischemia-reperfusion (I/R) injury in mice and explore the underlying mechanism. Methods A total of 100 C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups, including a sham-operated group, cerebral I/R model group, and 3 leptin treatment groups with intraperitoneal injections of 0.5, 1.0 or 2.0 leptin immediately after occlusion of the internal carotid artery. At 24 h after reperfusion, neurological function scores of the mice were assessed, and TTC staining was used to determine the area of cerebral infarction. The pathological changes in the cortical brain tissue of the mice were observed using HE staining, and degenerative damage of the cortical neurons were assessed with Fluoro-Jade C staining. The expression of glial fibrillary acidic protein in cortical brain tissues was detected using immunohistochemistry and Western blotting. In another 45 C57BL/6 mice with sham operation, I/R modeling, or leptin (1 mg/kg) treatment, glutamic acid in the cortical brain tissue was detected using glutamate assay, and cortical glutamate-aspartate transporter (GLAST) and glutamate transporter-1 (GLT-1) protein expressions were detected using immunohistochemistry. Results Compared with the I/R model mice, the leptin-treated mice had significantly lower neurological deficit scores, smaller cerebral infarct area, milder pathologies in the cortical brain tissue, and lessened cortical neuronal damage with normal morphology and less excessive proliferation of the astrocytes. Leptin treatment significantly up-regulated the expressions of GLT-1 and GLAST and lowered the content of glutamic acid in the brain tissue of the I/R mice. Conclusion Exogenous leptin has obvious neuroprotective effect against cerebral I/R injury in mice, mediated probably by controlling excessive astrocyte proliferation and up-regulating cortical GLT-1 and GLAST expressions to reduce glutamate-mediated excitotoxic injury of the astrocytes.

Graphical abstract

关键词

瘦素 / 脑缺血再灌注损伤 / 星形胶质细胞 / GLT-1 / GLAST / 兴奋性毒性

Key words

leptin / cerebral ischemia-reperfusion injury / astrocytes / glutamate transporter-1 / glutamate-aspartate transporter / excitotoxicity

缺血性脑卒中作为临床上常见的神经系统疾病之一，是使患者永久性残疾的主要原因^［1］。药物溶栓或机械介入取栓恢复血液灌注是临床治疗缺血性脑卒中的主要措施，但随着血流的快速恢复可进一步加剧脑组织损伤，即脑缺血/再灌注损伤（CIRI）^［2］，严重影响患者的预后。积极寻找更加有效的改善CIRI预后的方法刻不容缓。

兴奋性氨基酸毒性是缺血性脑卒中致神经元死亡和功能障碍的主要病理机制之一，它主要由中枢神经系统中细胞外谷氨酸（Glu）积累引起^{［3， 4］}。在中枢神经系统中，突触间隙的Glu浓度由兴奋性氨基酸转运体（EAATs）调节^{［5， 6］}，该转运体摄取突触间隙高浓度的Glu，防止Glu过度累积而诱导兴奋性神经毒性损伤^［7-10］，其在神经元损伤的病理生理级联反应中发挥着重要作用^{［11， 12］}。目前EAATs主要有5种亚型，即EAAT1~EAAT5，其中谷氨酸转运体1（GLT-1）和谷氨酸-天冬氨酸转运体（GLAST）主要在星形胶质细胞（AST）上表达，且在大脑Glu稳态的维持中起主要作用^{［13， 14］}。阐明GLT-1和GLAST在缺血性神经损伤中的作用并改善其功能可能是防治缺血性神经功能障碍的潜在靶点。

瘦素（Leptin）主要由脂肪细胞合成和分泌并释放入血，少量由骨骼肌、胎盘和乳腺上皮产生，很容易通过血脑屏障或脑脊液并以饱和运输方式进入大脑^［15］。研究发现瘦素可以减轻CIRI氧化应激损伤并对神经细胞凋亡具有改善作用^［16-18］，而瘦素对CIRI小鼠大脑皮层AST是否有影响，它能否通过改善AST的谷氨酸转运体（GLT-1、GLAST）的表达减轻CIRI的谷氨酸兴奋性毒性损伤尚未见报道。基于此，本实验通过复制小鼠I/R模型，通过检测脑组织病理变化，神经元变性损伤程度及脑组织胶原酸性纤维蛋白（GFAP）、GLT-1、GLAST的变化，探究外源性瘦素对脑I/R后的神经保护作用及对兴奋性氨基酸毒性的改善作用，以期为临床防治缺血性脑卒中提供可靠的实验和理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物、主要试剂及仪器

SPF级雄性C57BL/6小鼠145只（年龄6~8周，体质量20~25 g，河南斯克贝斯生物科技股份有限公司），小鼠分笼饲养，小鼠在温度25~27℃、湿度55%~75%的条件下分笼饲养。实验动物的使用及处理方法经蚌埠医科大学实验动物管理和伦理委员会审查并批准（审批编号：2022-214）。小鼠瘦素（m-leptin，PEPROTECH）、2，3，5-氯化三基苯四氮唑（TTC，Solarbio）、小鼠硅胶线栓（沃瑞德生物科技有限公司）、退化神经元染色（FJC）试剂盒（Solarbio）、GFAP抗体（abcam）、GLT-1抗体（abcam）、GLAST抗体（abcam）、Glu含量检测试剂盒（Solarbio）、电泳仪（Servicebio）。

1.2 动物分组

采用随机数字表法将100只C57BL/6小鼠随机分为5组：Sham组、I/R组、瘦素低剂量组（Leptin-L组，0.5 mg/kg）、瘦素中剂量组（Leptin-M组，1 mg/kg）和瘦素高剂量组（Leptin-H组，2 mg/kg），20只/组，分别用于TTC染色、HE染色、退化神经元检测、GFAP免疫组织化学染色和蛋白表达检测；另将45只C57BL/6小鼠随机分为3组，15只/组，分别用于GLT-1、GLAST的免疫组化检测、蛋白表达检测和Glu的含量检测。

1.3 小鼠I/R模型的制备

采用改良Longa线栓法^［19］制备小鼠I/R模型，术前用1%的戊巴比妥钠（80 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，将小鼠仰卧位轻放于手术台上并固定头部和四肢，颈部剪毛、消毒，在显微镜下逐层分离皮下组织，直至充分暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），近心端结扎CCA和ECA（图1），并在颈总动脉结扎处以上打一活结以便后续固定硅胶线栓，用小鼠动脉夹暂时夹闭CCA，后用眼科剪于CCA开一V型缺口，经缺口插入栓线并经动脉分叉插入ICA，插入约1.5 cm后稍感阻力时停止并固定栓线，闭塞1.5 h后显微镜下拔出栓线实现再灌注。Sham组仅插栓线（0.5 cm），Leptin组于刚插入栓线缺血即刻（0 min）时进行腹腔注射不同浓度的瘦素，Sham组和I/R组腹腔注射等体积生理盐水。

1.4 神经功能评分

参照Longa法^［19］对小鼠神经功能进行评分。0分：未见神经功能损伤的表现；1分：提尾时栓塞对侧前肢无法伸展；2分：行走过程中向栓塞对侧发生旋转；3分：行走过程中向栓塞对侧发生倾倒；4分：无法自发行走，完全丧失意识。其中评分1~3分且取脑过程中未见蛛网膜下腔出血者为造模成功，用于后续实验检测；将0分和4分及蛛网膜下腔出血小鼠剔除。

1.5 脑梗死面积测定

脑缺血1.5 h再灌注24 h后麻醉小鼠，眼球取血后颈椎脱臼处死，断头取脑，-80 ℃速冻30 min，剃除小脑，从额极向枕极切厚度为2 mm的冠状切片5片，置于2% TTC染液中，37 ℃水浴中避光染色30 min后观察脑组织染色情况，正常组织染色为红色，梗死组织未染色（白色）。4%多聚甲醛固定24 h后拍照并用ImageJ软件分析脑梗死面积百分比，计算公式：梗死面积比=各脑切片梗死面积和/各脑切片总面积和×100%

1.6 脑组织切片HE染色

脑缺血1.5 h再灌注24 h后麻醉小鼠，用生理盐水及4%多聚甲醛依次进行心脏灌注后断头取脑，置于4%多聚甲醛中固定48 h后，额极后6 mm处取2 mm厚冠状切片，常规脱水，石蜡包埋切片，HE染色，镜下观察损伤侧大脑皮层病理学变化。

1.7 脑组织切片FJC染色

脑缺血1.5 h再灌注24 h后麻醉小鼠，用生理盐水及4%多聚甲醛依次进行心脏灌注后断头取脑，置于4%多聚甲醛中固定48 h后，在额极后6 mm处取2 mm厚冠状切片，10%、20%、30%蔗糖溶液依次脱水过夜，常规冰冻切片，按试剂盒步骤进行FJC染色，显微镜下观察损伤侧大脑皮层退化神经元数量变化。

1.8 免疫组化染色检测GFAP、GLT-1和GLAST的表达

脑缺血1.5 h再灌注24 h后麻醉小鼠，用生理盐水及4%多聚甲醛依次进行心脏灌注后断头取脑，置于4%多聚甲醛中固定48 h后，额极后6 mm处取2 mm厚冠状切片，常规脱水，石蜡包埋切片，石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复、内源酶阻断、血清封闭、一抗二抗孵育、DAB染色、细胞核复染、脱水封片，显微镜下观察损伤侧大脑皮层GFAP、GLT-1和GLAST的表达。

1.9 Western blotting检测GFAP、GLT-1、GLAST的表达

脑缺血1.5 h再灌注24 h后麻醉小鼠，断头取脑，低温环境下称取皮层脑组织匀浆，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心15 min后分装上清，蛋白定量、变性、上样、电泳、转膜、封闭、洗膜，GFAP、GLT-1、GLAST抗体4 ℃孵育过夜，洗膜，二抗避光孵育2 h，洗膜后曝光显影。

1.10 分光光度法检测Glu含量

于冰上迅速剪取损伤侧皮层脑组织，称重后根据重量和体积1∶9配置成相应的匀浆液，12 000 r/min离心10 min后分装上清，逐步加入样品及工作试剂，记录待测样品质量和各管的吸光值，计算各组脑组织Glu含量。

1.11 统计学分析

采用Graphpad Prism 8软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间差异的比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘦素对小鼠神经功能评分的影响

神经功能评分结果显示：Sham组小鼠表现同正常小鼠，I/R组小鼠出现明显的神经功能障碍，表现为提尾时对侧前肢无法伸展，并向一侧转圈或倾倒（图2A），神经功能评分为2~3分；各剂量Leptin组小鼠神经功能缺损评分较I/R组小鼠有不同程度的改善（图2B）。Leptin-L组神经功能缺损评分与I/R组的差异无统计学意义（P>0.05）；Leptin-M和Leptin-H组与I/R组比较，其神经功能评分明显降低（P<0.0001）。

2.2 小鼠脑梗死面积的变化

TTC染色结果显示，Sham组脑片呈红色，提示未出现缺血梗死灶；而I/R组右侧大脑皮层可见明显的白色梗死灶，Leptin组脑梗死灶与I/R相比有不同程度的缩小（图3A）。Leptin-L组梗死面积与I/R组的差异无统计学意义（P>0.05），Leptin-M和Leptin-H组与I/R组比较，梗死面积明显降低（P<0.001，P<0.0001，图3B）。

2.3 小鼠皮层脑组织的病理改变

HE染色结果显示，Sham组小鼠皮层脑组织未见病理改变，组织排列紧密，神经细胞排列整齐、数量正常、胞体饱满、形态分布正常、核仁清晰、间质无水肿表现；I/R组可见明显病理损伤，神经细胞排列疏松紊乱、数量减少、细胞核固缩严重、形态异常、间质可见明显水肿、空泡化改变；Leptin-L组较I/R组未见明显改善；而Leptin-M和Leptin-H组神经细胞可见轻微皱缩、核仁可见、细胞排列整齐、间质仅有少量水肿和空泡化改变，与I/R组比较有明显改善（图4）。

2.4 小鼠脑组织退化神经元的改变

FJC染色镜下结果显示，Sham组未见明显的退化神经元阳性细胞；而I/R组可见大量清晰的退化神经元阳性细胞，细胞呈绿色并可见退化神经元阳性细胞的胞体和突起（图5A）；Leptin-L组其退化神经元阳性细胞与I/R组的差异无统计学意义（P>0.05），Leptin-M和Leptin-H组可见其退化神经元阳性细胞数量较I/R组明显减少（P<0.0001，图5B）。

2.5 小鼠皮层脑组织GFAP阳性细胞形态及蛋白表达的变化

正常AST形态呈星形或蜘蛛状，有明显的突起，免疫组化染色GFAP阳性细胞呈棕色。Sham组GFAP阳性细胞胞体形态大小正常，突起少而短，染色较淡，而I/R组缺血区GFAP阳性细胞胞体肿大、增粗、突起粗而长、出现明显的断裂现象；Leptin组GFAP胞体形态基本恢复正常（图6A）。Western blotting结果显示，I/R组GFAP蛋白表达较Sham组可见明显增强（P<0.001），Leptin-L组与I/R组的差异无统计学意义（P>0.05），Leptin-M和Leptin-H组较I/R组GFAP蛋白表达明显降低（P<0.01，图6B、C）。根据以上实验结果，后续谷氨酸转运体的研究选取1 mg/kg 的瘦素浓度。

2.6 小鼠皮层脑组织GLT-1和GLAST阳性表达变化

免疫组织化学结果显示，与Sham组相比，I/R组小鼠损伤侧皮层GLT-1和GLAST阳性细胞表达降低；Leptin组较I/R组相比小鼠损伤侧皮层GLT-1和GLAST阳性细胞表达升高（图7）。

2.7 小鼠皮层脑组织GLT-1、GLAST蛋白表达和Glu含量变化

Western blotting结果显示，与Sham组比较，I/R组损伤侧皮层GLT-1、GLAST蛋白表达降低（P<0.0001、P<0.001），Leptin组较I/R组损伤侧皮层GLT-1、GLAST蛋白表达升高（P<0.001、P<0.05，图8A~C）；Glu含量检测结果显示，与Sham组比较，I/R组损伤侧皮层谷氨酸含量明显升高（P<0.001），Leptin组较I/R组比较损伤侧皮层Glu含量明显降低（P<0.01，图8D）。

3 讨论

本研究通过建立小鼠右侧局灶I/R模型，分别从神经功能评分、脑梗死面积、组织病理学改变及神经元退化程度等方面，评估外源性瘦素的神经保护作用。结果发现，外源性瘦素可减轻小鼠神经功能缺损评分，降低脑梗死面积，改善脑组织的病理变化，减轻损伤后退化神经元的阳性细胞数，从而在缺血性脑损伤中发挥一定的神经保护作用，这与既往研究^［16-18］结论一致。尽管瘦素的神经保护作用已经得到初步证实，但对其神经保护的作用内在机制仍有待进一步研究。

AST作为中枢神经系统的重要组成部分，在缺血性脑卒中后的神经保护、炎症、胶质瘢痕形成和神经元存活等一系列病理改变中发挥着重要作用。同时，转运突触间隙多余的Glu亦是AST的重要生理功能之一。激活后的AST称为反应性星形胶质细胞增生^［20］，是包括脑缺血在内的多种神经系统疾病的病理标志^［21］。研究表明，中枢神经系统损伤后，反应性星形胶质细胞增生可造成AST功能减弱或丧失，进而导致Glu摄取障碍而引起兴奋性神经毒性^［22］。GFAP是AST的特征性蛋白和其活化的标志物，GFAP活性的改变在一定程度上可反映缺血后AST的损伤程度和脑梗死后病变的严重程度^［23］。脑缺血发生时，AST胞体增大，突起增多、增粗、延长^［24］，GFAP表达增加，摄取Glu能力下降，从而引起突触间隙Glu大量蓄积，产生兴奋性神经毒性损伤^［25］。而瘦素作为一种中枢性的能量调节因子，目前对于其在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用及其内在机制，尤其是对大脑皮层AST的Glu摄取功能的影响还知之甚少。为了探究瘦素对CIRI中神经元损伤变化的影响，实验中我们对皮层退化神经元进行了FJC染色。结果显示，经瘦素处理后退化神经元阳性细胞数量明显减少，提示瘦素对神经元具有重要的保护作用。为了进一步探究外源性瘦素对CIRI小鼠皮层AST的影响，本研究同时检测了其特征性蛋白GFAP的表达，结果表明，I/R组小鼠GFAP阳性细胞出现胞体肥大、细胞肿胀，突起增多、增粗，并有明显的断裂现象，通过Western blotting进一步验证发现，I/R组GFAP蛋白的表达明显升高，经外源性瘦素处理后GFAP阳性细胞形态基本恢复正常，GFAP蛋白表达降低，提示瘦素对AST形态的变化和过度增殖亦具有重要的保护作用。据此，我们推测AST胞体的形态变化和过度增殖可能会引起其Glu摄取功能减弱或丧失，导致细胞外Glu大量堆积。

Glu是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，在多种脑功能的维持中起中心作用。EAATs终止Glu神经传递是维持细胞外Glu低浓度和避免其产生兴奋性神经毒性的必要条件。表达在AST上的GLT-1和GLAST是中枢神经系统中最主要的Glu转运体，两者负责脑内突触间隙约90%以上Glu的摄取^［26］。因此，GLT-1和GLAST在脑内Glu转运调控中起关键作用，其功能障碍与创伤性脑损伤、脑中风、阿尔茨海默病等多种病理过程密切相关，其表达增加或功能增强可能作为这些疾病治疗的潜在靶点^［27］。研究发现，脑缺血时，EAATs可能在功能上发生逆转或表达降低，导致其摄取Glu的功能受损甚至反向释放Glu，引起EAATs介导的Glu稳态失衡，进而引Glu兴奋性神经毒性及神经元死亡^{［28， 29］}。另外，在CIRI情况下，GLT-1和GLAST的表达下调可能与皮层的急性神经元损伤有关^［30］，而GLT-1基因的功能障碍或敲除可导致细胞外Glu水平升高、神经元延迟死亡和梗死面积显著增加^［31］。因此，GLT-1和GLAST的表达和功能变化对Glu的兴奋性神经毒性的产生具有重要作用。但在现阶段关于CIRI的研究，尤其是针对EAATs功能变化的相关研究仍然较少。因此，深入研究Glu的兴奋性毒性及EAATs在脑缺血再灌注病理损伤的内在机制，寻找外源性神经保护因子至关重要。本研究通过免疫组织化学和Western blotting检测了GLT-1和GLAST的表达，结果显示，I/R组GLT-1和GLAST阳性细胞表达和蛋白表达较Sham组明显降低，同时检测的各组小鼠损伤侧皮层Glu浓度变化的结果显示I/R组Glu浓度明显升高，这可能是由于脑缺血再灌注后GLT-1和GLAST转运突触间隙Glu的能力降低，导致Glu在突触间隙积聚，过度激活突触后膜谷氨酸受体，从而导致谷氨酸兴奋性神经毒性损伤。

既往研究发现，在AST瘦素受体特异性缺乏小鼠模型中，瘦素受体参与了海马中的Glu代谢、神经传递和可塑性变化^［32］。但对于外源性瘦素对小鼠CIRI皮层谷氨酸兴奋性毒性的影响研究未见报道。有研究发现，脑缺血损伤后体内瘦素水平会随着再灌注时间的增加而显著降低，而外源性瘦素可以补充内源性瘦素的不足，并通过P13K/Akt途径促进能量代谢来减轻脑缺血损伤^［33］。因此，本研究通过给予CIRI小鼠外源性瘦素，发现其皮层AST的GLT-1和GLAST阳性细胞表达增多、蛋白表达升高，Glu含量下降，提示瘦素可能是通过提高GLT-1和GLAST的表达，促进其对突触间隙Glu的摄取转运，进而减弱了兴奋性神经毒性损伤，发挥神经保护作用。

综上所述，外源性瘦素对于维持AST正常形态和减轻其过度表达发挥了重要作用。通过本实验研究首次证实了外源性瘦素的神经保护作用的内在机制可能是通过上调AST的谷氨酸转运体（GLT-1、GLAST）的表达，增强其转运Glu的能力，在一定程度上降低了突触间隙的Glu含量，从而减轻Glu兴奋性神经毒性损伤，具有明显的保护缺血再灌注后神经损伤的作用。本实验研究的结果表明瘦素可能作为一种有效的神经因子在CIRI中发挥一定的神经保护作用，而AST可能作为瘦素保护缺血性神经细胞损伤的有效靶点之一。因此，对AST在神经血管单元中的作用和功能、以及AST上EAATs的研究将为寻找脑缺血早期保护神经功能及增加其缺血耐受的有效方法提供新思路。

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基金资助

安徽省教育厅自然科学重点研究项目(KJ2021A0696)

安徽省教育厅自然科学重点研究项目(2022AH051456)

蚌埠医学院“512人才培育计划”(by51202204)

安徽省教育厅自然科学重大研究项目(KJ2021ZD0091)

安徽省研究生创新创业实践项目(2022cxcysj169)

蚌埠医学院研究生科研创新计划项目(Byycx22008)

国家级大学生创新项目(202210367060)

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