炎性微环境牙周膜成纤维细胞整合素α5对NLRP3表达的影响

摘要

目的 探讨炎性微环境牙周膜成纤维细胞（periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）整合素α5(integrinα5)对NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)表达的影响。方法 获得单位实验动物伦理委员会的批准，以脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）(0.5、5、50μg/mL)预处理大鼠PDLFs 24 h后更换为无血清DMEM培养基，24 h后收集上清液分别与含10%无外泌体血清的DMEM培养基按体积比1∶1混合获得条件培养基（conditioned medium,CM），记作0.5-CM、5-CM、50-CM，另将含10%无外泌体血清的DMEM培养基记作0-CM。CM组以上述各浓度的CM培养PDLFs；抑制剂组以含有不同浓度整合素α5抑制剂ATN-161(0、0.025、0.25、2.5、25、250μg/mL)的0-CM培养PDLFs;CCK-8法检测上述各组CM和整合素α5抑制剂ATN-161对细胞活性的影响。根据CCK-8结果，在进一步的抑制剂干预实验中，将PDLFs培养于0-CM、不含/含25μg/mL ATN-161的5-CM及含25μg/mL ATN-161的0-CM中，依次为0-CM组、5-CM组、ATN-161+5-CM组及ATN-161组。利用Western blot及qRT-PCR检测整合素α5和NLRP3表达变化。体内实验将24只大鼠随机分为4组（n=6），对照组为健康大鼠，不做任何处理，其余3组大鼠每3天于大鼠左上颌第一磨牙腭侧分别注射40μL的含25μg/mL ATN-161的0-CM或5-CM（不含/含25μg/mL ATN-161），记作ATN-161组、5-CM组和ATN-161+5-CM组。第30天取大鼠左上颌骨组织行Micro-CT、HE染色及免疫组化检测。结果 CCK-8检测显示，12 h、24 h时各组CM和25μg/mL及以下浓度的ATN-161对细胞活性抑制无显著差异（P> 0.05）;48 h时50-CM和25、250μg/mL ATN-161均显著抑制细胞活性（P <0.05）。在体外实验，相较于0-CM组，5-CM组大鼠PDLFs中整合素α5和NLRP3在蛋白和mRNA水平表达均显著升高（P <0.05）;25μg/mL ATN-161干预显著抑制5-CM培养条件下整合素α5和NLRP3的表达（P <0.05）。在体内实验，与对照组相比，5-CM组和ATN-161+5-CM组牙槽骨吸收明显，牙周膜炎性细胞浸润增多，整合素α5和NLRP3阳性表达显著增加（P <0.01）。但ATN-161+5-CM组较5-CM组牙槽骨吸收较轻，牙周膜炎性细胞浸润较少，整合素α5和NLRP3阳性表达明显降低（P <0.01）。结论 体内外实验表明整合素α5介导炎性微环境下PDLFs的NLRP3表达，ATN-161抑制整合素α5表达从而显著下调NLRP3表达，发挥抑制炎症作用。

关键词

牙周炎 / 整合素α5 / 整合素α5抑制剂 / 牙周膜成纤维细胞 / 旁分泌 / 免疫反应 / 炎性微环境 / NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 / 条件培养基

基金资助

海南省自然科学基金（822CXTD534）; 海南省重点研发计划项目（ZDYF2021SHFZ229）