两种代谢法荧光标记牙龈卟啉单胞菌及其在活体成像中的效果比较

摘要

目的 探讨两种代谢法荧光探针对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）的影响，并比较两种荧光探针标记的Pg在小动物活体成像中的应用效果。方法 本研究通过单位伦理委员会审查及单位实验生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准。Pg通过生物正交反应整合四酰化N-叠氮基乙酰半乳糖胺（N-azidoacetylgalactosamine,Ac₄GalNAz），再通过点击化学反应实现了Cy5-二苯并环辛炔（Cy5-Dibenzocyclooctyne,Cy5-DBCO）、Cy7-DBCO标记。根据细菌不同标记状态进行分组：Pg组（对照，未经荧光标记的Pg）、Cy5-Pg组（Cy5-DBCO标记的Pg）、Cy7-Pg组（Cy7-DBCO标记的Pg）。细菌活死染色试剂盒检测Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg的活性；Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg分别刺激人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblast,HGF）后检测HGF白介素-6（interleukin-6,IL-6）、IL-8的mRNA水平和HGF增殖能力；与大肠杆菌（Escherichia coli,E. coli）共培养检测荧光标记的Pg的稳定性；用小动物活体成像系统（in vivo imaging system,IVIS）检测系列浓度梯度的Cy5-Pg、Cy7-Pg的荧光强度。最后，将Cy5-Pg、Cy7-Pg分别经口灌饲给C57BL/6J小鼠，IVIS分别检测Cy5或Cy7信号强度，计算信噪比。结果 代谢法可以被应用于活的Pg的荧光标记，Cy5、Cy7标记Pg的最佳浓度分别为20μmol/L、30μmol/L。Pg、Cy5-Pg、Cy7-Pg中活死细菌所占面积比值分别为1.86、1.85、1.88（F=0.318,P>0.05）。Cy5-Pg、Cy7-Pg、Pg刺激HGF 6 h后，HGF的IL-6、IL-8 mRNA水平分别比Ctrl组（无细菌刺激组）升高了7.86、7.46、6.56倍（IL-6,F=40.886,P<0.001）和12.43、13.03、13.71倍（IL-8,F=18.781,P<0.01）,3个实验组间无明显差异（P>0.05）。Cy5-Pg、Cy7-Pg、Pg以不同MOI（multiplicity of infection）刺激HGF，与Ctrl组（无细菌刺激组）相比，HGF的增殖能力均显著下降（MOI=10～4∶1,F=153.52,P<0.001;MOI=10～5∶1,F=331.21,P<0.001;MOI=10～6∶1,F=533.65,P<0.001）,3个实验组间差异无统计学意义（P>0.05）。Cy5-Pg或Cy7-Pg与E. coli共培养的24 h内，仅有非常少的E. coli被标记上荧光，且3 h内荧光强度几乎无衰减。Cy5-Pg、Cy7-Pg的荧光强度与浓度呈正线性相关（R²=0.97）。Cy5-Pg或Cy7-Pg灌饲至小鼠体内后，在1 h、3 h时，Cy7-Pg在小鼠腹部成像的信噪比分别为Cy5-Pg的4.24倍（t=6.893,P<0.01）、3.77倍（t=4.407,P<0.05）;Cy7-Pg在分离出的胃肠道内成像的信噪比为Cy5-Pg的5.19倍（t=4.418,P<0.05）。结论 代谢法荧光标记不影响Pg的活性、免疫调节能力和毒性。在小动物活体成像中Cy7具有比Cy5更好的成像效果，为研究牙周炎和全身疾病的联系提供了实验基础。

关键词

牙龈卟啉单胞菌 / Cy5 / Cy7 / 代谢法标记 / 点击化学反应 / C57BL/6J小鼠 / 小动物 / 活体成像 / 牙周炎 / 口-肠轴